植物过氧化物酶同工酶测
植物过氧化物酶同工酶组丙烯酰胺凝胶圆盆电泳
华南农业大学实验报告专业班次 11农学一班组别201130010110题目植物过氧化物酶同工酶组丙烯酰胺凝胶圆盆电泳姓名梁志雄日期【实验原理】过氧化物酶是植物体内常见的氧化酶，植物体内许多的生理代谢涡阳与过氧化物酶及其同工酶的种类有关，本实验用加有蔗糖的缓冲溶液作为缓冲剂，提取甘蔗叶片中的过氧化物酶同工酶，锁甲的蔗糖是为了增加样品液的相对密度，使点样时能让样品平铺于凝胶表面，有防止其扩散的作用，利用过氧化物酶能催化过氧化氢把联苯胺氧化为蓝色或棕色产物的原理，将经过电泳后的凝胶置于有过氧化氢及联苯胺的溶液中染色，有色部位即为过氧化物酶在凝胶中存在的位置，从而得到过氧化物酶同工酶酶。
【实验仪器和用品】1、实验仪器圆盆电泳槽、直流稳压电泳仪、离心机、恒温水浴锅、脱色摇床、研钵、电子天平2、实验用品烧杯、吸管、试管、试管架、玻璃棒、滴管、微量注射器、长针头注射器、培养皿、洗耳球、蒸馏水瓶、移液枪、大漏斗、滤纸、试剂瓶、烧杯、量筒、离心管、标签纸、PH试纸。
【实验材料和实验试剂】1、实验材料甘蔗叶片2、实验试剂样品提取缓冲液、0.5%（m/V）溴酚蓝、凝胶储备液A、凝胶储备液B、凝胶储备液C、电极缓冲液、POD 同工酶染色储存液。
【实验步骤】1 .凝胶柱的制备将凝胶贮备液 A 、 B 及水按 1 ： 2 ： 1 的比例混合于烧杯中，另量取 4 份的 C 液于另一烧杯中、即A液3ml、B液6ml、C液12ml，。
当准备好带有玻珠乳胶管封底的玻璃管后，可把两烧杯中的溶液混合，轻搅均匀，用长滴管沿玻管壁小心加到玻管中。
胶液应灌到离管口约 3mm 处。
用手指轻弹管壁，将管中胶液可能混有的气泡赶出，然后用滴管在胶液面上小心注入一层 3mm 蒸馏水，以防胶凝结时表面形成弯月面并隔绝空气。
当见到水层与胶液交界处有一清晰界面时，表明胶已聚合。
2 .样品的制备称取 0.5g 甘蔗叶片，加入 2 ~5毫升提取缓冲液，于研钵中研磨成浆状。
几种植物中的过氧化物酶同工酶分析1)
将胶浸入染 色液 中 ５ ０ 神，取 出置 一１ 分
于 永 中＾ 沈 ， 止染 色。 ｀ ＇ 停
将胶 置于醋酸 缓冲液中沁 ２ 分钟， 。 再浸 入染色液中，２℃ 保佩染色 ２ ６ ０ ５ ０分钟 － 后， 取出 ， 水漂洗。
１ 酷酸联苯 ） 胺炸液：２ 克联茉胺溶于 １ 毫升醋酸中， ７ 毫升水。 ８ 加 ２
电泳在冰箱或低于 １ ℃ 的 室 温 下 进 行。 ５
力水至 １０ ｉ 」 ０ｎ１ １ ． 斗 ％ Ｆ 过硫酸 按（ ． 用前配划 、Ｆ Ｔｒ－ ． ｉ 泞檬酸缓冲 液忿 ｓ
１． 呢 ， ４ Ｉｒｓ ５． ８ ＋ 柠 檬 酸 ｉ １ ５
１０ ； ．ｇ
加水至 １ ０ １Ｐ Ｒ９ ０ ｍ， ． ０ Ｈ
＇ｒｓ ．ｑ ｒ ３ ０ ； ｉ ０
Ｔｒｓ ２ ； ｉ６ ｇ ．
甘氨ｌ １・ ； ， 斗斗 ｎ ： ９
甘氨酸 ２０； ． ｋ
至凝胶下端 ０ －１厘米处停止电泳。 电泳 时 ． ５
间约 ９－ １０分钟。 ０ ０ 过氧化物Ｒ 同工醉 的染色鉴定方 法 很 多，
染 色 方 法 染 色
加水至 １０ｒ ，爪 ｝３ 加水至 １０ｍｌ Ｈ ．； ０ ０ ｌ １ ． ： ｎ ００ ， ｈ７ ｐ 使用时杯释 １ 信－ ０ 随用时稀释 ５倍
个过氧化物酶同工酶相对活性的维生素 Ｃ 一联 苯胺染色法阁。 近些年来又较多地采用了丁子
香酚 （ｕｅ ｌ Ｅｇ ｏ ｎ ）一类夭然物作底物的新染
色法［ ９ １ ｃ 近年来， 由于同工酶测定、 分析技术在遗传
１ ）本工 作曾得到龚葵 同志的指导， 特致谢意 ， ２ 黄寿松：西北植物研究所进修人员。 ）
离心（５０．． １ 分钟， ３０ ：ｐｍ）５ ． 取上清液， 混人等
实验9-10 植物过氧化物酶同工酶的测定(凝胶圆盘电泳)
（五）记录并计算： 记录并计算： 观察、记录酶谱， 观察、记录酶谱，并 计算各同工酶的相对 迁移率。 迁移率。
【要点提示】 要点提示】
1. 分离胶聚合时间应控制在 ～60min，聚合过 分离胶聚合时间应控制在30～ ， 快使凝胶太脆易断裂，主要是AP或 快使凝胶太脆易断裂，主要是 或TEMED过 过 量引起；聚合过慢甚至不聚合，可能是AP或 量引起；聚合过慢甚至不聚合，可能是 或 TEMED用量不足或已失效。 用量不足或已失效。 用量不足或已失效 2. 电泳时如果电泳槽盖上有冷凝水，则表示电压 电泳时如果电泳槽盖上有冷凝水， 或电流过大，体系发热，可引起蛋白质变性、 或电流过大，体系发热，可引起蛋白质变性、 凝胶底部断裂等，应注意调整。 凝胶底部断裂等，应注意调整。特别是进入分 离胶后应通过控制电压，调节电流不超过5mA/ 离胶后应通过控制电压，调节电流不超过 管。
（四）染色： 染色： 临用时配制染色液：（ ml ） 临用时配制染色液：（10 ：（ 联苯胺母液 H2O 3% H2O2 0.5 ml 9.3 ml 0.2 ml
将染液倒入盛有凝胶条的试管中（ 将染液倒入盛有凝胶条的试管中（没过 胶条）。约10min后用自来水冲洗。 胶条）。约 后用自来水冲洗。 ）。 后用自来水冲洗
【实验步骤】 实验步骤】
（一）过氧化物酶的提取：取8~12粒发芽 过氧化物酶的提取： 粒发芽 的麦粒，加入1ml H2O 或0.5mol/L Tris的麦粒，加入 HCl缓冲液（pH 6.8），冰浴上研成匀浆。 缓冲液（ ），冰浴上研成匀浆。 缓冲液 ），冰浴上研成匀浆 转入离心管，再用2ml上述溶液冲洗研钵 转入离心管，再用 上述溶液冲洗研钵 壁并全部转入离心管，4000r/min离心 壁并全部转入离心管， 离心10 离心 min，上清液供电泳分析用。 ，上清液供电泳分析用。
过氧化物酶同工酶电泳分析(经典有用)
过氧化物酶同工酶电泳分析实验原理（1）凝胶板由上、下两层胶组成，两层凝胶的孔径不同。
上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。
（2）缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同。
本实验采用碱性系统。
电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl缓冲液。
而分离胶为pH8.9的Tris-HCl缓冲液。
（3）在电场中形成不连续的电位梯度。
在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即电荷效应、分子筛效应和浓缩效应。
在这三种效应的共同作用下，待测物质被很好地分离开来。
下面以本实验要分离的小麦苗过氧化物酶同工酶为例，分别说明三种效应的作用：（1）电荷效应：各种酶蛋白按其所带电荷的种类及数量，在电场作用下向一定电极，以一定速度泳动。
（2）分子筛效应：分子量小，形状为球形的分子在电泳过程中受到阻力较小，移动较快；反之，分子量大、形状不规则的分子，电泳过程中受到的阻力较大，移动较慢。
这种效应与凝胶过滤过程中的情况不同。
（3）浓缩效应：待分离样品中的各组分在浓缩胶中会被压缩成层，而使原来很稀的样品得到高度浓缩。
其原因如下：①由于两层凝胶孔径不同，酶蛋白向下移动到两层凝胶界面时，阻力突然加大，速度变慢。
使得在该界面处的待分离酶蛋白区带变窄，浓度升高。
②在聚丙烯酰胺凝胶中，虽然浓缩胶和分离胶用的都是Tris-HCl缓冲液，但上层浓缩胶为pH 6.7，下层分离胶为pH 8.9。
HCl是强电解质，不管在哪层胶中，HCl几乎都全部电离，Cl－布满整个胶板。
待分离的酶蛋白样品加在样品槽中，浸在pH8.3和Tris-甘氨酸缓冲液中。
电泳一开始，有效泳动率最大的Cl－迅速跑到最前边，成为快离子（前导离子）。
在pH6.7条件下解离度仅有0.1～1％的甘氨酸（pI = 6.0 ）有效泳动率最低，跑在最后边，成为慢离子（尾随离子）。
这样，快离子和慢离子之间就形成了一个不断移动的界面。
在pH6.7条件下带有负电荷的酶蛋白，其有效泳动率介于快慢离子之间，被夹持分布于界面附近，逐渐形成一个区带。
过氧化物酶同工酶的提取、分离
-
.
15
■ 在浓缩胶中的三个主要作用角色：
甘氨酸: pH=8.9 负电荷 pI=6.7 不带电荷
Cl-1:
蛋白质(酶):
小分子
.
大分子
16
■ 浓缩效应：
A
8.0
样 本
浓
缩
6.7
胶
分
离 胶
8.9
B
离子缺乏空间
.
+
C
17
+
5、过氧化物酶活性测定
❖ 以邻甲氧基苯酚（即愈创木酚）为过氧化物酶的底物，
在此酶存在下，H2O2可将邻甲氧基苯酚氧化成红棕 色的4-邻甲氧基苯酚，其反应为：
(2)聚丙烯酰胺凝胶结构上的特点：
① 聚丙烯酰胺的基本结构为丙烯酰胺单体构成的长 链，链与链之间通过甲叉桥联结在一起；
② 链的纵横交错形成三维网状结构，使凝胶具有分 子筛的性质；
③ 网状结构还能限制蛋白质等样品的扩散运动，使 凝胶具有抗对流的作用；
④ 长链富含酰胺基团，使其成为稳定的亲水凝胶； ⑤ 该结构不带电荷，在电场中电渗现象极为微小。
分离胶缓 冲液
分离胶丙 胶贮液
Ap
无离子水
体积比
1
2
4
1
取用量
3
（ml）
6
12
3
胶灌至距梳子齿下端1cm →灌毕→封上一层水加速聚 合→当胶与水出现清晰界限时表明聚合好。
.
27
.
28
2.3 浓缩胶的制备：
按下表制备浓缩胶
试剂名称 浓缩胶缓 浓缩胶丙胶 Ap
冲液
贮液
体积比
1
2
2
取用量
1
太子参过氧化物酶同工酶分析
３ ａｂａ ｐ ｃ ｌ ｏａ Ｐｏ ｕｔ Ｉｓｔｔ ｏ ａｊ Ｃｔ， ａｊ １３ ０ ，Ｃ ｉａ ．Ｙ ｎ ｉｎＳ ｅｉ ｃｌ ｒ ｃ ｎｔｕｅ ｆ ｎｉ ｉ Ｙ ｎｉ ３ ０ １ ｈｎ ） ａＬ ｄ ｓ ｉ Ｙ ｙ
关键词 太子参 ； 过氧化物酶； 亲缘 关 系
中 图 分类 号 ：５ ７ ￥ ６ 文 献标 识码 ： Ａ 文 章 编 号 ： ０ ９ ９ ｛００）５— ０２— ３ １ ６— ６０ ２ １ ０ ０ ３ ０ ０
Ｓ ｕｄ ｎ Ｐｅ ｏ ｉ ａ ｅ Ｉ ｏ ｎ ｙ ｅ ｎ ｅ ｄ ｓｅ ｌ ｒａ ｈ ｔ ｒ ｐｈ ｌ ｔ ｙ ｏ ｒ ｘ ｄ ｓ ｓ ｅ ｚ ｍ ｓ ｉ Ｐｓ ｕ ｏ ｔｌ ｉ ｅ ｅ ｏ ｙ ｌ ａ ａ
Ａｂ ｔ ａ ｔ Ｐｅｏ ｉ ａ ｅ ｉｏ ｎ ｙ ｓｉ ａ ｉｔｅ ｆＰｓｕ ｏ ｔｌ ｒａ ｈ ｔｒｐｈ ｌ ｒ ｎ ｌｚ ｄ ｂ ａ ｓ ｏ ｓｒ ｃ ｒ ｘｄ ｓ ｓ ｅ ｚ ｍｅ ｎ ６ ｖ ｒｅｉｓｏ ｅ ｄ ｓｅｌ ｉ ｅｅｏ ｙ ｌ ｗｅｅ ａ ａ ｙ ｅ ｙ ｍｅ ｎ ｆ ａ ａ
ｐ ｒ ｅ ｄ ｃ ｌｒ ｐａ ｅ ｔｐ ｆ ｐ ｌａ ｒ ｌｍｉ ｅ ｇ ｌｅ ｅ ｔ ｐ ｏ ｅ ｉ． Ｆ ｚ ｙ ｃ ｕ ｔｒ ａ ａ ｙ ｉ ｗ ｓ ｃ ｎ ｕ ｔｄ ｅ ｐ ｎ ｉｕ ａ — ｌｔ ｙ ｅ ｏ ｏ ｙ ｃｙ ａ ｄ ｅ ｌｃｒ ｈ ｒｓｓ ｕ ｚ ｌ ｓ ｎ ｌｓ ａ ｏ ｄ ｃｅ ｏ ｅ ｓ ｂ ｓ ｄ ｏ ｅ ｓ ｌｒ ｙ ｅ ｅ ｑ ｉｎ ｓｏ ｅ ｉ ｅ ｚ ｍｅｚ ｍｏ ｒｍ ． ｓｎ ｅＲ —ｃ ａｎ ｌ ｋ ｍｅ ｏ ｓｍｉ ｒ ａ ｅ ｎ ｔ ｉ ａｉ ｏ ｆ ｃ ｅ ｔ ｆ ｓ ｎ ｙ ｙ ｇ ａ ｕ ｉ ｇ ｔ ｈ ｍｉ ｔ ｌ ｈ ｔ ｏ ｈ ｈ ｉ ｎ ｔ ｄ ｉ ｈ ｉ ｌ － ａ
过氧化物酶同工酶含量测定
实验材料与器材
（一）材料 菠菜叶片（或苜蓿种子）
（二）仪器设备 722分光光度计 烧杯 量筒 移液管 具塞刻度试管
实验试剂
1．标准蛋白溶液：100μg/ ml牛血清白蛋白：称取牛血清白 蛋白25 mg，定容到100ml，取40ml该溶 液定溶到100ml。
2．考马斯亮蓝G-250：称取50 mg考马斯亮蓝G-250，溶于 25ml 95%的乙醇中，加50ml 85%的 磷酸定容到500ml，贮存于棕色试剂 瓶中，常温下可以保存一个月。
实验步骤
（一）标准曲线的绘制 取6支具塞刻度试管，按下表依次加入标准蛋白，向
各管中加入考马斯亮蓝G-250溶液5ml，摇匀，放置5min 左右，用1cm的比色皿在595nm处测定吸光值，以蛋白的 浓度作横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。
表 绘制标准曲线各试剂加入量
管号
1
2
3
4
5
6
标准蛋白质（ml）
考马斯亮蓝G-250（coomassie brilliant blue G-250）与
蛋白质的结合十分迅速，2min左右即可达到平衡，其结合物 在室温下1小时内保持稳定。此法灵敏度高，易于操作，干 扰物较少，是一种比较好的定量方法。其缺点是在蛋白质浓 度太高时线形偏低，且不同来源蛋白质与色素的结合状况有 一定差别。
实验原理 实验材料与器材 实验试剂coomassie brilliant blueG-250）测 定蛋白质酶含量属于染料结合法的一种。该染料在游离状态 下呈红色，在稀酸溶液中当它与蛋白质的疏水区域结合后变 为青色，前者最大吸收值在465nm，后者在595nm。在一定 蛋白质浓度范围内（1～1000μg），蛋白质与色素结合后在 595nm吸光值的大小与蛋白质的浓度呈正比，故可用于蛋白 质的定量测定。
实验二 过氧化物酶同工酶的提取、分离
实验二过氧化物酶同工酶的提取、分离苟亚峰摘要：本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离小麦幼苗过氧化物酶同工酶，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定玉米幼苗过氧化物酶同工酶，实验结果显示玉米幼苗中至少含有5种过氧化物同工酶。
关键词：过氧化物同工酶；PAGE；电泳分离引言同工酶是指催化同一种化学反应，但酶的分子结构组成却有所不同的一组酶。
同工酶与生物的遗传，生长发育，代谢调节及抗性等都有一定的关系，如过氧化物酶在细胞代谢过程中与呼吸作用，光合作用，及生长素的氧化等都有关系，测定POD活性或其同工酶，可以反映某一时期植物体内代谢变化。
电泳(electrophoresis，简称EP ) 指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。
1937年瑞典科学家Tiselius 成功地将血清蛋白质分成清蛋白、α1、α2、β和γ球蛋白5个主要成分，由于他的突出贡献，1948年荣获诺贝尔奖。
50年代，先后出现了以滤纸、醋酸纤维素薄膜、淀粉及琼脂作为支持物的电泳技术。
60年代，出现了聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，在此基础上发展了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、双向电泳和印迹转移电泳等技术。
这些技术具有设备简单，操作方便，分辨率高等优点。
聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯胺凝胶作为载体的一种区带电泳。
这种凝胶是由丙烯酰胺单体（Acr）和交联剂N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下聚合而成的，Acr和Bis在具有自由基团体系时，就会聚合。
引发产生自由基的方法有两种：（1）化学法：引发剂是过硫酸铵(AP)，催化剂N、N、N’、N’-四甲基乙二胺（TEMED），它的碱基催化AP产生自由硫酸基，其氧原子激活丙烯酰胺单体形成单体长链。
化学聚合形成的凝胶孔径较小，且重复性好，用来制备分离胶；（2）光聚合法：光聚合法的催化剂是核黄素（VB2），光聚合形成的凝胶孔径较大，且不稳定，适于制备大孔径的浓缩胶。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
植物过氧化物酶同工酶测定
（园盘式凝胶电泳法）
一、原理
聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺(Acr)和交联 剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)在催化剂作用下聚合而 成，具有三维网状结构，其网孔大小可由凝胶 浓度和交联度加以调节。凝胶电泳兼有电荷效 应和分子筛效应。被分离物质由于所载电荷数 量、分子大小和形状的差异，在电泳时会产生 Desig不ned b同y XK的Wan泳g 动速率而相互分离。
（四）点样 Designed（by X五K W）an电g 泳
5
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
（六）剥胶 电泳完毕，将电泳槽取出，倒去缓冲液，取下凝胶
管，放入培养皿中。用一个带有长针头的注射器，吸满 水，将针头沿管壁插入，同时慢慢地将注射器中的水推 出，并不断转动凝胶管，将凝胶管挤脱出来。 （七）染色
1
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
过氧化物酶是植物体内常见的氧化酶， 植物体内许多生理代谢过程受其同工酶的种 类及活性的调节。同工酶具有不同的迁移速 度。
将电泳后的凝胶置于含有H2O2及联苯胺 的溶液中染色，利用过氧化物酶催化H2O2分 解并把联苯胺氧化成蓝色或棕褐色产物的原 理，出现的蓝色或棕褐色条带即为过氧化物 酶同工酶在凝胶中存在的位置，多条有色带 Designe即d by构XK W成ang过氧化物酶同工酶酶谱。
4.四甲基乙二胺(TEMED)。 5.电极缓冲液：Tris6.0g，Gly（甘氨酸） 28.8g，用水定容至1000mL(pH8.3)，用前稀释 10倍。 6. 3% H2O2。 7. 联苯胺染色母液：联苯胺1g + 冰醋酸 18mL+ H2O 2mL溶解后贮于棕色瓶中。 8.同工酶染色液：配后立即使用。取0.5mL 联苯胺母液 Designed by XK Wang + 9.3mL H2O +0.2mL 3% H2O2。
28S 18S
Designed by XK Wang
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
Designed by XK Wang
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
Designed by XK Wang
取0.5mL联苯胺母液 + 9.3mL H2O +0.2mL 3% H2O2，混匀后倒入盛有凝胶条的培养皿。此时可以看 到胶条上出现蓝色或棕褐色环，即过氧化物酶酶带，约 10min后用自来水冲洗，此时蓝色带会慢慢变为棕褐色
Designed by XK Wang
条带。 6
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
四、结果
用尺子量出各酶带和溴酚蓝的迁移距离，计 算各同工酶的迁移率，并划出同工酶图谱。
Designed by XK Wang
7
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
Designed by XK Wang
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
Designed by XK Wang
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
2
资料仅供Байду номын сангаас考,不当之处，请联系改正。
二、材料、设备与试剂
（一 ）实验材料 ：小麦芽。 （二）设备 ：1.冷冻离心机；2.稳流稳压电泳 仪；3. 电泳槽（园盘型）等。 （三）试剂
1.分离胶缓冲液 2.分离胶贮液： 3.过硫酸铵：现配现用。
Designed by XK Wang
3
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
4
三、实验步骤 资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
（一）过氧化物酶的提取 （二）电泳槽的安装 （三）分离胶的配制
先准备约6支干燥、洁净的玻璃管，将下端用堵头封闭， 防于试管架上备用。按分离胶缓冲液∶分离胶贮液∶H2O∶过 硫酸铵溶液=1.5mL∶3mL∶1.5mL∶6mL的比例吸取各溶液 至小烧杯中，然后加入一滴四甲基乙二胺（TEMED），混 合均匀，用尖嘴滴管灌吸取混合好的胶液并灌注到玻璃管中， 直至胶液至玻管的刻度线处(如有气泡应设法排除)，然后沿 玻管内壁在胶面上缓慢加注0.5cm的水层，约30min左右， 当见到水层底下有一清楚界面时，表明胶已聚合。倒去水层， 或用滤纸条吸干水分。