华中农业大学植物过氧化物酶同工酶测定
华中农业大学《生物化学实验》试卷
华中农业大学本科生课程考试试卷考试课程与试卷类型：植物生理学实验原理与技术（A）姓名：学年学期：2008－2009－1 学号：考试时间：2009－－班级：一、名词解释 ( 每题 4 分 , 共 12分 )1. 聚丙烯酰胺凝胶2. 离心技术3．可见光分光光度法/反相纸层析二、填空题 ( 每空 2 分 , 共 42分 )1. 反相纸层析法分离油菜不饱和脂肪酸的实验中 ,分离后的不饱和脂肪酸经红氨酸溶液显色后 , 其最终产物颜色是（1）,从点样端起层析谱带所对应的脂肪酸依次是 (2) 、（3）、（4）、（5）、（6）。
2. 圆盘聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物酶同工酶的实验中 , 电泳时上槽接电源（7）极 ,下槽接电源 (8) 极 , 电泳开始电流应调节至每管（9）mA, 十分钟后电流调节至每管 (10) mA; 在上槽或样品中加入溴酚蓝是起（11）的作用。
3. 核酸提取过程中 , 将含有 DNA 的溶液置72℃处理 3 分钟，其目的是（12）；在淀粉酶活性测定过程中将淀粉酶液置于 70℃下处理 15 分钟的目的是（13）。
4．在微量凯氏定氮法测定植物组织中的总氮和蛋白氮，有三个主要的实验阶段，它们分别是（14）、（15）和（16）。
在第二阶段，若收集三角瓶中的溶液颜色由_（17）变为（18），表明反应完全。
第三阶段所用的标准浓度的滴定溶液名称是（19）。
5. DNA 提取研磨时加入的研磨缓冲液的NaCl浓度是（20），研磨时加入SDS的作用是（21）三、是非判断题 (判断对错，对的标T，错的标F，每题 2 分，共 10 分 )1．萌发的小麦种子中含有很高活性的淀粉酶，其中α－淀粉酶不耐热，在70℃迅速钝化。
（）2．本学期测定还原性糖和可溶性蛋白含量时都用到了斐林试剂，这两个实验中所用的斐林试剂的配方是相同的。
（）3．DNA提取中，加入冷乙醇是为了使DNA分子复性变粗。
（）4．离心机使用中，要求同一台离心机所用的离心管都有相同的重量。
植物过氧化物酶同工酶的研究进展
植物过氧化物酶同工酶的研究进展作者：顾雯雯胡亚婷韩英卞涵佳罗兵孙海燕万能杨志刚沈宗根来源：《安徽农业科学》2014年第34期摘要过氧化物酶（Peroxidase，POD）是植物体内广泛存在的氧化还原酶，在植物体内具有多种同工酶。
POD同工酶具有种属、器官以及发育阶段特异性。
它作为遗传标记广泛应用于植物的品种鉴定、遗传多样性分析、植物抗病性分析等方面。
该研究综述了植物POD同工酶检测技术的研究进展以及POD同工酶的应用，提出进一步研究植物POD同工酶的建议。
关键词植物;过氧化物酶同工酶;研究进展中图分类号 S188 ;文献标识码 A ;文章编号 0517-6611（2014）34-12011-03Research Progress of Peroxidase Isozymes in PlantsGU Wenwen1， HU Yating2， HAN Ying3， LUO Bing1* et al（1. College of Biology and Food Engineering， Changshu Institute of Technology，Changshu， Jiangsu 215500; 2. Suzhou Wuyuetian Organic Agriculture Science and Technology Co. Ltd.， Wujiang， Jiangsu 215216; 3. Wujiang Pingwang Battle Companion Grape Professional Cooperatives， Wujiang， Jiangsu 215221）Abstract The peroxidase （POD）， existed widely in plants， was an oxidoreductase and had various isozymes. The peroxidase isozymes had specificity in species， organs and developmental stage. As a genetic mark， the peroxidase isozymes were widely used in varieties identification，genetic diversity analysis， disease resistance. This paper reviewed the advances of detecting method for analysis of peroxidase isoenzymes in plants and the application of peroxidase isozymes. Suggestions were put forward for the further research of peroxidase isozymes in plants.Key words Plants; Peroxidase isozymes; Research progress基金项目江苏省青年基金项目（BK20140417）;苏州市科技计划项目（SZS201102，SYN201110，SNG201323和SNG201242）;江苏省大学生实践创新训练计划项目（201310333032Y）;苏州市吴江区科技计划项目（WN201311，WN201317）;常熟市科技计划项目（CS201205）。
植物过氧化物酶实验报告
一、实验目的1. 了解过氧化物酶在植物生理过程中的作用。
2. 掌握愈创木酚法测定过氧化物酶活性的原理和方法。
3. 通过实验，提高学生运用实验方法分析植物生理问题的能力。
二、实验原理过氧化物酶（POD）是一种广泛存在于植物体内的酶，催化H2O2分解产生O2和H2O。
愈创木酚法是一种测定POD活性的常用方法，其原理是POD催化H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物，该产物在470 nm处有最大光吸收值。
通过测定该波长下的吸光度变化，可以计算出POD的活性。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：马铃薯块茎2. 仪器：分光光度计、离心机、研钵、容量瓶、量筒、试管、吸管3. 试剂：100 mmol/L的磷酸缓冲液（pH 6.0）、愈创木酚溶液、30% H2O2、20 mmol/L KH2PO4四、实验步骤1. 制备酶提取液：取马铃薯块茎约0.5 g，加入5 mL磷酸缓冲液（pH 6.0），研磨均匀，过滤，收集滤液，4℃下保存备用。
2. 测定酶活性：a. 设置酶活性测定体系：取2 mL酶提取液，加入1 mL 30% H2O2和1 mL愈创木酚溶液，混匀，立即放入分光光度计中，于470 nm处测定吸光度。
b. 设置对照体系：取2 mL酶提取液，加入1 mL磷酸缓冲液（pH 6.0）和1 mL愈创木酚溶液，混匀，立即放入分光光度计中，于470 nm处测定吸光度。
3. 计算酶活性：a. 酶活性 = [(A1 - A2) / (t2 - t1)] × 0.01 × (1.977 - 0.874) / 10 × 0.01 × 250.027575b. 其中，A1为酶活性测定体系的吸光度，A2为对照体系的吸光度，t1为酶活性测定体系测定时间，t2为对照体系测定时间。
五、实验结果与分析1. 实验结果：通过实验，得到马铃薯块茎中POD的活性为0.027575 U/g。
2. 结果分析：a. 从实验结果可以看出，马铃薯块茎中含有一定量的POD，且活性较高。
实验9-10 植物过氧化物酶同工酶的测定(凝胶圆盘电泳)
（五）记录并计算： 记录并计算： 观察、记录酶谱， 观察、记录酶谱，并 计算各同工酶的相对 迁移率。 迁移率。
【要点提示】 要点提示】
1. 分离胶聚合时间应控制在 ～60min，聚合过 分离胶聚合时间应控制在30～ ， 快使凝胶太脆易断裂，主要是AP或 快使凝胶太脆易断裂，主要是 或TEMED过 过 量引起；聚合过慢甚至不聚合，可能是AP或 量引起；聚合过慢甚至不聚合，可能是 或 TEMED用量不足或已失效。 用量不足或已失效。 用量不足或已失效 2. 电泳时如果电泳槽盖上有冷凝水，则表示电压 电泳时如果电泳槽盖上有冷凝水， 或电流过大，体系发热，可引起蛋白质变性、 或电流过大，体系发热，可引起蛋白质变性、 凝胶底部断裂等，应注意调整。 凝胶底部断裂等，应注意调整。特别是进入分 离胶后应通过控制电压，调节电流不超过5mA/ 离胶后应通过控制电压，调节电流不超过 管。
（四）染色： 染色： 临用时配制染色液：（ ml ） 临用时配制染色液：（10 ：（ 联苯胺母液 H2O 3% H2O2 0.5 ml 9.3 ml 0.2 ml
将染液倒入盛有凝胶条的试管中（ 将染液倒入盛有凝胶条的试管中（没过 胶条）。约10min后用自来水冲洗。 胶条）。约 后用自来水冲洗。 ）。 后用自来水冲洗
【实验步骤】 实验步骤】
（一）过氧化物酶的提取：取8~12粒发芽 过氧化物酶的提取： 粒发芽 的麦粒，加入1ml H2O 或0.5mol/L Tris的麦粒，加入 HCl缓冲液（pH 6.8），冰浴上研成匀浆。 缓冲液（ ），冰浴上研成匀浆。 缓冲液 ），冰浴上研成匀浆 转入离心管，再用2ml上述溶液冲洗研钵 转入离心管，再用 上述溶液冲洗研钵 壁并全部转入离心管，4000r/min离心 壁并全部转入离心管， 离心10 离心 min，上清液供电泳分析用。 ，上清液供电泳分析用。
华中农业大学植物过氧化物酶同工酶测定-ct-PPT课件
2
二、材料、设备与试剂
（一 ）实验材料 ：小麦芽。 （二）设备 ：1.冷冻离心机；2.稳流稳压电泳 仪；3. 电泳槽（园盘型）等。 （三）试剂
1.分离胶缓冲液
2.分离胶贮液：
3.过硫酸铵：现配现用。
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3
4.四甲基乙二胺(TEMED)。
5.电极缓冲液：Tris6.0g，Gly（甘氨酸） 28.8g，用水定容至1000mL(pH8.3)，用前稀释 10倍。
同工酶具有不同的迁移速将电泳后的凝胶置于含有将电泳后的凝胶置于含有h2o2h2o2及联苯胺及联苯胺的溶液中染色利用过氧化物酶催化的溶液中染色利用过氧化物酶催化hh22o2o2分分解并把联苯胺氧化成蓝色或棕褐色产物的原解并把联苯胺氧化成蓝色或棕褐色产物的原理出现的蓝色或棕褐色条带即为过氧化物理出现的蓝色或棕褐色条带即为过氧化物酶同工酶在凝胶中存在的位置多条有色带酶同工酶在凝胶中存在的位置多条有色带即构成过氧化物酶同工酶酶谱
H2O2，混匀后倒入盛有凝胶条的培养皿。此时可以看 到胶条上出现蓝色或棕褐色环，即过氧化物酶酶带，约
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10min后用自来水冲洗，此时蓝色带会慢慢变为棕褐色 条带。
湿地松感染松色二孢菌后过氧化物酶同工酶的测定
湿地松感染松色二孢菌后过氧化物酶同工酶的测定
边银丙;周茂繁
【期刊名称】《华中农业大学学报》
【年(卷),期】1996(15)3
【摘要】聚丙烯酰胺凝胶电泳分析结果表明，湿地松健康嫩茎组织过氧化物酶同工酶酶谱中有４条酶带，刺伤组织较健康组织新增加３条酶带。
分别用松色二孢菌华中型（ＨＺ型）代表菌株ＪＨ－１和华南型（ＨＮ型）代表菌株ＢＹ－２接种被刺伤的湿地松嫩茎，接种弱致病力的菌株ＢＹ－２后，感病组织的过氧化物酶同工酶酶谱中比刺伤对照新增加１条酶带；接种强致病力的菌株ＪＨ－１后，感病组织的过氧化物酶同工酶酶谱中较刺伤对照新增加３条酶带。
２个供试菌株在侵染寄主后导致寄主的过氧化物酶同工酶酶谱上出现差异的表现，与它们在形态特征、产孢条件和致病力等方面存在显著差异的表现相同。
【总页数】4页(P225-228)
【关键词】湿地松;松色二孢菌;过氧化物酶同工酶;致病力
【作者】边银丙;周茂繁
【作者单位】华中农业大学植保系
【正文语种】中文
【中图分类】S763.712.4;S763.150.1
【相关文献】
1.湿地松色二孢菌和可可球二孢菌根腐病研究 [J], 钟小平;梁子超
2.国外松枯梢病的松色二孢菌9个菌株生物学特性的研究 [J], 彭星元;苏开君
3.松色二抱菌7个菌株酯酶同工酶的比较研究 [J], 边银丙;周茂繁
4.松色二孢菌酯酶同工酶特性的研究 [J], 边银丙;周茂繁
5.7个松色二孢菌菌株生物学特性的研究 [J], 边银丙;周茂繁
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过氧化物酶同工酶含量测定
实验材料与器材
（一）材料 菠菜叶片（或苜蓿种子）
（二）仪器设备 722分光光度计 烧杯 量筒 移液管 具塞刻度试管
实验试剂
1．标准蛋白溶液：100μg/ ml牛血清白蛋白：称取牛血清白 蛋白25 mg，定容到100ml，取40ml该溶 液定溶到100ml。
2．考马斯亮蓝G-250：称取50 mg考马斯亮蓝G-250，溶于 25ml 95%的乙醇中，加50ml 85%的 磷酸定容到500ml，贮存于棕色试剂 瓶中，常温下可以保存一个月。
实验步骤
（一）标准曲线的绘制 取6支具塞刻度试管，按下表依次加入标准蛋白，向
各管中加入考马斯亮蓝G-250溶液5ml，摇匀，放置5min 左右，用1cm的比色皿在595nm处测定吸光值，以蛋白的 浓度作横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。
表 绘制标准曲线各试剂加入量
管号
1
2
3
4
5
6
标准蛋白质（ml）
考马斯亮蓝G-250（coomassie brilliant blue G-250）与
蛋白质的结合十分迅速，2min左右即可达到平衡，其结合物 在室温下1小时内保持稳定。此法灵敏度高，易于操作，干 扰物较少，是一种比较好的定量方法。其缺点是在蛋白质浓 度太高时线形偏低，且不同来源蛋白质与色素的结合状况有 一定差别。
实验原理 实验材料与器材 实验试剂coomassie brilliant blueG-250）测 定蛋白质酶含量属于染料结合法的一种。该染料在游离状态 下呈红色，在稀酸溶液中当它与蛋白质的疏水区域结合后变 为青色，前者最大吸收值在465nm，后者在595nm。在一定 蛋白质浓度范围内（1～1000μg），蛋白质与色素结合后在 595nm吸光值的大小与蛋白质的浓度呈正比，故可用于蛋白 质的定量测定。
过氧化物酶活性的测定实验报告
过氧化物酶活性的测定实验报告一、实验目的过氧化物酶（Peroxidase，POD）广泛存在于植物、动物和微生物中，与生物体内的多种生理过程密切相关。
本次实验旨在掌握测定过氧化物酶活性的原理和方法，了解过氧化物酶在生物体内的作用和意义。
二、实验原理过氧化物酶能催化过氧化氢氧化酚类或胺类化合物，生成有色产物。
本实验采用愈创木酚作为氢供体，在过氧化物酶的催化下，愈创木酚被氧化生成茶褐色产物。
通过测定反应体系在470nm 处的吸光度变化，可以计算出过氧化物酶的活性。
三、实验材料与仪器1、实验材料新鲜的植物叶片（如菠菜叶）2、实验试剂（1）005mol/L 磷酸缓冲液（pH 55）（2）005mol/L 愈创木酚溶液（3）2% H₂O₂溶液（4）10% 三氯乙酸溶液3、实验仪器（1）分光光度计（2）离心机（3）恒温水浴锅（4）研钵（5）移液器（6）容量瓶（7）试管四、实验步骤1、酶液提取称取 05g 新鲜植物叶片，剪碎后放入研钵中，加入 5mL 005mol/L 磷酸缓冲液（pH 55），研磨成匀浆。
将匀浆转移至离心管中，在 4℃下以 10000r/min 离心 15min，上清液即为酶提取液。
2、反应体系配制取 4 支试管，按下表加入试剂：｜试管编号｜ 005mol/L 磷酸缓冲液（mL）｜ 005mol/L 愈创木酚溶液（mL）｜ 2% H₂O₂溶液（mL）｜酶提取液（mL）｜｜｜｜｜｜｜｜ 1（对照管）｜ 29 ｜ 10 ｜ 01 ｜ 0 ｜｜ 2（测定管）｜ 27 ｜ 10 ｜ 01 ｜ 02 ｜3、反应与测定将对照管和测定管置于 37℃恒温水浴锅中预热 5min，然后向测定管中加入 02mL 酶提取液，迅速摇匀，立即开始计时。
在反应 3min 后，立即向两支试管中加入 1mL 10% 三氯乙酸溶液终止反应。
以对照管为空白，在 470nm 处测定测定管的吸光度值（A₄₇₀）。
4、计算过氧化物酶活性过氧化物酶活性（U/g·min）＝（A₄₇₀×Vₜ）／（W×Vₜ×t）其中，A₄₇₀为测定管的吸光度值；Vₜ 为反应液总体积（mL）；W 为样品鲜重（g）；Vₜ 为测定时取用的酶液体积（mL）；t 为反应时间（min）。
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实验08 植物过氧化物酶同工酶测定 （园盘式凝胶电泳法）
一、原理
聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺(Acr)和交联 剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)在催化剂作用下聚合而 成，具有三维网状结构，其网孔大小可由凝胶 浓度和交联度加以调节。凝胶电泳兼有电荷效 应和分子筛效应。被分离物质由于所载电荷数 量、分子大小和形状的差异，在电泳时会产生 不同的泳动速率而相互分离。
（四）点样 （五）电泳
（六）剥管，放入培养皿中。用一个带有长针头的注射器，吸满 水，将针头沿管壁插入，同时慢慢地将注射器中的水推 出，并不断转动凝胶管，将凝胶管挤脱出来。 （七）染色
取0.5mL联苯胺母液 + 9.3mL H2O +0.2mL 3% H2O2，混匀后倒入盛有凝胶条的培养皿。此时可以看 到胶条上出现蓝色或棕褐色环，即过氧化物酶酶带，约 10min后用自来水冲洗，此时蓝色带会慢慢变为棕褐色 条带。
四、结果
用尺子量出各酶带和溴酚蓝的迁移距离，计 算各同工酶的迁移率，并划出同工酶图谱。
28S 18S
二、材料、设备与试剂
（一 ）实验材料 ：小麦芽。 （二）设备 ：1.冷冻离心机；2.稳流稳压电泳 仪；3. 电泳槽（园盘型）等。 （三）试剂
1.分离胶缓冲液 2.分离胶贮液： 3.过硫酸铵：现配现用。
4.四甲基乙二胺(TEMED)。 5.电极缓冲液：Tris6.0g，Gly（甘氨酸） 28.8g，用水定容至1000mL(pH8.3)，用前稀释 10倍。
6. 3% H2O2。 7. 联苯胺染色母液：联苯胺1g + 冰醋酸 18mL+ H2O 2mL溶解后贮于棕色瓶中。 8.同工酶染色液：配后立即使用。取0.5mL 联苯胺母液 + 9.3mL H2O +0.2mL 3% H2O2。
三、实验步骤
（一）过氧化物酶的提取 （二）电泳槽的安装 （三）分离胶的配制
过氧化物酶是植物体内常见的氧化酶， 植物体内许多生理代谢过程受其同工酶的种 类及活性的调节。同工酶具有不同的迁移速 度。
将电泳后的凝胶置于含有H2O2及联苯胺 的溶液中染色，利用过氧化物酶催化H2O2分 解并把联苯胺氧化成蓝色或棕褐色产物的原 理，出现的蓝色或棕褐色条带即为过氧化物 酶同工酶在凝胶中存在的位置，多条有色带 即构成过氧化物酶同工酶酶谱。