慢病毒实验方法
慢病毒使用操作指南
慢使用操作指南慢使用操作指南1.慢简介1.1 定义：慢是一种特殊的，能够在细胞中长期存活并进行复制。
1.2 用途：慢广泛应用于基因转导、基因敲除和基因表达等实验研究中。
2.慢使用前准备工作2.1 实验室准备工作2.1.1 实验室空间准备：确保实验室内有足够的操作空间和合适的消毒设备。
2.1.2 材料准备：准备好所需的培养基、细胞培养物、慢载体等。
2.1.3 设备准备：确保离心机、冰箱等设备正常工作，并准备好相关的仪器和器材。
2.2 人员准备工作2.2.1 人员培训：对参与慢操作的人员进行培训，了解操作步骤和安全风险。
2.2.2 个人防护：提供必要的防护装备，如实验服、手套、面罩等。
3.慢操作步骤3.1 细胞培养3.1.1 细胞培养物准备：根据实验需求选择合适的细胞培养物，并进行细胞的预处理和培养。
3.1.2 细胞密度调整：根据实验要求，调整细胞培养物的密度，以保证细胞的正常生长。
3.2 慢感染3.2.1 慢载体注射：将慢载体注射到培养好的细胞中。
3.2.2 感染条件控制：根据实验需求，控制慢感染的时间、浓度和温度等条件。
3.3 细胞培养和检测3.3.1 细胞培养：将感染好的细胞进行培养，并观察细胞的生长状态。
3.3.2 细胞检测：使用相关实验方法，对感染细胞进行检测和分析。
4.实验安全措施4.1 操作环境控制：确保实验室内通风良好，避免慢的扩散和污染。
4.2 废液处理：将产生的废液经过正确处理，避免对环境和人体造成污染和伤害。
4.3 事故应急处理：在发生事故或意外情况时，立即采取应急措施，并及时报告相关人员。
5.附件本文档所涉及的附件，包括但不限于实验记录表格、实验数据文件等。
6.法律名词及注释6.1 慢：指一种具有长周期和潜伏期的。
7.结束语感谢您阅读本文档，如有任何疑问或意见，请随时与我们联系。
慢病毒感染细胞实验原理及步骤
慢病毒感染细胞实验原理及步骤1. 实验原理慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。
在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果。
对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA的长期、稳定表达。
所以，在体外实验及体内实验的研究中，慢病毒己经成为表达外源基因或外源shRNA的常用载体形式之一，并且正在获得越来越广泛的应用。
2. 主要材料细胞培养基、胰蛋白酶、胎牛血清、PBS、青霉素-链霉素溶液、慢病毒、Polybrene助转染试剂3. 主要试剂配制（1）PBS磷酸盐缓冲液：PBS粉剂每袋加ddH2O定容至1000mL，调pH7.2，121℃，30min，高压灭菌，4℃保存备用。
（2）细胞生长培养液：临用前根据需要在培养基中加入10%胎牛血清，再按1%体积分数加入双抗贮存液(青霉素+链霉素)，使青霉素和链霉素的终浓度分别为100 U/mL和100 ug/mL，置于4℃冰箱保存。
4. 实验步骤（1）胰酶消化细胞，无血清培养基重悬，调整细胞密度为0.5~1×105/ml（根据情况酌情调整），每孔200ul细胞悬液接种至24孔板，培养箱培养过夜。
次日进行慢病毒感染，此时细胞的融合度约为70%左右。
（2）准备病毒：取出4℃保存的病毒，使用瞬时离心机离心20秒（使病毒完全悬于离心管底部即可）；如果是冻存在-80℃的病毒需要先在冰上融化后使用。
根据实验按照MOI准确计算慢病毒用量，将其稀释到培养基中，并尽可能保证所获得的含有慢病毒的培养基的总体积为最小体积，以期获得最佳的感染效率。
慢病毒感染细胞 操作手册
慢病毒感染细胞实验方法一、实验概述培养生长状态良好的目的细胞，根据慢病毒感染预实验结果设计各组实验条件，进行正式感染。
若为荧光标记的慢病毒感染，参照预实验确定的感染时间点，于荧光显微镜下观察GFP表达情况，荧光率达70-80％左右，细胞汇合度达80%左右，收集细胞进入下游实验。
若为抗性基因（如Puromycin）标记的慢病毒感染，感染48 h-72h后，使用抗生素筛选48h，收集细胞汇合度70%-80%左右的生长状态良好的细胞进行下游实验。
二、实验材料1.主要试剂试剂名称试剂来源cat.No.胎牛血清Ausbian VS500TDMEM Corning 10-013-CVR胰酶生工生物工程（上海）股份有限公司T0458-50G Puromycin Clontech 631305D-Hanks 上海吉凯基因技术有限公司配制2.主要仪器仪器名称仪器来源cat.No.荧光显微镜奥林帕斯IX71CO2培养箱日本三洋SANYO MCO-175倒置显微镜上海蔡康光学仪器有限公司XDS-100离心机赛默飞世尔科技(中国)有限公司Fresco 21生物安全柜上海振样创空气净化设备有限公司Bio 1200-Ⅱ-A2三、实验步骤1．准备目的细胞（1）从液氮罐中取出细胞冻存管，迅速放入37℃水浴中，并不时摇动使其尽快解冻。
（2）完全解冻后，1300 rpm，离心3 min，75%酒精擦拭冻存管消毒后，移至生物安全柜。
（3）吸去冻存液上清，加入1 mL新鲜的完全培养基重悬细胞，将细胞悬液接种至含有3 mL完全培养基的6-cm dish 中，轻轻晃匀后置于37℃、5% CO2培养箱。
（4）24 h后更换一次培养液继续培养，待细胞汇合度达80%左右传代培养，保持细胞良好的生长状态。
2．目的细胞慢病毒感染（1）贴壁细胞：a.处于对数生长期的细胞胰酶消化，完全培养基制成3-5×104个/mL细胞悬液，并根据表1接种相应的细胞数到培养板中，继续培养保证感染时铺板量达到15-30%左右。
慢病毒转染实验流程
慢病毒转染实验流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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1. 病毒液与靶细胞准备。
将慢病毒液从-80℃冰箱中取出，置于冰上融化。
慢病毒纯化
慢病毒纯化
慢病毒纯化是指从慢病毒病毒培养物中分离和纯化出慢病毒颗粒的过程。
这个过程通常包括以下步骤：
1.细胞培养：首先，需要将慢病毒所感染的细胞系培养到适
当的细胞密度和病毒扩增时间，以确保足够的病毒产量。
2.细胞裂解：将培养的细胞收集并经过离心等方法分离，然
后使用裂解缓冲液裂解细胞，释放出细胞内的慢病毒。
3.离心和过滤：经过细胞裂解后，样品需要进行离心，以去
除细胞碎片和核酸残余物。
然后，可以使用过滤器对澄清
的上清液进行过滤以去除大颗粒物质。
4.病毒浓缩：慢病毒通常是低浓度的，因此需要进行浓缩。
可以使用超滤、离心和沉淀等方法，将病毒颗粒从大量液
体中浓缩到较小的容量中。
5.梯度离心：为了进一步纯化病毒，可以使用梯度离心技术，
如葡聚糖梯度离心或离心浓缩。
这个过程可将纯化的病毒
与细胞碎片、蛋白质和其他污染物分离开来。
6.病毒沉淀：经过梯度离心后，可以进行病毒的最终沉淀。
使用离心来将病毒沉淀到盘底或在离心管底端形成浓缩的
沉淀。
7.再悬浮：将病毒沉淀用缓冲液再悬浮，以便进行后续实验
应用。
在整个慢病毒纯化的过程中，必须遵守基本的生物安全措施，
并使用无菌操作、合适的缓冲液和处理设备。
每一步之间的温度、离心速度和离心时间等参数也需要根据具体的实验条件和病毒类型进行优化和调整。
慢病毒转染细胞的操作具体方法及步骤
慢病毒转染细胞的操作步骤
一、慢病毒转染贴壁细胞实验方法
1、慢病毒转染前18-24小时，将贴壁细胞以1×10^5/孔铺到24孔板中。
使细胞在慢病毒转染时的数量为2×10^5/孔左右。
2、第二天，用含有6 μg/ml polybrene的2ml新鲜培养基替换原培养基，加入适量病毒悬液。
37℃孵育。
3、(对polybrene毒性敏感的细胞选作此步骤)4小时后加入2ml 新鲜培养基以稀释polybrene。
4、继续培养24小时，用新鲜培养基替换含有病毒的培养基。
5、继续培养。
如果慢病毒含有荧光蛋白，一般转染48小时后可见明显荧光表达，72小时后更加明显。
如需FACS检测转染效率，可在转染后72-96小时进行。
如果慢病毒含有抗性基因并且需要加药筛选，可以在转染3-4天后开始加药。
二、慢病毒转染悬浮细胞实验方法
1、在2×10^5/ml悬浮细胞中加入polybrene至6 μg/ml和适量病毒，充分混匀。
37℃孵育。
或者150g室温离心4小时(选作，部分难转染的细胞系采用此步骤可以提高转染效率)。
2、(对polybrene毒性敏感的细胞选作此步骤)4小时后(或离心结束后)加入等体积新鲜培养基以稀释polybrene。
3、继续培养3-4天。
中间视细胞生长情况可传代或换液。
慢病毒使用操作指南
慢病毒使用操作指南慢病毒是一种常用的实验工具，广泛应用于细胞和分子生物学研究。
本文档旨在提供慢病毒使用的操作指南，帮助研究人员更好地利用慢病毒进行实验研究。
第一部分：慢病毒基本知识1. 什么是慢病毒？慢病毒是一种具有RNA基因组的病毒，属于反转录病毒。
它能够将自身的RNA基因组逆转录成DNA，再与宿主细胞的基因组融合，长期稳定地存在于宿主细胞中。
2. 利用慢病毒进行基因转染的优势相比其他常用的基因转染方法，慢病毒具有以下优势：- 高效性：慢病毒能够高效地转染多种类型的细胞，包括非分裂细胞。
- 长期稳定性：慢病毒转染的基因能够长期稳定地存在于宿主细胞中。
- 遗传稳定性：慢病毒转染的基因可以遗传给后代细胞，因此适用于长期实验研究。
第二部分：慢病毒使用的关键步骤1. 选择合适的慢病毒载体慢病毒载体是慢病毒的基础构建单元，其中包含转录启动子、报告基因等必要的元件。
根据实验需要选择合适的载体。
2. 包装慢病毒慢病毒的包装是将慢病毒载体与包装载体共转染至特定细胞株，通过包装载体中的包装酶，将慢病毒的RNA基因组逆转录成DNA，形成可复制的慢病毒。
3. 提取慢病毒经包装后的细胞培养基中含有包装好的慢病毒。
可通过超速离心等方法，将细胞培养物离心，提取慢病毒。
4. 病毒滴定病毒滴定是用来确定病毒滴度的重要步骤。
通过适当稀释提取的慢病毒，将其感染指定细胞株，计算出感染单位的浓度。
5. 慢病毒感染及筛选将提取的慢病毒添加至目标细胞中，通过细胞培养和筛选，筛选出具有所需基因的细胞株。
第三部分：慢病毒使用的注意事项1. 安全操作慢病毒具有一定的传染性，进行实验时需要遵守生物安全操作规范，佩戴一次性手套、口罩等个人防护装备，避免直接接触慢病毒。
2. 避免交叉感染实验室中使用慢病毒时，应尽可能避免交叉感染。
定期对实验室环境进行消毒，使用一次性材料，避免共享器械等措施可以减少交叉感染的风险。
3. 合理控制病毒滴度对于不同类型的细胞，需要确定合适的病毒滴度，以避免过度感染或感染不足的情况。
慢病毒载体构建 Protocol
慢病毒载体构建是一种用于基因治疗和基因转导的重要工具，其用于将外源基因或shRNA等插入到慢病毒载体中，从而实现对特定基因的表达调控。
下面是慢病毒载体构建所需试剂和耗材、实验仪器、准备工作、实验方法、注意事项、常见问题及解决方法。
一、所需试剂和耗材1.慢病毒载体：用于包装目的基因的包装细胞系，如HepG2.2.15等。
2.目的基因或shRNA：需要插入慢病毒载体的DNA或RNA片段。
3.质粒DNA：用于构建慢病毒载体，包括表达盒质粒和包装质粒等。
4.DNA聚合酶：用于DNA扩增和连接。
5.限制性内切酶：用于DNA切割。
6.DNA连接酶：用于DNA连接。
7.缓冲液：维持反应液的pH值和其他辅助因子的浓度。
8.dNTPs（脱氧核糖核苷三磷酸）：DNA合成的原材料，包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP。
9.细胞培养基：用于细胞培养。
10.胎牛血清：提供细胞生长所需的营养物质。
11.抗生素：用于防止细胞污染。
12.其他细胞生物学试剂：如胰蛋白酶、无血清培养基等。
二、实验仪器1.实验室搅拌器：用于混合和振荡反应液。
2.离心机：用于离心管和细胞培养瓶等。
3.水浴锅：用于保温反应液。
4.移液器：用于精确添加试剂和溶液。
5.细胞培养箱：用于细胞培养。
6.倒置显微镜：观察细胞生长状态和感染情况。
7.紫外线分光光度计：用于测量DNA浓度。
8.电泳仪和电泳槽：用于分析DNA样品。
9.定量PCR仪：用于定量分析目的基因的转导效率。
三、准备工作1.了解慢病毒载体构建的基本原理和步骤。
2.设计并合成目的基因或shRNA序列，并确认其正确性。
3.准备所有所需的试剂和耗材，并确保它们处于保质期内。
4.检查实验室内是否具备上述实验仪器，并确保其正常运行。
5.准备好实验服、口罩、手套等个人防护用品。
6.用70%乙醇擦拭实验台面，以确保无菌环境。
7.用高压蒸汽灭菌法灭菌所有的实验器具，包括离心管、移液器等。
8.设置细胞培养箱的温度和湿度等参数。
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慢病毒包装、浓缩纯化及滴度测定一、试剂、耗材及仪器1.1试剂1.1.1 商品化试剂及试剂盒名称厂家货号Lenti-X 293T Cell Line clontech632180 DMEM Gibco C11995500BTFetal Bovine Serum, Qualified, Australia Origin LifeTechnologies10099-141Lipofectamine™LTX & Plus Reagent invitrogen15338 QIAGEN Plasmid Midi Kit (25)QIAGEN121431.1.2 试剂配制a. 氨苄青霉素储液称取氨苄青霉素10g，加8ml 超纯水，溶解，定容至10 ml，过滤除菌，分装，-20℃保存。
b. LB液体培养基实用文档称取蛋白胨（tryptone）10g、酵母提取物（yeast extract）5g、NaCl 10 g，加800 ml 超纯水，用10M NaOH调节pH至7.0，定容至1, 000 ml，分装，高压灭菌(121℃/20min)，4℃保存。
c. 完全培养基把DEME培养基与血清按照9:1(V/V)进行混合。
d. 50%PEG6000溶液称取125gPEG6000用超纯水溶解，定容到250ml，分装，高压灭菌(121℃/20min)，4℃保存。
e. 4M NaCl溶液称取46.752gNaCl，加超纯水溶解，定容到200ml，分装，高压灭菌(121℃/20min)，4℃保存。
f. PBS缓冲液称取8gNaCl，0.2gKCl，3.58gNa2HPO4.12H2O，0.27gKH2PO4，加800 ml 超纯水，调节pH至7.4，定容至1, 000 ml，分装，高压灭菌(121℃/20min)，4℃保存。
实用文档1.2 耗材名称厂家货号25cm2 Growth Area Flasks corning430639 75cm2细胞培养瓶corning430641 TC表面细胞培养皿，规格：35mm corning430165 TC表面细胞培养皿，规格：60mm corning430196 TC表面细胞培养皿，规格：100mm corning430293 6孔细胞培养板corning3516外旋盖冻存管corning430659 15ml尖底离心管corning430790 50ml尖底离心管corning4558 3毫升吸管Biologix30-0138A1 1.3 仪器名称仪器厂家仪器型号二氧化碳培养箱Thermo371生物安全柜Thermo Forma Class II，B2倒置荧光显微镜OLYMPUS IX71实用文档台式高速冷冻离心机Thermo LEGND MACH 1.6R小型高速离心机Thermo LEGEND MICRO 17小型冷冻高速离心机Thermo LEGEND MICRO 17R超低温冰箱SANYO MDF-U73V冰箱Haier BCD-290W二、方法2.1．包装细胞准备2.1.1.细胞复苏a. 把完全培养基预热至37℃；用清洗洁净的500ml烧杯盛300ml超纯水，然后放入37℃水浴锅中，预热至37℃（至少需30min）；准备好生物安全柜及所需培养耗材（灭菌处理）；b. 快速从液氮罐中取出装有冻存细胞的冻存管并放置于装有液氮的保温杯中，用洁净镊子取出冻存管，并立即放入上述准备好的水浴中（放入之前快速检查盖子是否拧紧，盖子切勿没入水中），用镊子镊好冻存管，快速沿着烧杯内壁转圈，细胞未冻融时切勿取出观察，细胞冻融时间一般为1-2 min，如果超过2 min仍未冻融，应掉弃该管细胞，细胞冻融后把冻存管放入70%酒精中3s，然后立即放入生物安全柜中；实用文档c. 把冻融的细胞立即转移至装有1ml预热完全培养基的15ml离心管中，混匀，立即加入4ml预热完全培养基，混匀；d. 加入5ml预热完全培养基，混匀，离心（100 g，5 min），小心移除上清；e. 加入6 ml预热完全培养基，吹打重悬细胞，然后把细胞悬液转移至T25培养瓶中，并放入二氧化碳培养箱（5% CO2, 37℃）中培养；f. 24小时观察细胞的贴壁情况，并根据细胞的密度进行换液或细胞传代；2.1.2细胞培养a. 当细胞达到80%融合时，移培养液，用PBS洗涤两次，加入1ml胰酶消化液，把培养皿置于倒置显微镜下观察，如大部分细胞变圆，立即移除胰酶消化液（如大部分细胞飘起，可不移除胰酶消化液），加入6ml 预热DMEM完全完全培养基，用吸管取培养液吹打瓶壁细胞，使其脱离瓶壁形成单细胞悬液，离心（100 g，5 min），小心移除上清，加入10ml预热完全培养基，吹打重悬细胞用细胞计数板在显微镜下计算细胞数，取1*106细胞分装入新T75培养瓶，添加基至总体积为20ml，置于37 ℃、5 %CO2 培养箱中培养；每隔2～3天传代1次，实验用第2～3代细胞。
2.1.3细胞保种实用文档a. 冻存液：10％DMSO，用血清来配制冻存液。
b. 收取细胞：离当细胞达到80%融合时，换新的完全培养基，第二天，移培养液，用PBS洗涤两次，加入2ml胰酶消化液（T75培养瓶），把培养皿置于倒置显微镜下观察，如大部分细胞变圆，立即移除胰酶消化液（如大部分细胞飘起，可不移除胰酶消化液），加入12ml 预热DMEM完全完全培养基，用吸管取培养液吹打瓶壁细胞，使其脱离瓶壁形成单细胞悬液，离心（100 g，5 min），小心移除上清；c. 加入冻存液混匀，分装至2ml冻存管中，密封后应标记冷冻细胞名称和冷冻日期，然后放入梯度降温盒，置于-80℃过夜，次晨置于液氮罐中保存。
2.2. 质粒中量提取按照QIAGEN-Plasmid-Purification-Handbook--April-2012进行，简要中文说明下：a.收集菌液30ml 4度离心6000 g，15min，彻底弃去上清，加入4ml Buffer P1，重悬菌体沉淀。
b.加入4ml Buffer P2温和地混匀（如果混匀充分，则溶液变蓝）。
室温放置5min。
c.加入4ml Buffer P3立即温和地混匀（如果混匀充分，则溶液变成无色）, 冰上放置15min,20000 g，4度离心30 min。
实用文档d.将上清转移到一新的50ml离心管中，20000 g4度离心15 min。
e.在QIAGEN-tip中加入4ml的Buffer QBT，自然过滤。
f.将4步所得上清液加入QIAGEN-tip中，自然过滤。
g.在QIAGEN-tip中加入2X10ml的QC Buffer。
自然过滤。
h.在QIAGEN-tip中加入5ml的QF Buffer，收集滤液。
i.在滤液中加入3.5ml的异丙醇，混匀15000g4度离心30min，去上清。
j.加入2ml70%的乙醇，15000g4度离心10min，彻底去上清，室温晾干5-10min。
k.加入80ul的灭菌水溶解沉淀，浓度测定。
2.3 病毒包装按照Lipofectamine™LTX & Plus Reagent (Cat.No.15338,invitrogen)进行，简要中文说明如下：a. 转染前24小时，把4–5 x 106个293T细胞传代至10cm培养皿中，加入完全培养基至终体积10ml，培养过夜，转染时，细胞密度为80–90%；b. 293T细胞转染前2小时换上9ml新鲜的完全培养基；c. 用之前充分混匀PLUS Reagent，在EP管中加入15ug的DNA混合物(pLVX-shRNA Plasmid DNA：pMDLg：pRes-Rev：pCMV-VSV-G 的摩尔比为1：1：1：1)，15ul的PLUS Reagent，用Opti-MEM定容到500ul，标记为Tube 实用文档1，温和混匀，室温孵育5分钟；d. 充分混匀Mix Lipofectamine LTX，在EP管中加入45ul的Mix LipofectamineLTX和455ul的Opti-MEM，标记为Tube 2，温和混匀；e. 将Tube 1的溶液加到Tube 2中，温和混匀，室温孵育5分钟；Tube 1 (Plasmid DNA)Tube 2 (LTX)15ug DNA MIX(pLVX-shRNA Plasmid DNA：455 µl Opti-MEM pMDLg：pRes-Rev：pCMV-VSV-G=1:1:1:1)15 µl PLUS Reagent45 µl Mix Lipofectamine LTX Up to 500µl Opti-MEM500 µl Total Volume500 µl Total Volumef. 将1 ml 转染复合物逐滴加入前一天种好细胞的100mm皿中，边加边摇匀。
g. 将细胞放入置于37 ℃、5 %CO2 培养箱中培养，12小时后换上新鲜的培养基继续培养。
h. 转染后48-72h，收取培养上清，500g离心10min或利用0.45 μm 低蛋白吸附滤膜去除细胞碎片和团聚的病毒；2.4 病毒浓缩纯化a. 把去除细胞碎片和团聚的病毒上清转移至离心管，按照10ml的病毒上清加入实用文档2.5ml的50%PEG6000混合；b. 加入1.064ml的4M的NaCl混匀；c. 加入1.142ml的PBS混匀；d. 4°C下，孵育1.5h，每20-30min颠倒混匀；e. 4°C下，7000g离心10min。
f.小心移除上清，切勿触动白色沉淀，如果白色沉淀出现松动，可以在7000 g下短暂离心；g. 加入原病毒上清1/200 to 1/100 体积的PBS重悬沉淀病毒粒子；h. 立即对浓缩纯化的病毒粒子进行滴度测定，并分装后（50-100ul/管）冻存于-80°C超低温冰箱中；2.5 病毒滴度测定a. 感染前24小时，把1x 105个/孔293细胞传代至96孔板中，加入完全培养基至终体积200ul；b. 把上述重悬的病毒粒子进行10倍梯度稀释，共12个梯度，用含4 μg/ml polybrene的完全培养基进行稀释；实用文档c. 然后把90ul梯度稀释的病毒加入提前接种293细胞的96孔板中，培养液终体积为90ul，感染24小时后移除旧完全培养基，加入200ul完全培养基；d. 48-72小时后进行绿色荧光观察；如果稀释梯度为109的病毒感染细胞，48小时后具有绿色荧光的细胞的个数为4，则细胞浓度为4*109 cfu/ml。
如此类推。
2.6 病毒检测a. 感染前24小时，把细胞传代至35 mm平皿中，加入完全培养基至终体积3ml，培养过夜，感染时，细胞密度为80–90%；b. 把冻存于-80°C的病毒取出并在室温下冻融；c. 用新的完全培养基更换培养液，并加入冻融的病毒粒子（MOI为5-10）和polybrene（4 μg/ml），培养液终体积为3ml；d. 感染8-24h后，用新3-4ml新完全培养基更换感染培养液；e. 感染48小时后收取细胞进行QPCR检测，感染72小时后收取细胞进行WB检测；实用文档。