第四章-酶的提取与分离纯化汇总

把酶从生物组织或细胞中以溶解状态释放 出来的过程，即将尽可能多的酶，尽量少的杂 质从原料中引入溶液。
提取原则
a. 相似相溶。 b. 远离等电点的pH值，溶解度增加。
提取方法：
（一）盐溶液提取 常用稀盐（常用NaCl）溶液（盐溶），
对酶稳定性好、溶解度大 ，最常用。 （二）酸、碱溶液提取 （三）有机溶剂提取
酶纯化的基本原则：
①建立一个方便灵敏的分析方法；
②选择有效的纯化方法，尽可能减少纯化 步骤；
③常在低温（4℃）条件下进行纯化，以避 免酶的变性。
第一节 细胞破碎
（一）细胞壁组成
各种微生物细胞壁的结构与组成
微生 物
壁厚 /nm
层次
主要 组成
革兰氏阳性 革兰氏阴性 放线
细菌
细菌
菌
15 ~ 50
10 ~ 13 同G+
适用于：蛋白质溶液原来体积已经很大，而要 达到的盐浓度又很高时。
实际使用时，可直接查表 （各种饱和度下 需加固体硫酸铵的量）。
调整硫酸铵溶液饱和度计算表
盐析操作
低饱和度：饱和溶液滴加法。易于迅速混合均匀，一般终 饱和度不超过40％。
高饱和度：固体盐添加法。不会大量增加溶液体积。 1）固体硫酸铵充分研细，温和搅拌中缓慢加入。 2）冰箱中（4℃）放置过夜，待沉淀完全后高速离心。 3）沉淀再溶解后可用超滤（ultrafiltration） 、透析
（二） 有机溶剂沉淀（降低介电常数）
利用酶等蛋白质在有机溶剂中的溶解度不 同而使之分离的方法。 1. 沉淀机理
降低溶液的介电常数 部分地引起蛋白质脱水 2. 常用有机溶剂 乙醇、丙酮、甲醇，用量一般为酶液体积的2 倍左右，终浓度为70%。
3.优缺点：
优点：1）分辨率比盐析法高 2） 沉淀不需脱盐 3）溶剂易蒸发，沉淀易离心
②中和电荷
不同蛋白质分子量、表面电荷不同，在不同 盐浓度下沉淀，逐渐增大盐浓度，不同蛋白 质先后析出，称分段盐析。
2. 盐析用盐
1）中性盐的选择 常用（NH4）2SO4
2) 调整盐浓度的方式
a. 饱和溶液法（添加饱和硫酸铵溶液）
适用于：蛋白质溶液体积不太大，而达到的盐浓 度又不太高时。
b. 添加固体硫酸铵
（dialysis）或层析（chromatography）方法脱盐。
3. 离子强度和种类（介绍盐析常数）
蛋白质溶解度与盐浓度之间的关系：
log S log S0 Ks I
I：离子强度 S：离子强度为I时的蛋白质的溶解度（g/L） S0：离子强度为0时蛋白质的溶解度（g/L） Ks：盐析常数，是与蛋白质和盐有关的特性常数。
第四章 酶的提取与分离纯化
预处理（pretreatment）：包括固液分离和细胞破碎
（分离胞内产物）等。
初步纯化（rough fractionation）（提取）：除去
与目的产物性质差异很大的杂质。
高度纯化（fine fractionation）（精制）：除去与
产物性质相似的杂质。
浓缩与干燥（concentration and desiccation） （成品加工）:使酶与溶剂分离的过程。
⑴ 热变性
⑵ pH变性
⑶ 有机溶剂变性
举例：牛红细胞提取Cu，Zn－SOD的生产工艺：
收集
新鲜牛血 除血浆
离心
浮选
溶血
红细胞
干净红细胞
2％NaCl
去血红蛋白
溶血液 乙醇、氯仿
上清
分级沉淀 丙酮
热变性
沉淀物 70℃ SOD粗酶液
Ks代表盐析效率 ，其含义是随着盐浓度的增加，蛋 白质溶解度降低的速度，Ks越大盐析效果越好。
当温度和pH一定时，S0对于某一溶质是 常数，用β表示，盐析方程式可改写为：
log S = β- Ks I 两种盐析法： Ks分段盐析法 ：在一定的pH和温度条件下， 通过改变离子强度或盐浓度（即改变I值）使 不同酶先后沉淀的方法。 β分段盐析法 ：在一定盐和离子强度下，通 过改变溶液的pH及温度的沉淀方法。
酵母菌 100 ~ 300
霉菌 100 ~ 250源自单层肽聚糖 (40% ~ 90%)
多糖 胞壁酸 蛋白质 脂多糖 (1%〜2%)
多层
肽聚糖 (5% ~ 10%)
脂蛋白 脂多糖 (11% ~ 22%)
磷脂 蛋白质
多层
多层
葡聚糖(30% ~ 40%) 多聚糖
甘露聚糖(30%) (80% ~ 90%)
几丁质(1% ~ 2%)
（四）复合沉淀法
1. 作用机理： 与有机溶剂类似 ，是发展较快的一种新方法。
2. 沉淀剂： 常用聚乙二醇 （Polyethyene glycol，简写 PEG 多用分子量为6000～20000的 PEG ）、单宁等
（五）选择性变性沉淀法
选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白质变性 沉淀而不影响所需蛋白质的方法。
向蛋白质或酶的水溶液中加入中性盐，可产 生两种现象：
1) 盐溶（salting in） ： 低浓度的中性盐增加蛋白质的溶解度。 2) 盐析（salting out） ： 高浓度的中性盐降低蛋白质的溶解度。
蛋白质的盐析
盐溶
盐析
离子强度 硫酸铵对马血红蛋白的溶解度的影响
原因：
高盐 ：①与蛋白质分子争夺水
脂类
蛋白质(6% ~ 8%) 蛋白质
脂类(8.5% ~ 13.5%)
细菌细胞壁的结构
酵母菌细胞壁的结构 M—甘露聚糖；P—磷酸二酯键；G—葡聚糖
（二）细胞破碎的方法
机械法:搅拌;研磨 物理法：渗透压或温度突变 化学法：化学试剂改变细胞膜结构 生物法（酶解）：外加酶法或自溶法
第二节 酶的提取(extraction)
第三节 沉淀分离（根据溶解度的不同）
•使溶液中的溶质由液相转变为固相析出 •古老、实用、简单的初步分离方法
在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法： ⑴中性盐沉淀（盐析法） ⑵有机溶剂沉淀 ⑶选择性沉淀（热变性和酸碱变性） ⑷等电点沉淀 ⑸复合沉淀法
（一）盐析沉淀法（改变离子强度）
1. 基本原理（盐溶和盐析）
缺点：1）容易引起蛋白质变性失活 2)有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高。
（三） 等电点沉淀(isoelectric precipitation)
1.原理
蛋白质在等电点时溶解度最低 不同的蛋白质具有不同的等电点
2. 使用方法
单独使用较少（用于从粗酶液中除去某些等电点 相距较大的杂蛋白），多与其它方法联合使用（如 盐析法、有机溶剂法），因蛋白质在等电点时仍有 一定的溶解度。