实验二 过氧化物酶同工酶的提取、分离
(整理)生化实验分析
果蔬成分生化分析果蔬成分的分析主要分为四个方面：维生素C含量的测定、总糖和还原糖含量的测定、蛋白质含量的测定、过氧化物酶的分析。
总体从实验目的、实验原理、实验试剂、实验结果和分析的角度进行分析一．实验目的：1、掌握微量测定维生素C的方法和技术。
2、了解果蔬中维生素C含量。
3、掌握总糖和还原糖含量的测定方法。
4、掌握蛋白质测定的方法和技术。
5、了解果蔬中蛋白质的含量。
6、了解聚丙烯酰胺凝胶的制作过程及结构特点。
二．实验原理：1.还原型维生素C可被氧化型2，6-二氯酚靛酚（下面简称染料）所氧化，成为氧化型维生素C。
氧化型染料在中性或碱性溶液中呈蓝色，在酸性溶液中呈红色。
成为还原型后为无色。
用氧化型染料来滴定还原型维生素C，当滴至全部还原型维生素C被氧化后，在稍滴一点呈微红色为终点。
滴定用去染料量与样品中还原型维生素C量成正比。
（此法虽简单迅速，但氧化型染料亦能使其他还原型物质氧化，所以有一定缺点。
）2.蒽酮比色法是一个快速而简便的定糖方法。
其原理：糖类在较高温度下可被硫酸脱水成糠醛或糠醛衍生物，再与蒽酮缩合成蓝色化合物，在620nm处有最大吸收。
多糖为非还原糖，可用酸将没有还原性的多糖和寡糖彻底水解成具有还原性的单糖，再利用还原糖的性质进行测定，这样就可分别求出总糖和还原糖的含量。
3. 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质-染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。
考马斯亮蓝G-250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。
考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色，最大光吸收在465nm，当它与蛋白质结合后变为蓝色，最大光吸收在595nm。
在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质-染料复合物在波长为595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
蛋白质和考马斯亮蓝G-250结合，在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1小时内保持稳定。
聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶
7、绘制酶谱条带，并计算各同工酶的迁移率
[结果计算]： a Rf值 = ----b
a
b
四、注意事项
安装玻璃夹心槽时，两片玻璃要干燥，有机玻璃条要夹平并用 胶布密封好。 分离胶或浓缩胶配制好的混合液要马上进行灌胶，以免溶液聚 合成胶。 过硫酸铵要现用现配。 分离胶灌好，上层要覆盖一层水层，避免胶氧化，同时使分离 胶胶面平整。 电泳仪连接电泳槽后，通电要严格控制电泳，每个电泳槽的电 流不能超过10mA,电压不能超过170V，电压过高会导致玻璃板 裂开。 染料必须现用现配。
电荷因素 蛋白质分子形状和大小相同，所带电荷性质和数量不同 分子大小 蛋白质分子形状和所带电荷性质和数量相同，分子大小不同 分子形状 蛋白质分子所带电荷性质和数量相同，分子形状不同
聚丙烯酰胺凝胶电泳的三种效应: 1) 浓缩效应、2) 电荷效应、3) 分子筛效应
电泳过程示意图
A为电泳前3层凝胶排列顺。B显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢 离子之间被浓缩成极窄的区带。C显示蛋白质样品分离成数个区带。
五、思考题
简述“过氧化物酶同工酶聚丙烯酰胺凝胶 电泳”实验中所用的过硫酸铵、四甲基乙 二胺、蔗糖、溴酚蓝、H2O2等试剂的作用 是什么？
TEMED 丙烯酰胺 + 甲叉双丙烯酰胺------------------聚丙烯酰胺凝胶 Ap (三维网状结构)
AP-TMTED催化体系
TEMED催化AP生成硫酸自由基：
S2O82－
¯ 2SO4·
硫酸自由基的氧原子激活Acr单体并形成单体长链：
Bis将单体长链间连成网状结构：
通过改变凝 胶浓度及交 联度来调节 凝胶的孔径， 具有良好的 分子筛效应。
烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶
实验八 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶一、实验目的１ 学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。
２ 掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板（及同盘）电泳的操作技术。
３ 掌握同工酶定义、理化性质的差异，了解过氧化物酶的染色原理。
４ 掌握过氧化物酶的活性的测定。
二 实验原理聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（Acr ）和交联剂（即共聚体的N,N －甲叉双丙烯酰胺 Bis ）在加速剂（N,N,N ’,N ’－四甲基乙二胺 TEMED ）和催化剂（过硫酸胺 (NH 4)4S 2O 8 简称AP ）的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。
（一）聚丙烯酰胺凝胶聚合原理及相关特性１ 聚合反应聚丙烯酰胺是由Acr 和Bis 在催化剂（AP ）或核黄素（C 17H 20O 6N 4）和加速剂（TEMDA ）的作用下聚合而成的三维网状结构。
催化剂和加速剂的种类很多，目前常用的有２种催化体系：① AP-TEMED 属化学聚合作用② 核黄素－TEMED 属光聚合作用２ 凝胶孔径的可调性及其相关性质① 凝胶性能与总浓度及交联度的关系凝胶的孔径、机械性能、弹性、透明度、粘度和聚合程度取决于凝胶总浓度和Acr 与Bis 之比： 00100a bT m +=⨯ a:b<10 脆硬乳白交联度： 00100bc a b =⨯+ a:b>100糊状易断② 凝胶浓度与孔径的关系T （Acr 和Bis 总浓度）增加 孔径减小 移动颗粒穿过网孔阻力增加③ 凝胶浓度与被分离物分子量的关系分子量增加 阻力增加 移动速度减慢。
同时还与分子形状及分子电荷有关系。
在操作时，可以选用007.5凝胶。
因为生物体内大多数蛋白质在此范围内电泳均可取得满意的结果。
３ 试剂对凝胶聚合的影响水中金属离子或其他成分对凝胶电泳的电泳速度、分离效果等有影响。
（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE ）原理根据有无浓缩效应可分为：连续系统：电泳体系中由于缓冲液PH 值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场中主要靠电荷及分子筛效应。
过氧化物酶同工酶含量测定
实验材料与器材
（一）材料 菠菜叶片（或苜蓿种子）
（二）仪器设备 722分光光度计 烧杯 量筒 移液管 具塞刻度试管
实验试剂
1．标准蛋白溶液：100μg/ ml牛血清白蛋白：称取牛血清白 蛋白25 mg，定容到100ml，取40ml该溶 液定溶到100ml。
2．考马斯亮蓝G-250：称取50 mg考马斯亮蓝G-250，溶于 25ml 95%的乙醇中，加50ml 85%的 磷酸定容到500ml，贮存于棕色试剂 瓶中，常温下可以保存一个月。
实验步骤
（一）标准曲线的绘制 取6支具塞刻度试管，按下表依次加入标准蛋白，向
各管中加入考马斯亮蓝G-250溶液5ml，摇匀，放置5min 左右，用1cm的比色皿在595nm处测定吸光值，以蛋白的 浓度作横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。
表 绘制标准曲线各试剂加入量
管号
1
2
3
4
5
6
标准蛋白质（ml）
考马斯亮蓝G-250（coomassie brilliant blue G-250）与
蛋白质的结合十分迅速，2min左右即可达到平衡，其结合物 在室温下1小时内保持稳定。此法灵敏度高，易于操作，干 扰物较少，是一种比较好的定量方法。其缺点是在蛋白质浓 度太高时线形偏低，且不同来源蛋白质与色素的结合状况有 一定差别。
实验原理 实验材料与器材 实验试剂coomassie brilliant blueG-250）测 定蛋白质酶含量属于染料结合法的一种。该染料在游离状态 下呈红色，在稀酸溶液中当它与蛋白质的疏水区域结合后变 为青色，前者最大吸收值在465nm，后者在595nm。在一定 蛋白质浓度范围内（1～1000μg），蛋白质与色素结合后在 595nm吸光值的大小与蛋白质的浓度呈正比，故可用于蛋白 质的定量测定。
大豆过氧化物酶的提取与分离纯化研究
2018年8月m i tJournal of Green Science and Technology第16期大豆过氧化物酶的提取与分离纯化研究刘力(武汉华测检测技术有限公司食品实验室，湖北武汉430223)摘要：利用超声辅助法提取大豆过氧化物酶（P O D酶），对大豆不同部位P O D酶含量进行了比较，采用硫酸铵一丙酮沉淀法对P O D酶进行了分离纯化，结果得到的大豆胚芽P O D酶的比活力是豆壳P O D酶的2. 61倍，较豆壳而言大豆胚芽为P O D酶提取的最佳原料。
经硫酸铵沉淀、丙酮沉淀和硫酸锌除杂后，大豆P O D 酶活力为13765.00U/m L,蛋白质浓度为3. 11m g/m L,酶的比活力为4432. 52U/m g,R z值 1. 59,且纯化倍数达38. 30。
同时，经S D S—P A G E电泳分析后，可推断出该大豆P O D酶的分子量大约在65〜95k b之 间，且只出现了一个条带，可看出纯化效果较好。
关键词：过氧化物酶;提取；分离纯化中图分类号：Q814文献标识码：A文章编号=1674-9944(2018)16-0256-041引言大豆过氧化物酶（POD)是从豆壳或大豆胚芽中提 取的一种活性很高的过氧化物酶，是由单一肽链和卟琳 构成的血红素蛋白，脱辅基蛋白分子需与血红素结合能 构成全酶[1]。
分子量为37000D,300多个氨基酸残基组 成，等电点为3.9,是酸性蛋白质[2]。
大豆POD酶由两 个结构域组成，中间是血红素辅基，Kamal[3]等推出由 77%的螺旋、16%的|3 —折叠和p—转角及其它结构 组成其结构域。
大豆过氧化物酶和辣根过氧化物酶的 结构及作用机理有许多相似之处，都属于植物过氧化物 酶超家族的D I类酶[4]。
它们具有相似的三维折叠模式，氨基酸序列有57%的同源性，两者都含有1个色氨酸，2个Ca2+，4个二硫键和8个多糖。
现在，对辣根过氧 化物酶的研究较成熟，大豆过氧化物酶的研究甚少。
过氧化物酶同工酶含量测定
实验材料与器材
（一）材料 菠菜叶片（或苜蓿种子） （二）仪器设备 722分光光度计 烧杯 量筒 移液管 具塞刻度试管
实验试剂
1．标准蛋白溶液：100g/ ml牛血清白蛋白：称取牛血清白 蛋白25 mg，定容到100ml，取40ml该溶 液定溶到100ml。 100ml 2．考马斯亮蓝G-250：称取50 mg考马斯亮蓝G-250，溶于 25ml 95%的乙醇中，加50ml 85%的 磷酸定容到500ml，贮存于棕色试剂 瓶中，常温下可以保存一个月。
1
2
3
4
5
6
0 1.0 0
0.2 0.8 20
0.4 0.6 40
0.6 0.4 60
0.8 0.2 8度试管，分别加入实验一的4、7、8步中的样品(每一 样品2平行样)0.1ml,各加用蒸馏水0.9ml，向各管中加入考马斯亮蓝G250溶液5ml，充分摇匀，放置2min左右，用1cm的比色皿在595nm处 测定吸光值，从标准曲线上查得样品中蛋白的含量。 结果计算
考马斯亮蓝G-250（coomassie brilliant blue G-250）与 蛋白质的结合十分迅速，2min左右即可达到平衡，其结合物 在室温下1小时内保持稳定。此法灵敏度高，易于操作，干 扰物较少，是一种比较好的定量方法。其缺点是在蛋白质浓 度太高时线形偏低，且不同来源蛋白质与色素的结合状况有 一定差别。
过氧化物酶同工酶含量测定
制作人：王瑞刚
内蒙古农业大学 生物化学与分子生物学实验教学中心
实验原理 实验材料与器材 实验试剂 实验步骤
实验原理
考马斯亮蓝G-250（coomassie brilliant blueG-250）测 定蛋白质酶含量属于染料结合法的一种。该染料在游离状态 下呈红色，在稀酸溶液中当它与蛋白质的疏水区域结合后变 为青色，前者最大吸收值在465nm，后者在595nm。在一定 蛋白质浓度范围内（1～1000g），蛋白质与色素结合后在 595nm吸光值的大小与蛋白质的浓度呈正比，故可用于蛋白 质的定量测定。
植物过氧化物酶的提取、
试剂
考马斯亮蓝试剂； 标准和待测蛋白质溶液
器材
试管及试管架， 移液管（0.1ml及5ml），UV－ 2000型分光光度计。
操作方法：取6支试管，按下表制定标准曲线。
试管编号 0.1mg/ml 标准蛋白溶液/ml 0.15mol/L NaCl/ml 每管中蛋白质浓度μ g/ml 考马斯亮蓝 G250 溶液 A595nm 0 0 1.0 0 1 0.2 0.8 20 2 0.4 0.6 40 5ml 3 0.6 0.4 60 4 0.8 0.2 80 5 1.0 0 100
四、植物过氧化物同工酶电泳技术
实验原理 同工酶（isozymes）是指作用于底物相似或完全相同的 酶的不同分子形式，即催化同一种反应而结构不同的一 族酶。它们是受遗传体系决定的酶的不同分子形式。利 用凝胶电泳技术（PAGE）可以将它们分开，用专一的 作用底物和特殊染料，把需要分析的酶染色，在胶柱上 呈现同工酶谱。 实验目的 通过实验掌握植物同工酶实验技术，了解植物同工酶分 析在遗传学研究中的意义。 着重掌握过氧化物酶的提取，电泳与染色技术和分析方 法。
2010年9月
一、植物过氧化物酶的提取
目的要求 学习制备植物过氧化物酶粗酶液的原理和方法 为后续实验提供酶液。 器材与仪器 电子天平； 冰冻高速离心机； 可见光分光光度计； 电动玻璃匀浆机等。 试剂 20mM KH2PO4， 100mM PBS：取0.2M 的Na2HPO4 12.3ml与0.2M的 NaH2PO4 87.7ml混合。加入100ml水稀释即成。
三、植物过氧化物酶活性的测定（比色法）
原理
过氧化物酶的分离与测定
廊坊师范学院生物大分子的分离与纯化题目：过氧化物酶同工酶的分离及活性测定姓名：赵翔宇指导教师：侯志敏系别：生物专业：生物技术年级：2008级生物技术完成日期2010年12月22日过氧化物酶同工酶的分离及活性测定摘要：以大豆、绿豆为原料，通过不连续的聚丙烯酰胺凝胶电泳将其中的过氧化物酶分离，并通过分光光度计测定其活力。
关键词：大豆、绿豆过氧化物酶聚丙烯酰胺凝胶分光光度计目录1 前言 (4)1.1电泳 (4)1.2聚丙烯酰胺凝胶 (4)1.3过氧化物酶 (5)1.4研究目的及意义 (5)2 材料与方法 (6)2.1 实验材料 (6)2.2 主要仪器设备 (6)2.3 试剂配方 (6)2.4 实验设计 (8)2.4.1实验实施步骤 (8)2.4.1.1.过氧化物酶的粗提取 (8)2.4.1.2聚丙烯酰胺凝胶的制备 (8)2.4.1.3聚丙烯酰胺凝胶电泳 (9)2.4.2过氧化物酶活力的测定 (9)3 结果分析 (10)4致谢 (11)5参考文献 (11)1 前言1.1电泳带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动，这种现象称为电泳。
用电泳技术分离、分析蛋白质、酶、核酸等生物大分子，有较高的分辨率，目前已成为生物科学研究中必不可少的手段之一。
凡能影响溶液粘度η的因素如温度，影响分子带电量q及解离度a的因素如pH的改变，都会对迁移率产生影响。
因此，电泳应尽可能在恒温条件下进行。
并选用一定pH的缓冲液。
同时，所选用的pH以能扩大各种被分离物质所带电荷量的差异为好，以利于分离各种成分。
迁移率与粒子的大小（r）有关，非球形粒子（如DNA）在电泳过程中会受到更大的阻力，即粒子的移动速度还与粒子形状有关。
另外，迁移率还受电渗现象的影响。
所谓电渗是指在电场中，液体对于固体支持物的相对移动。
例如在纸电泳中，由于滤纸（纤维素）上带有负电荷，因感应相吸而使与滤纸相接触的水溶液带正电荷，从而使液体向负极移动，带动着本来是向负极泳动的物质以更快的速度移动。
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实验二过氧化物酶同工酶的提取、分离
苟亚峰
摘要：本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离小麦幼苗过氧化物酶同工酶，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定玉米幼苗过氧化物酶同工酶，实验结果显示玉米幼苗中至少含有5种过氧化物同工酶。
关键词：过氧化物同工酶；PAGE；电泳分离
引言
同工酶是指催化同一种化学反应，但酶的分子结构组成却有所不同的一组酶。
同工酶与生物的遗传，生长发育，代谢调节及抗性等都有一定的关系，如过氧化物酶在细胞代谢过程中与呼吸作用，光合作用，及生长素的氧化等都有关系，测定POD活性或其同工酶，可以反映某一时期植物体内代谢变化。
电泳(electrophoresis，简称EP ) 指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。
1937年瑞典科学家Tiselius 成功地将血清蛋白质分成清蛋白、α1、α2、β和γ球蛋白5个主要成分，由于他的突出贡献，1948年荣获诺贝尔奖。
50年代，先后出现了以滤纸、醋酸纤维素薄膜、淀粉及琼脂作为支持物的电泳技术。
60年代，出现了聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，在此基础上发展了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、双向电泳和印迹转移电泳等技术。
这些技术具有设备简单，操作方便，分辨率高等优点。
聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯胺凝胶作为载体的一种区带电泳。
这种凝胶是由丙烯酰胺单体（Acr）和交联剂N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下聚合而成的，Acr和Bis在具有自由基团体系时，就会聚合。
引发产生自由基的方法有两种：（1）化学法：引发剂是过硫酸铵(AP)，催化剂N、N、N’、N’-四甲基乙二胺（TEMED），它的碱基催化AP产生自由硫酸基，其氧原子激活丙烯酰胺单体形成单体长链。
化学聚合形成的凝胶孔径较小，且重复性好，用来制备分离胶；（2）光聚合法：光聚合法的催化剂是核黄素（VB2），光聚合形成的凝胶孔径较大，且不稳定，适于制备大孔径的浓缩胶。
1.材料与方法
1.1实验材料、实验试剂与仪器
1.1.1实验材料
小麦苗，玉米苗
1.1.2实验仪器与试剂
1.1.
2.1 实验仪器
（1）垂直板电泳装置（电泳槽，玻璃板，胶条，电泳梳子，制胶架等）；
（2）稳流稳压电泳仪；
（3）高速冷冻离心机；
（4）电子天平；
（5）电冰箱；
（6）瓷盘、微量进样器；
1.1.
2.2 实验试剂
（1）1N HCl：用12N的浓盐酸来配制，100ml；
（2）分离胶缓冲液（pH8.9 Tris-HCl缓冲液）：取1N HCl 24ml，Tris（三羟甲基氨基甲烷）18.4g，TEMED（四甲基乙二胺）0.14ml，用蒸馏水溶解后定容至50ml；
（3）浓缩胶缓冲液（pH6.7 Tris-HCl缓冲液）：取1NHCl 24ml，Tris 2.99g，TEMED 0.24ml，用蒸馏水溶解后定容至50ml；
（4）分离胶贮液：Acr（丙烯酰胺）14.0g, Bis（甲叉双丙烯酰胺）0.368g, 用水溶解后定容至50ml；
（5）浓缩胶贮液：Acr 5.0g，Bis 1.25g,用水溶解后定容至50ml。
（6）过硫酸铵溶液(NH4)2S2O8（Ap）：0.3g 过硫酸铵溶于蒸馏水，定容至100ml（当天配制）；
（7）核黄素溶液：核黄素（VB2）2 mg溶于蒸馏水，定容至50ml ；
（8）电极缓冲液：（pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液），Tris 6g，甘氨酸28.8g，溶于蒸馏水后定容至1000ml，用时稀释10倍。
（9）样品提取液（pH8.0 Tris-HCl 缓冲液）：Tris 12.1g溶于蒸馏水定容至1000ml，以1N HCl调节pH=8.0；
（10）40%蔗糖；
（11）0.5%的溴酚蓝：0.5g溶于100ml无离子水；
（12）过氧化物酶同工酶联苯胺染色液：0.5g联苯胺加30ml无水乙醇，再加50ml 1.5M乙酸钠及50ml 1.5M乙酸，加蒸馏水375ml，染色前加25~30滴H2O2原液。
联苯胺是致癌物质，称取时应戴手套。
1.2 方法与步骤
1.2.1 凝胶的制备
1.2.1.1 分离胶的制备
按体积比1:2:4:1，分别取分离胶缓冲液，分离胶丙胶贮液，Ap和去离子水混合制备分离胶，灌胶距梳子下端1cm后封上一层水加速聚合，当胶与水出现清晰界限时表明聚合好。
1.2.1.2 浓缩胶的制备
按体积比1:2:1:4，分别取浓缩胶缓冲液，浓缩胶丙胶贮液，核黄素溶液和蔗糖混合制备浓缩胶。
灌胶前用滤纸吸干水，灌胶后插入梳子，光照，当胶色由黄色变为白色表明聚合好。
1.2.2 酶液的制备
称取幼苗0.5g ，加样品提取液1ml ，于冰浴中研成匀浆，然后以2ml提取液分几次洗入离心管，在高速离心机上以8000r/min，离心10min 后倒出上清液，加入等量加样缓冲液，低温放置待用。
1.2.3 电泳
取出胶板下端胶条，用滤纸搽净凡士林油，将胶板固定在电泳槽上（凹板一侧向内），上下槽装电极缓冲液。
轻拔梳子，用微量进样器点样，每孔约30μl。
接通电源，稳流后调节电流到每孔1mA左右，当溴酚蓝前沿进入分离胶后，可适当加大电流，待前沿下行到距离末1cm处，停止电泳。
1.2.4 剥胶、固定、染色
将凝胶板取下，翻入装水瓷盘中，剥下胶片并浸洗两次，倒去水后加入固定液10min，再倒去固定液加入联苯胺显色剂，观察记录。
2. 实验结果
实验结果见下图：
玉米过氧化物同工酶PAEG图谱
由上图可以看出玉米幼苗中至少含有5种过氧化物同工酶。