质粒提取、定量和酶切鉴定
质粒提取及双酶切鉴定内切酶内切重组质粒
纯化质粒
通过吸附、洗涤等步骤进一步 纯化质粒DNA。
02 双酶切鉴定
双酶切鉴定的原理
酶切原理
双酶切鉴定基于限制性内切酶对DNA的特异性切割，通过两种不同的限制性内 切酶对质粒进行切割，产生特定的DNA片段。
产物分析
通过电泳分析切割后的DNA片段，判断是否出现预期的酶切产物，从而确定重 组质粒是否正确。
酶切效率计算
通过比较酶切前后的质粒浓度，可以计算出酶切效率。
重组质粒鉴定
通过对比酶切后的质粒片段和预期的重组质粒片段， 可以初步判断重组质粒是否被成功构建。
序列分析
对重组质粒进行序列分析，可以进一步确认重组质粒 的准确性。
实验结果分析注意事项
确保电泳结果的可信度
01
在分析电泳结果时，应排除假阳性或假阴性的可能，确保结果
筛选与鉴定
通过特定的筛选和鉴定方法，如菌落PCR、酶切分析和电泳检测 等，对重组质粒进行筛选和鉴定。
内切酶内切重组质粒的步骤
酶切反应
将重组质粒与适量的内切酶混合，进行酶切 反应。
胶回收
通过凝胶电泳分离酶切产物，并使用胶回收 试剂盒回收目的片段。
连接反应
将两个不同的DNA片段进行连接，形成新的 重组分子。
质粒提取及双酶切鉴定 内切酶内切重组质粒
目录
CONTENTS
• 质粒提取 • 双酶切鉴定 • 内切酶内切重组质粒 • 实验结果分析
01 质粒提取
质粒提取方法
01
02
03
碱裂解法
利用高pH值环境下质粒 DNA与细胞基因组DNA 的变性差异，将二者分离。
煮沸法
通过加热使细胞破裂，释 放质粒DNA，再通过离心 将质粒DNA与其他细胞成 分分离。
质粒提取定量与酶切鉴定
三、质粒DNA的酶切分析
• 质粒 DNA: ～3 kb
载体: pMD18-T 2.7kb 基因: CHD5 1.4 kb
质粒提取定量与酶切鉴定
限制性内切酶
• 限制酶特异性地结合于一段被称为限制酶识别序列的 特殊DNA序列之内或其附近的特异位点上，并在此切 割双链DNA。
• 分子克隆中常用的为II型限制酶，其识别位点长度为 4～6个核苷酸的反向重复序列。
质粒提取定量与酶切鉴定
琼脂糖凝胶电泳上样
-
1234
+
每组上2个样品
1：DNA Marker（ 5 l ） 2：提取的质粒DNA （ 5 l ） 3：质粒DNA酶切产物 （ 10 l ）
质粒提取定量与酶切鉴定
DNA Marker (ladder)
质粒提取定量与酶切鉴定
组成
Loading Buffer 上样缓冲液
实验流程图
一、碱裂解法提取质粒
二、质粒定量
最后做
三、质粒酶切
四、酶切产物的琼脂糖电泳检测
质粒提取定量与酶切鉴定
实验目的
• 掌握碱裂解法提取质粒的方法 • 掌握紫外吸收测定DNA的方法 • 了解质粒酶切鉴定原理 • 掌握琼脂糖凝胶电泳技术
质粒提取定量与酶切鉴定
实验材料
• 大肠杆菌DH5a菌株 • pMD18-T载体 • 易瑞质粒小量提取试剂盒
• EDTA • 甘油 ……………增大溶液密度 • 溴酚蓝…………指示剂 • 二甲苯胺蓝……指示剂
0.5TBE, 0.5-1.4%浓度的胶中，
迁移率
溴酚蓝=300bp
二甲苯胺蓝=4kbp 质粒提取定量与酶切鉴定
➢染色
✓溴化乙锭(Ethidium Bromide，EB) :3,8-二 氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴盐，能插入DNA 分子碱基对之间并与之结合,在紫外光照射 下呈现红橙荧光,
质粒提取,定量,酶切鉴定实验报告
生物化学实验报告姓名：学号：专业年级： 2018级临床卓越创新班组别：第四实验室生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称质粒DNA的提取、定量与酶切鉴定实验日期2019-11-05 实验地点第四实验室合作者指导老师评分XX 教师签名李某某批改日期2013-06-03一、实验目的1.学习并掌握碱裂解法提取质粒的方法2.掌握紫外吸收测定DNA的操作3.了解质粒酶切鉴定原理和方法4.掌握琼脂糖凝胶电泳技术原理，操作二、实验原理1. 碱裂解法：基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。
1）pH =12.6（碱性），染色体DNA：氢键断裂，变性。
质粒DNA：大部分氢键断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。
（不完全变性）2）（在1）溶液加入KAc溶液调节pH），中性，质粒DNA：复性，继续溶于溶液中染色体DNA：不能复性；形成了、缠连的网状结构。
3）离心后，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来2. 离心层析柱1) 硅基质膜在高盐、低pH值的状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA；2）通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；3）低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱；3. 质粒DNA定量测定：紫外光分光光度计法1）物质在光的照射下会产生对光的吸收效应2）而且物质对光的吸收是具有选择性的3）各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱4）因为组成核酸的碱基(G,A,T,C）在紫外光260nm处具有强吸收峰，所以通过测定260nm的吸收峰即可对DNA进行定量。
5）DNA对波长260nm的紫外光有特异吸收峰，蛋白质在280nm紫外光处有特异吸收峰，A260/A280可以反应DNA纯度。
4.质粒DNA的酶切分析限制酶特异性地结合于一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA序列之内或其附近的特异位点上，并在此切割双链DNA5.琼脂糖凝胶电泳（有电荷效应，分子筛效应）不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动速率就不同，从而分出不同的区带(迁移速度与分子量的对数值成反比关系)。
质粒DNA的提取、酶切及其琼脂糖凝胶电泳实验报告
（2） TAE和TBE均为常用的缓冲液。
TBE比TAE有相对高的缓冲能力。
（3）加样染料溴酚蓝可与长度约为0.5 kb的DNA一起迁移，可用于指示迁移率最高的片段。
（4） DNA的迁移速率取决于以下因素:①DNA的分子大小—分子量越小，迁移越快。
②琼脂糖浓度—浓度越低，迁移越快。
③DNA的构象—环状的或带切口环状的DNA通常比线状的DNA迁移要快。
④两个电极之间单位厘米的电压——电压越高，迁移越快。
（5）如果DNA条带不够窄且不够均匀，可能是内以下原因所引起：①DNA过载②电压过高③加样孔破损④凝胶中有气泡（6）在紫外灯下观察凝胶电泳所得结果应该戴上防护眼镜，因为紫外线对眼睛有伤害作用；二．实验内容1．实验现象与结果：将电泳后的凝胶放在紫外灯的照射下观察到的和用凝胶电泳成像系统进行拍照得到的DNA电泳条带图如下所示意：图注：x’：代表经过酶切的质粒DNA样品的电泳条带；x ：代表未经过酶切的质粒DNA样品的电泳条带（x相同的互为对照组）；marker:DNA相对分子质量标准物。
pUC19质粒DNA标准参照条带图像：2．对实验现象、实验结果的分析及其结论：（1）对实验现象的分析及其结论：从上述所示的DNA电泳条带图可以看出：不管在DNA Sample中还是在经过酶切处理后的DNA样品中均具有电泳迁移速率处于中间的线性质粒DNA。
而在此次试验中出现线性质粒DNA是因为pUc质粒DNA在提取的过程中DNA双链在相对应的两条链上同时产生切口。
这说明质粒制备过程个出现线性DNA说明存在核酸酶污染或实验操作有问题。
可能在其中混有少量的蛋白质（图中，位置在marker组最后一电泳条带后方的很可能就是蛋白质组分），或者在实验的提取过程中加入溶液Ⅱ所经历的时间过长，在碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂，从而使提取的质粒DNA样品混入了基因组 DNA。
但是其中各组也存在超螺旋DNA（与marker组对照，电泳速率最快，跑在最前面的）。
质粒的提取与鉴定实验报告
竭诚为您提供优质文档/双击可除质粒的提取与鉴定实验报告篇一：质粒DnA测定生化实验报告生物化学实验报告姓名：杨晓霞学号：3120XX0025专业年级：20XX级口腔组别：第一实验室生物化学与分子生物学实验教学中心篇二：质粒DnA的提取、纯化与鉴定姓名宿智新学院生命科学学院班级11级生工2班科目分子生物学实验学号20XX00140155第8组质粒DnA的提取、纯化与鉴定摘要：本实验利用碱变法从大肠杆菌Dh5?（e.coliDh5?）中提取puc19质粒，旨在学习并掌握质粒DnA提取的原理、纯化和检测方法及琼脂糖凝胶电泳技术。
同时通过对质粒DnA的提取、纯化过程及电泳图谱的分析，探讨碱变法提取高质量质粒DnA的关键步骤及影响所提质粒纯度和量的相关因子。
关键词：碱变法质粒电泳实验目的：1.学习并掌握凝胶电泳进行DnA的分离纯化的实验原理。
2.学习并掌握凝胶的制备及电泳方法。
3.学习并掌握凝胶中DnA的分离纯化方法。
4.掌握碱变性提取发的原理及各种试剂的作用。
5.掌握碱变性法提取质粒DnA的方法。
实验原理：1.质粒DnA的提取——碱变性提取法：提取和纯化质粒DnA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、eb-氯化铯密度梯度离心法和wizard法等。
其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DnA的提取。
该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。
提取质粒DnA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。
eb-氯化铯密度梯度离心法，主要适合于相对分子质量与染色体DnA相近的质粒，具有纯度高、步骤少、方法稳定，且得到的质粒DnA多为超螺旋构型等优点，但提取成本高，需要超速离心设备。
少量提取质粒DnA还可用沸水浴法、wizard法等，沸水浴法提取的质粒DnA中常含有RnA，但不影响限制性核酸内切酶的消化、亚克隆及连接反应等。
碱变性法提取质粒DnA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DnA。
质粒DNA提取与酶切方法的比较研究
结论总的来说，各种质粒DNA提取方法和酶切方法都有其优缺点。在选择方 法时，应根据具体的研究需求和实验条件进行选择。常规提取方法虽然操作繁琐， 但成本低廉且产量高；快速提取方法和生物素法则具有快速、简便和高纯度的优 点，但成本较高。对于酶切方法，单一酶切操作简便但适用范围有限；双酶切和 全酶切则能实现复杂切割，但操作较复杂且成本较高。
（2）双酶切
双酶切是使用两种不同的限制性内切核酸酶对DNA进行切割。该方法可实现 对复杂基因组或多个位点的精确切割，适用范围更广。但是，双酶切操作相对复 杂，需要更多时间进行优化和调整。
（3）全酶切
全酶切是使用一种或多种限制性内切核酸酶以及修饰酶等对DNA进行切割。 该方法可根据实验需求对DNA进行的优点是高度灵活，适用范围广泛。然而，全酶切需要更多的实验设计和操 作技巧，且成本较高。
比较研究
1、操作难易程度及成本
在操作难易程度方面，快速提取方法和生物素法相对简单，而常规提取方法 较为繁琐。在成本方面，生物素法和快速提取方法所需试剂和设备成本较高，而 常规提取方法成本较低。
2、纯度和产量
在纯度方面，生物素法和快速提取方法纯度较高，而常规提取方法纯度相对 较低。在产量方面，常规提取方法和快速提取方法产量较高，而生物素法产量较 低。
质粒DNA提取方法
1、常规提取方法
常规提取方法是一种经典的分步提取方法，包括裂解细胞、分离质粒DNA、 洗涤和纯化等步骤。该方法的主要优点是适用范围广，可从各种细胞中提取质粒 DNA。但是，该方法操作繁琐，提取周期较长，需要使用大量试剂和设备。
2、快速提取方法
快速提取方法是通过优化常规提取方法中的某些步骤，实现快速、简单的质 粒DNA提取。该方法主要优点是操作简便、快速，可减少试剂和设备的使用。但 快速提取方法可能会牺牲一些纯度或产量。
质粒的提取及酶切实验报告
质粒的提取及酶切实验报告
一、实验目标
本实验旨在提取低分子量DNA、质粒，通过酶切实验检测质粒DNA片段长度，并处理实验结果。
二、实验原理
1、质粒DNA提取：使用特定的提取试剂，先提取溶菌酶凝胶中的质粒DNA；
2、质粒DNA酶切：采用酶切的方法，对质粒DNA进行切割，形成小片段；
3、质粒DNA测序：采用测序仪对质粒DNA片段进行测序，从而确定其长度。
三、实验材料
1、提取试剂：主要由蛋白酶、乙腈、缓冲液、EDTA等混合而成；
2、PCR反应液：主要由dNTP、聚合酶、反应缓冲液等组成；
3、酶：主要由DNA内切酶和DNA外切酶组成；
4、测序仪：用于测序质粒DNA的片段长度；
四、实验步骤
1、提取质粒DNA：将实验样品放入提取试剂中，加热30分钟，然后用混合物洗涤一次，最后离心得到清澈的液体，含有提取的质粒DNA；
2、进行PCR反应：将提取的质粒DNA作为反应液™添加到PCR管中，在适当温度下反应10分钟；
3、酶切：将PCR管中的反应液加入内切酶和外切酶中，在规定温度下酶切1小时；
4、离心质粒DNA片段：将酶切后的反应液离心，以得到质粒DNA片段；
5、进行测序：将质粒DNA片段放置于测序仪中，逐一测序后得到结果；
五、实验结果及分析
实验结果：
质粒DNA片段长度：
0.31kbp、0.48kbp、0.51kbp、0.58kbp、0.68kbp等。
质粒DNA提取+电泳+质粒酶切实验报告
实验一：质粒DNA提取+琼脂糖凝胶电泳*实验目的：1.掌握质粒DNA提取的基本原理和方法2.掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法*实验原理：1.DNA提取原理1）DNA提取要求：①保证DNA一级结构的完整性；②排除其他分子的污染，使其纯度尽可能提高。
2）DNA样品来源：①培养细胞；②组织样本；③血液样本。
3）主要试剂和材料及仪器：试剂和材料：RNA酶A、细胞悬浮液（Buffer P1)、细菌裂解液（Buffer P2）、中和液（Buffer P3）、漂洗液PW1、漂洗液PW2、洗脱液、质粒DNA吸附柱、滤液收集管仪器：微量移液器、台式微量高速离心机、电泳仪、水平电泳槽、紫外透射仪或凝胶成像系统。
2.电泳原理：1）概念：电泳是指带电粒子在电场中向电势降低的方向移动的现象，移动速度与粒子大小及所带电荷多少有关。
在一定pH条件下，核酸及蛋白质等生物分子呈带电状态，可以进行电泳分析。
2）迁移方向：DNA由负极向正极迁移3）影响目标物迁移速率的因素：分子大小、构象、凝胶浓度、琼脂糖种类、电泳缓冲液、嵌入染料的存在和使用电压等。
4）荧光强度（得率）：荧光的强度是同DNA片段的大小或数量成正比的。
5）琼脂糖凝胶电泳原理：(1)关于电泳技术:电泳常用于分离和纯化那些分子大小电荷性状或分个构象有所不同的生物大分子一尤其是蛋白质和核酸。
正因为如此，电泳已成为生物化学和分子生物学中应用最为广泛的技术之一，其中在分子生物学实验中最为常用的是琼脂糖凝胶电泳。
琼脂糖是一种海藻多糖，琼脂糖胶分离范围很大，但其分辨率却相对较低。
通过改变琼脂糖凝胶的浓度,应用标准的电泳技术可以分离200到50,000 bp大小的DNA片断。
一般琼脂糖胶浓度在0.5%到4%之间，琼脂糖凝胶浓度越大,凝胶就越硬。
较高浓度的琼脂糖胶有利于较小的DNA片断分离,而较低浓度的琼脂糖胶则可以分离较大的DNA片断。
(2)琼脂糖凝胶电泳条带的观察:通过观察示踪染料的迁移距离可以判断DNA的迁移距离。
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30s
弃滤液
絮状沉淀
6. 洗柱 600μl
洗涤液W
12，000rpm
600μl
30s 弃滤液
洗涤液W
12，000rpm
30s
弃滤液
空柱
12，000rpm 2 min
7. 洗脱
取吸附柱至 另一新EP管
50μl 洗脱液
室温静置 12，000rpm
1min
1 min 收集洗脱液备用
二、质粒DNA定量测定
质粒提取、定量和酶切鉴定
实验材料
• 大肠杆菌DH5a菌株 • pMD18-T载体 • 易瑞质粒小量提取试剂盒
• Takara EcoRI 限制性内切酶 • Takara Hind III 限制性内切酶 • Takara 10 × M 酶切缓冲液
• BioWest电泳琼脂糖干粉 • 0.5×TBE核酸电泳缓冲液 • EB 核酸荧光染料 质粒提取、定量• 和酶Ta切k鉴ar定a 6 × 电泳上样缓冲液
质粒DNA的提取、定量 与酶切鉴定
Extraction and Identification of Plasmid DNA
质粒提取、定量和酶切鉴定
实验流程图
一、碱裂解法提取质粒
二、质粒定量
最后做
三、质粒酶切
四、酶切产物的琼脂糖电泳检测
质粒提取、定量和酶切鉴定
实验目的
• 掌握碱裂解法提取质粒的方法 • 掌握紫外吸收测定DNA的方法 • 了解质粒酶切鉴定原理 • 掌握琼脂糖凝胶电泳技术
质粒提取、定量和酶切鉴定
pMD18-T
质粒提取、定量和酶切鉴定
质粒DNA的酶切分析操作
在一个洁净的1.5 ml离心管中混匀下列反应物：
反应物
体积（µl)
2 10× M 酶切缓冲液
2
3 质粒DNA
10
4 Hind III
1
EcoR I
1
Hale Waihona Puke 1 H2O6混合后37 ℃水浴1～2h
质粒提取、定量和酶切鉴定
琼脂糖凝胶电泳操作 • 琼脂糖凝胶的制备 • 上样：加样前，样品先与6×上样缓冲液混匀 • 电泳 ：电压100v；30min • 结果观察：凝胶成像仪
质粒提取、定量和酶切鉴定
琼脂糖凝胶电泳上样
-
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每组上2个样品
1：DNA Marker（ 5 l ） 2：提取的质粒DNA （ 5 l ） 3：质粒DNA酶切产物 （ 10 l ）
溶液S1： 50 mmol/L 葡萄糖 10 mmol/L EDTA 25 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0) 2毫克/毫升 溶菌酶
裂解液S2：200 mmol/L NaOH 1% SDS
中和液S3：3 mol/L NaAc (pH4.8)溶液
质粒提取、定量和酶切鉴定
1. 收集细胞
12000rpm
共价闭环超螺旋DNA＞线性DNA＞开环的双链环状DNA
质粒提取、定量和酶切鉴定
琼脂糖凝胶浓度与DNA分子的有效分离范围
胶浓度（％）
0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0
线性DNA分子大小 （kb） 5～60 1～20 0.8～10 0.5～7 0.4～6 0.2～4 0.1～3
本次电泳使用1.0%琼脂糖凝胶 质粒提取、定量和酶切鉴定
•影响酶切反应的因素
底物DNA的纯度 反应系统：(反应缓冲液) 反应体积： 甘油浓度<5% 保温时间与温度
质粒提取、定量和酶切鉴定
四、琼脂糖凝胶电泳
质粒提取、定量和酶切鉴定
电泳：带电粒子在电场中泳动的现象
影响迁移率的因素？
电场 大小（分子量）
样品： 形状（构型）
电荷
质粒DNA三种构型：
共价闭环超螺旋 线性 开环的双链环状
质粒DNA：复性，溶于溶液中 染色体DNA：不能复性；形成缠连 的网状结构。
离心
染色体DNA与不稳定的大分子RNA、 蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来
质粒提取、定量和酶切鉴定
试剂盒的组成：
溶液S1（细菌悬浮液） 裂解液S2 中和液S3 洗涤液W 洗脱液 RNase A(100mg/ml) DNA吸附柱
基本原理
利用核酸在260nm处有紫外吸收的特性 紫外分光光度计
质粒提取、定量和酶切鉴定
操作步骤
1. 取5l提取的质粒DNA，加入95l蒸馏水 2. 混合均匀 3. 用紫外分光光度计测定A260
质粒提取、定量和酶切鉴定
紫外光吸收法：
DNA或RNA的定量 A260=1.0相当于 50μg/ml双链DNA 40μg/ml单链DNA（或RNA） 20μg/ml寡核苷酸
限制性内切酶
• 限制酶特异性地结合于一段被称为限制酶识别序列的 特殊DNA序列之内或其附近的特异位点上，并在此切 割双链DNA。
• 分子克隆中常用的为II型限制酶，其识别位点长度为 4～6个核苷酸的反向重复序列。
GGATCC CCTAGG
质粒提取、定量和酶切鉴定
EcoRⅠ和HindⅢ的识别序列和切口是： • EcoRⅠ：G↓AATTC • HindⅢ：A↓AGCTT
1.5mL 菌液
菌体沉淀
1 min
实验流程
3. 裂解细胞
2. 悬浮细胞
250μl
250μl
剧烈震荡
溶液S1
裂解液S2
颠倒混匀4-6次
室温静置 3~5min
4. 中和 350μl 中和液S3
5. 过柱分离
温和地 颠倒混匀6-8次
12，000rpm 10 min
取600μl上清至
吸附柱管
至出现白色
12，000rpm
质粒提取、定量和酶切鉴定
DNA或RNA的纯度判定 DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8 RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0
质粒提取、定量和酶切鉴定
三、质粒DNA的酶切分析
• 质粒 DNA: ～3 kb
载体: pMD18-T 2.7kb 基因: CHD5 1.4 kb
质粒提取、定量和酶切鉴定
• 碱裂解法； • 煮沸裂解； • 羟基磷灰石柱层析法； • 质粒DNA释放法； • 酸酚法等
质粒提取、定量和酶切鉴定
碱裂解法基本原理
基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的 差异而达到分离目的。
pH =12.6（碱性）
pH=中性
染色体DNA：氢键断裂，变
性。
NaAc溶液
质粒DNA：大部分氢键断裂，（pH4.8） 但超螺旋共价闭合环状的两 条互补链不会完全分离。 （不完全变性）
质粒提取、定量和酶切鉴定
实验仪器
• 微量移液器 • 离心机 • 恒温水浴箱 • 紫外检测仪 • 电泳仪 • 水平电泳槽
质粒提取、定量和酶切鉴定
一、碱裂解法提取质粒DNA
• 独立于细菌染色体 以外，能独立自主 复制的闭合环状 DNA分子
• 基因工程常采用的 载体
质粒提取、定量和酶切鉴定
质粒提取方法：