动物细胞工程
动物细胞工程动物细胞与组织培养课件
动物细胞工程动物细胞与组织培养课件汇报人：2024-01-10•动物细胞工程概述•动物细胞培养技术•动物细胞与组织的体外培养目录•动物细胞工程的应用案例•展望与挑战01动物细胞工程概述定义与特点定义动物细胞工程是以动物细胞为研究对象，通过细胞培养、细胞融合、基因转移等技术手段，实现动物细胞和组织的体外培养、繁殖和生产，以及动物疾病治疗和生物医学研究的技术。
特点动物细胞工程具有高度的技术性、复杂性和应用性，涉及多个学科领域，如生物学、医学、生物工程等。
它能够实现动物细胞的体外大规模培养，生产出大量的生物制品，如疫苗、单克隆抗体等，为人类疾病预防和治疗提供重要的技术支持。
利用动物细胞大规模培养技术，生产出大量的疫苗、单克隆抗体等生物制品，用于疾病的预防和治疗。
生物制品生产通过动物细胞培养和基因工程技术，实现新药的筛选和开发，提高药物研发的效率和成功率。
药物筛选与开发利用动物细胞工程技术，体外培养出人体组织和器官，用于移植和修复人体损伤的组织和器官。
组织工程通过动物细胞培养和基因工程技术，建立各种疾病模型，用于疾病的发病机制研究和药物筛选。
疾病模型建立动物细胞工程的应用德国科学家Rudolf Virchow首次提出“细胞来源于细胞”的著名论断，为动物细胞工程的发展奠定了基础。
1907年美国科学家Graham和Milstein首次成功实现了哺乳动物细胞的体外培养，开启了动物细胞工程的新篇章。
1958年美国科学家Kohler和Milstein首次成功制备出了单克隆抗体，为动物细胞工程在生物制品生产领域的应用奠定了基础。
1975年随着基因工程技术的发展和应用，动物细胞工程进入了一个新的发展阶段，实现了基因转移和基因编辑等先进技术的应用。
1990年代动物细胞工程的发展历程02动物细胞培养技术细胞生存和增殖条件动物细胞培养需要提供适宜的温度、湿度、pH值、营养物质等条件，以维持细胞的生存和增殖。
细胞贴壁与生长动物细胞在培养过程中需要贴附在培养器皿的表面才能生长，因此需要选择适当的细胞培养器皿和贴壁介质。
《动物细胞工程》 讲义
《动物细胞工程》讲义一、动物细胞工程的概念动物细胞工程是应用细胞生物学和分子生物学的原理和方法，在细胞水平上进行的操作，以获得人们所需要的生物产品或细胞本身。
它是现代生物技术的重要组成部分，涵盖了细胞培养、细胞融合、细胞核移植、胚胎移植等多个方面。
二、动物细胞培养（一）基本原理细胞培养的基本原理是细胞的增殖。
细胞在适宜的环境中，能够吸收营养物质，进行新陈代谢，并通过分裂增加数量。
（二）培养条件1、无菌、无毒的环境：对培养液和所有培养用具进行无菌处理，通常还会添加一定量的抗生素，以防止培养过程中的污染。
2、营养物质：包括糖、氨基酸、无机盐、维生素等，这些物质要按照细胞所需的种类和量进行精确配置。
3、适宜的温度和 pH：哺乳动物细胞的培养温度一般在 365℃左右，pH 则在 72 74 之间。
4、气体环境：细胞培养所需的气体主要有氧气和二氧化碳，氧气用于细胞呼吸，二氧化碳则用于维持培养液的 pH。
（三）培养过程1、取材：通常从动物的组织或器官中获取细胞，如从胚胎或幼龄动物的器官组织中获取细胞，其分裂能力更强。
2、原代培养：将取得的组织用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理，使其分散成单个细胞，然后制成细胞悬液，放入培养瓶中培养。
3、传代培养：当细胞贴满瓶壁时，需要用胰蛋白酶处理，使细胞从瓶壁上脱落下来，然后分瓶继续培养。
三、动物细胞融合（一）概念动物细胞融合也称细胞杂交，是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。
（二）诱导融合的方法1、物理法：如电激融合法。
2、化学法：常用的诱导剂是聚乙二醇（PEG）。
3、生物法：如灭活的病毒。
（三）应用1、制备单克隆抗体：这是动物细胞融合技术最突出的应用。
2、用于基因定位和染色体转移等研究。
四、单克隆抗体（一）概念单克隆抗体是由单个 B 淋巴细胞经过无性繁殖形成的细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体。
（二）制备过程1、给小鼠注射特定的抗原，使其发生免疫反应，产生能分泌特定抗体的 B 淋巴细胞。
动物细胞工程ppt课件
5%CO2：维持培养液的pH ②培养装置: 培养皿或松盖培养瓶 置于 CO2培养箱中进行培养
（含有95%空气和5%CO2的混合气体）
培养皿
培养瓶
CO2培养箱
二、动物细胞培养的过程
①培养前用什么方法分散成单个细 胞？ ②体外培养动物细胞有哪些类型？ ③什么是细胞贴壁？什么是接触抑 制？ ④什么是原代培养和传代培养？ ⑤为什么要进行分瓶培养？怎么处 理？ ⑥动物细胞培养与植物组织培养有 什么相同之处与不同之处？
像建立骨髓库一样，有研究团队正在尝试建立HLA（Human Leukocyte Antigen，人类白细胞抗原）多态性丰富的iPS细胞库，可以为 需要的人找到HLA匹配度较高的iPS细胞，这样不仅可以节省时间、成本 ，还能减轻异体干细胞移植后发生的免疫排斥反应。
二、拓展应用 现在关于iPS细胞的研究正在不断深入。请你从以下两个方面来查阅
基本营养：水、无机盐、有机碳源、有机氮源 特殊物质：维生素、血清
血清
含有尚未研究清楚的细胞所需的营养物质 营养基构成：合成培养基 + 血清等一些天然成分
将细胞所需的营养物质按种类和所需量严格配制而成 的培养基。
培养基的类型：固体培养基 or 液体培养基（培养液）
一、动物细胞培养的条件 2.无菌、无毒的环境 措施1: 灭菌处理——对象？ 培养液和所有培养用具 措施2: 操作在无菌环境下进行。 措施3: 培养液中适量添加 抗生素 。——抑制细菌生长 措施4：定期更换培养液——目的？清除代谢物，防止细胞代谢物积累对
【思考】动物细胞的整个培养过程中可能多次用到胰蛋白酶或胶原蛋白酶？
第一次使用的目的是使组织细胞分散开；
动物细胞工程
演讲人： 日期：
目 录
• 动物细胞工程概述 • 动物细胞培养技术 • 动物细胞融合技术 • 动物细胞基因工程技术 • 动物克隆技术 • 动物细胞工程在医学领域的应用 • 动物细胞工程在农业领域的应用
动物细胞工程概述
01
定义与发展历程
定义
动物细胞工程是一门以动物细胞为基本单位，在体外条件下进行培养、繁殖、 遗传操作及生物工程制品生产的综合性技术科学。
动物细胞工程在医
06
学领域的应用
疫苗生产与疾病治疗
疫苗生产
利用动物细胞培养技术生产病毒疫苗，如流感疫苗、麻疹疫苗等，通过细胞培养扩增病 毒，然后灭活或提取病毒抗原制备疫苗。
疾病治疗
动物细胞工程可用于生产治疗性蛋白，如单克隆抗体、重组蛋白等，用于治疗癌症、自 身免疫性疾病等。
组织工程和再生核移植技术原理及操作步骤
原理
核移植技术是将一个含有遗传物质的细胞核，通过显微操 作技术移植到一个已经去除细胞核的卵细胞中，使这个重 组细胞发育成一个与供体细胞基因型完全相同的个体。
1. 选择供体细胞和受体细胞
供体细胞一般选择传代10代以内的细胞，以保持其正常 的二倍体核型；受体细胞一般选择去核的卵母细胞。
性物质；同时，胚胎干细胞还可以用于基因治疗和细胞治疗等领域。
克隆动物的生产与伦理问题
克隆动物的生产
通过核移植技术和胚胎移植技术，可以生产出与供体细胞基因型完全相同的克隆动物。目前已经有多 种哺乳动物被成功克隆，如绵羊、牛、猪等。
伦理问题
克隆技术的出现引发了广泛的伦理争议。一方面，克隆技术可以用于生产优质肉用动物、濒危动物保 护等领域；另一方面，克隆技术也可能被用于复制人类等违背伦理道德的行为。因此，国际社会普遍 对克隆技术采取谨慎和限制的态度，制定相应的法律法规进行规范和管理。
第45讲 动物细胞工程
第45讲动物细胞工程课标内容(1)阐明动物细胞培养是从动物体获得相关组织，分散成单个细胞后，在适宜的培养条件下让细胞生长和增殖的过程。
动物细胞培养是动物细胞工程的基础。
(2)阐明动物细胞核移植一般是将动物一个细胞的细胞核移入去核的卵母细胞中，并使重组细胞发育成新胚胎，继而发育成动物个体的过程。
(3)阐明动物细胞融合是指通过物理、化学或生物学等手段，使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。
(4)概述细胞融合技术是单克隆抗体制备的重要技术。
(5)简述干细胞在生物医学工程中有广泛的应用价值。
考点一动物细胞培养1.动物细胞培养原理：细胞增殖(1)地位：动物细胞工程常用的技术有动物细胞培养、动物细胞核移植、动物细胞融合等。
其中动物细胞培养是动物细胞工程的基础。
(2)培养条件一般用液体培养基(3)培养过程(1)区分原代培养和传代培养的关键是看用胰蛋白酶处理的对象和是否分瓶。
①分瓶前，第一次用胰蛋白酶对动物组织进行处理后的培养是原代培养。
②第二次用胰蛋白酶处理，使细胞从瓶壁上脱离下来，分瓶后的细胞培养为传代培养。
(2)细胞贴壁和接触抑制：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。
细胞数目不断增多，当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。
2.干细胞培养及其应用【情境推理·探究】1.进行动物传代培养时用胰蛋白酶分散细胞，可以用胃蛋白酶替代胰蛋白酶吗？说明原因。
提示不可以，胃蛋白酶作用的适宜pH约为1.5，当pH大于6时，胃蛋白酶就会失活。
胰蛋白酶作用的适宜pH为7.2～8.4。
多数动物细胞培养的适宜pH为7.2～7.4，胃蛋白酶在此环境中失活，而胰蛋白酶在此环境中活性较高，因此胰蛋白酶适宜用于传代培养时分散细胞。
2.若将病人的皮肤成纤维细胞诱导成iPS细胞，再使它转化为需要的细胞，用这些细胞给病人治病，不会产生免疫排斥反应，尝试解释其中的原因。
提示iPS细胞来源于病人自身的体细胞。
动物细胞工程动物细胞培养和核移植技术
核移植操作
显微操作
在显微镜下，将供体细胞核移植到受体细胞中。
融合与激活
通过电刺激或化学方法诱导受体细胞与供体细胞 融合，并激活新形成的细胞。
筛选与鉴定
对新形成的细胞进行筛选和鉴定，确保核移植成 功。
重组胚胎的培养与移植
胚胎培养 在适宜的培养条件下，对重组胚胎进行培养，促进其发育。
胚胎移植 将培养成熟的胚胎移植到代孕动物体内，以产生后代。
融合后的细胞开始分裂和发育，最终 形成与供体具有相同遗传物质的克隆 个体。
核移植技术流程
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供体细胞的选择与准备
选择适当的供体细胞
01
根据实验需求选择具有所需特性的供体细胞，如特定组织或器
官来源的细胞。
细胞培养准备
02
确保供体细胞处于适宜的培养环境中，包括适当的培养基、温
度、气体条件等。
细胞传代与扩增
03
对供体细胞进行传代和扩增，以获得足够的细胞数量用于核移
植。
受体细胞的选择与准备
选择适当的受体细胞
根据实验需求选择具有良好接受性的受体细胞，如去核的卵母细 胞。
去核处理
使用显微操作技术去除受体细胞的细胞核，为核移植做好准备。
受体细胞激活
通过化学或电刺激方法激活受体细胞，使其恢复分裂活性。
细胞分离
通过离心、过滤等方法将细胞从酶液
3
中分离出来。
培养环境控制
提供适宜的温度、湿度、气体环境，
5
保持培养基的营养成分和pH值。
组织消化
2
使用适当的酶液将组织分解成单个细
胞。
细胞接种
4
将分离出的细胞接种到培养容器中。
传代细胞培养
专题二动物细胞工程课件
(3) 温度和PH
36.5+（-）0.5度, 7.2-7.4 (4) 气体环境：
O2和CO2（9•专5题%二空动物细气胞工和程 5% CO2 ） •17
c、动物细胞培养液的主要成分是什 么？较植物组培培养基有何独特之处？
主要成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐、 维生素和动物血清等。
独特之处有：1、液体培养基（动物体细胞大 都生活在液体的环境） 2、成分中有动物血 清等
无限传代 •专题二动物细胞工程
•8
动物细胞的培养过程
取动物器官 和组织
幼龄动物
剪碎组织
胰蛋白酶处理
单个细胞
细胞培养
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•9
1有关概念:
原代培养：从机体取出后立即培养的 细胞为原代细胞。培养的第1代细胞与传 10代以内的细胞称为原代细胞培养。
传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出， 配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个 以上的培养瓶中继续培养，称为传代培 养。
A．动物细胞培养的目的就是为了获得大量的细胞 分泌蛋白
B．动物细胞培养前要用胰蛋白酶处理使细胞分散
C．细胞遗传物质的改变发生于原代培养过程中
D．培养至50代后继续传代的细胞是细胞株
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6、在动物细胞培养中有部分细胞可能在培养 条件下无限制地传代下去，这种传代细胞称之 为（ D ）
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d、动物细胞培养能否像绿色植物组 织培养那样最终培养成新个体？
不能，动物细胞培养只能使细
胞数目增多，不能发育成新的动 物个体
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•19
e、胰蛋白酶真的不会把细胞消化掉吗？ 为什么？
胰蛋白酶除了可以消化细胞间 的蛋白外，长时间的作用也会消 化细胞膜蛋白，对细胞有损伤作 用，因此必须控制好胰蛋白酶的 消化时间。
动物细胞工程
动物细胞工程第一章动物细胞工程概论一、动物细胞工程的概念1.动物细胞工程的定义动物细胞工程是应用细胞生物学和分子生物学的技术方法对动物细胞进展各种操作并使其在体外生长、增殖、分化以生产有用产品或引向成体化〔产生型生物个体〕的技术体系，是生物技术〔生物工程〕的重要组成局部。
狭义细胞工程指对细胞个体进展的各种操作，广义的细胞工程包括对细胞、组织、器官所进展的各种操作。
2.动物细胞工程争论的主要内容以狭义细胞工程为主，兼顾组织、器官工程等内容的争论。
(1)狭义细胞工程：争论体外分别、培育、增殖、分化动物细胞的条件以及保存、操作及利用动物细胞的工艺技术体系。
(2)组织工程：争论体外培育、增殖动物组织的条件以及保存、操作及利用动物组织的工艺技术体系。
(3)器官工程：争论体外培育、增殖器官的条件以及保存、操作及利用动物器官的工艺技术体系。
(4)动物胚胎工程：争论动物胚胎生产、保存、操作及移植的工艺技术体系。
3.动物细胞工程争论的意义(1)是动物生殖的重要技术手段加快动物生殖速度：A.体外受精生产胚胎 B.胚胎移植生产动物 (2)是人类关心生殖技术的重要组成局部体外受精—胚胎移植技术，可以抑制雄性不育和雌性不孕；(3)是动物遗传育种的重要技术手段对精子或卵子进展遗传操作，或利用细胞融合、胚胎嵌合技术可以使假设干个动物性状进展有机组合，产生的生物个体；(4)生产药物直接培育细胞或组织，从细胞或组织代谢物中直接获得药物;对细胞进展遗传操作，生产转基因动物，利用转基因动物生产药物〔生物反响器〕；(5)保存珍惜动物资源由于动物克隆技术的成功，保存细胞、组织、胚胎，就意味着保存一个生命个体，保存细胞、组织、胚胎，就意味着保存一个生物种群(6)供给人类器官移植的材料人类器官移植进展很快，目前可以进展心脏、肝、肾脏移植，可以进展皮肤、角膜、骨髓细胞移植。
三、动物细胞工程讲授的主要内容1.动物细胞、组织培育2.动物细胞融合3.动物细胞重组4.向细胞内引入高分子物质5.动物细胞冷冻保存6.动物胚胎工程四、动物细胞工程试验〔实习〕内容1.试验仪器设备的识别与使用2.动物细胞培育用液的制备3.动物胎儿成纤维细胞分别与培育4.动物细胞常规检查和生物学检测5.培育细胞的冻存与复苏五、动物细胞工程争论取得的重要进展1.采集、冷冻与人工授精技术的成熟和进展，为充分发挥利用雄性动物生殖潜力奠定了根底；2.雌性动物卵母细胞体外成熟培育技术的成功，使人们在体外完成动物生殖过程成为可能；3.体外受精与胚胎移植技术的成功，产生了试管婴儿，试管牛，试管猪，试管山羊，试管兔；4.细胞核移植技术的成功，使人们克隆高等哺乳动物的梦想得以实现体细胞核移植、胚胎细胞核移植、胚胎干细胞核移植技术的成功，为克隆动物和转基因动物生产供给了技术支撑；5.胚胎干细胞与组织干细胞成功分别、体外扩增与诱导分化争论的成功，为人类医学进展供给了贵重的材料；胚胎干细胞，胰腺干细胞，神经干细胞，骨髓干细胞，皮肤干细胞，角膜干细胞6.转基因细胞〔细胞转染基因〕技术的成功，为转基因动物的生产制造了条件；7.胚胎嵌合技术一种或两种动物胚胎共同生长发育形成一个生物个体的技术，即在一个生物体内，含有来源于两个不同胚胎的细胞和组织；8.细胞融合技术将两种或两种以上的细胞融合，形成一个具有性状的细胞，这种技术称为细胞融合技术。
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动物细胞的体外生长特点：
1、动物细胞的特点
（1）动物细胞比微生物细胞大，无细胞壁，对机械搅拌或剪切力敏感。
（2）动物细胞生长缓慢，易受污染。
（3）动物细胞分化的程度和类别比植物细胞更高更复杂，脱分化非常困难。
（4）正常细胞培养的世代数有限，只有癌细胞和发生转化的细胞才能无限生长下去。
（5）动物细胞间主要以聚集体形式存在，大多需要贴附在载体表面才能生长。
体外培养的动物细胞的生长特点：
1.、贴附
2、接触性抑制
3、密度抑制
血清的生物功能
1. 提供基本营养物质
2. 提供激素和各种生长因子
3. 提供结合蛋白
4.对培养中的细胞起到某些保护作用：提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤。
动物细胞培养可以分为贴壁培养、固定化培养、悬浮培养三大类
贴壁生长过程：
游离期：接种的细胞在培养液中呈悬浮态。
吸附期：不同类型的细胞的贴壁时间有所差异，多数细胞都可在24小时内贴壁。
繁殖期：悬浮细胞贴壁后经过一段停滞后开始分裂。
随着细胞数量的增多，细胞间开始接触并连接成片。
出现接触性抑制。
退化期：细胞长满培养瓶壁，随着营养物的消耗和代谢物的积累，密度抑制现象出现，细胞开始退化。
组织工程：是利用生命科学、医学、工程学原理与技术，单独或组合地利用细胞、生物材料、细胞因子实现组织修复或再生的一门技术。
组织工程三要素：
1. 种子细胞
2. 支架材料
3. 生长因子
按分化功能：干细胞可分为单能干细胞、多能干细胞与全能干细胞。
胚胎干细胞定义
胚胎干细胞简称ES，是一种全能干细胞，它是从着床前胚胎内细胞团或原始生殖细胞经体外分化抑制培养分离的一种全能性细胞系，可以分化成任何一种组织类型的细胞。
成体干细胞定义
成体干细胞是指来自成体的具有分裂和分化潜能的细胞
单克隆抗体技术的核心是用骨髓瘤细胞与经特定抗原免疫刺激的B淋巴细胞融合得到杂交
瘤细胞，杂交瘤细胞既能象骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力。
因此，单克隆抗体技术又称为杂交瘤技术。
胚胎工程的定义
胚胎工程：以体外受精和体外早期胚胎发育为基础，在胚胎发育过程中进行的卵子切割、性别控制、嵌合体制作、细胞核移植、转基因操作等定向控制、改造和创造新遗传性状的技术统称为胚胎工程。
体外受精是指哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术
体外受精技术主要包括以下几个主要方面：精子的采集与获能、卵子的回收及成熟培养、体外受精、受精卵的体外发育及试管胚胎的移植等
克服阻滞现象主要采用以下两个方法：
一、是改进培养液成分，改善培养条件，尽量满足早期胚胎发育所需物质，确定并减除对其发育不利的成分；
二、是利用体细胞共同培养体系，以提供发育所需的物质条件，目前广泛采用的有输卵管上皮细胞共培养体和颗粒细胞单层共培养体系。
胚胎移植（embryo transfer ET）也称受精卵移植，是指将良种母畜配种后，从其生殖道（输卵管或子宫角）取出受精卵或早期胚胎，移植到同种生理状态相同的母畜体内，使之继续发育成为新个体技术
胚胎分割（embryo splitting）即是将一枚胚胎用显微手术的方法分割成二分、四分甚至八分胚，经体内或体外培养，然后移植入受体中，以得到同卵双生或同卵多生后代的技术，也是胚胎克隆的一种方法。
胚胎分割原理：根据卵裂球具有发育成为一个个体的全能性的特点
胚胎分割的方法：
（1）显微针分割法
（2）显微刀分割法
（3）酶软化透明带后显微分割法
（4）酶消化去透明带后分割法
（5）徒手分割法
非冷冻保存主要有三种方法，即异种动物体内保存法、卵和胚胎的37℃保存法和冷藏保存法
动物胚胎的一般保存程序：
动物胚胎的一般保存程序是将胚胎吸入含M2液的安瓿瓶中，冷却到0℃，逐渐加入冷冻保护剂，封闭安瓿。
然后，把封闭好的安瓿从0℃冰室，转移到－5-－6℃的恒冷室中，用预先在液氮凹面冷却的眼科镊子尖部，接触安瓿，玻璃上一出现霜，就立即移开镊子，完成植冰过程，之后，慢速冷至－40℃或－70℃，再直接投入液氮中保存
核移植是指将胚胎细胞或体细胞的细胞核用显微外科手术的方法移入去核的卵母细胞中，构建成重组胚,通过体内或体外培养、胚胎移植，产生与供体细胞基因型相同的后代的技术过程，又称为动物克隆技术。
根据核供体的来源不同,可将其分为：胚胎细胞克隆技术和体细胞克隆技术
动物细胞体外培养的一般过程：
1．核受体细胞的准备
卵母细胞的来源有两种方式：一是用激素对雌体进行超排处理，从输卵管冲出体内成熟的MⅡ卵母细胞。
二是从屠宰场收集卵巢，吸出滤泡中的卵丘—卵母细胞复合体(COCs)，在体外培养成熟后作为受体。
2．核供体细胞的准备
3．细胞核移植
常用的核移植方法有两种，即胞质内注射和透明带下注射
4．激活
5．重组胚的体内或体外培养
6．胚胎移植
克隆技术存在的问题
理论问题
●分化的体细胞克隆对遗传物质重编（细胞核内所有或大部分基因关闭，细胞重新恢
复全能性的过程）的机理还不清楚；受体细胞质与供体细胞核周期相容性的问题。
●克隆动物是否会记住供体细胞的年龄。
●克隆动物的连续后代是否会累积突变基因。
●在克隆过程中胞质线粒体所起的遗传作用等问题还没有解决。
实践问题
●克隆动物的成功率还很低
●生出的部分个体表现出生理或免疫缺限。
●即使是正常发育的“多莉”，也被发现有早衰迹象
转基因动物：是指用DNA重组技术，将人们所需要的目的基因导入动物的受精卵或早期胚胎内，使外源基因在体内表达，并且能稳定地遗传给后代的动物。
动物转基因的主要步骤
1.外源目的基因的制备
2.外源目的基因有效导入生殖细胞或胚胎干细胞
3.选择获得携有目的基因的细胞
4.选择合适的体外培养系统和宿主动物
5.转基因细胞胚胎发育及鉴定
6.筛选所得的转基因动物品系
导入外源基因获取转基因动物的主要途径有：
(1)原核微注射法；(2)胚胎干细胞介导法；(3)载体法，包括：①逆转录病毒载体；②脂质体
载体；③精子载体。
基因打靶（gene targeting）是指外源DNA与受体细胞染色体DNA上的同源序列之间发生重组，并整合在预定位点，改变细胞遗传特性的方法
基因打靶的原理：同源重组现象和胚胎干细胞技术
基因打靶的主要步骤：
①重组基因载体的构建
②导入受体细胞
③筛选
④检测
基因打靶载体：基因插入型载体和基因置换型载体。