第四章-酶的提取与分离纯化汇总
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4.12第四章酶的分离纯化
高 速离心 机 的最大转速为（1～2.5）×104 r/min ，相对离心力达到 1×104～1×105 g ，在酶的分离中主要用于沉淀、细胞碎片和细胞器等 的分离。为了防止高速离心过程中,温度升高而造成酶的变性失活,有些高 速离心机装设有冷冻装置,谓之高速冷冻离心机。
超速离心机的最大转速达 (2.5～12)×104 r/min，相对离心力可以高达 5×105 g甚至更高。超速离心主要用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分 子以及细胞器、病毒等的分离纯化；样品纯度的检测；沉降系数和相对 分子质量的测定等。
溶液的介电常数降低，就使溶质分子间的静电引力增 大，互相吸引而易于凝集，同时，对于具有水膜的分 子来说，有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的 水膜破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。
常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙 醇、甲醇等 。
2、离心分离
离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、 不同密度的物质分离的技术过程。
4.4 酶的分离方法
1、沉淀分离 2、离心分离 3、过滤与膜分离 4、层析分离 5、电泳分离 6、萃取分离
1、沉淀分离
沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解 度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。
沉淀分离方法 盐析沉淀法
等电点沉淀法
有机溶剂沉淀法
复合沉淀法 选择性变性沉淀 法
胆固醇浆液分析 牛奶灭菌后H2O2的 清除
1、细胞破碎
许多酶存在于细胞内。 为了提取这些胞内酶， 首先需要对细胞进行破 碎处理。
1）机械破碎 2）物理破碎 3）化学破碎 4）酶解破碎
参见动画
高 压 细 胞 破 碎 机
超 声 波 细 胞 粉 碎 机
超速离心机的最大转速达 (2.5～12)×104 r/min，相对离心力可以高达 5×105 g甚至更高。超速离心主要用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分 子以及细胞器、病毒等的分离纯化；样品纯度的检测；沉降系数和相对 分子质量的测定等。
溶液的介电常数降低，就使溶质分子间的静电引力增 大，互相吸引而易于凝集，同时，对于具有水膜的分 子来说，有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的 水膜破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。
常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙 醇、甲醇等 。
2、离心分离
离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、 不同密度的物质分离的技术过程。
4.4 酶的分离方法
1、沉淀分离 2、离心分离 3、过滤与膜分离 4、层析分离 5、电泳分离 6、萃取分离
1、沉淀分离
沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解 度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。
沉淀分离方法 盐析沉淀法
等电点沉淀法
有机溶剂沉淀法
复合沉淀法 选择性变性沉淀 法
胆固醇浆液分析 牛奶灭菌后H2O2的 清除
1、细胞破碎
许多酶存在于细胞内。 为了提取这些胞内酶， 首先需要对细胞进行破 碎处理。
1）机械破碎 2）物理破碎 3）化学破碎 4）酶解破碎
参见动画
高 压 细 胞 破 碎 机
超 声 波 细 胞 粉 碎 机
酶的分离纯化讲解
➢ 目标酶活力测定方法 ➢ 蛋白质纯度检测方法 ➢ 对杂质的分析方法
第二节分离纯化步骤及方法
一、步骤
发酵产品
1、酶的提取
固液分离，破碎，抽 提，浓缩
2、初分离
3、 纯化
精制品
4结晶
保藏
酶分离纯化总体步骤
1、酶液的提取
（1）发酵液的固液分离 （2）细胞破碎
（1）发酵液的固液分离
❖ 常用的分离方法有离心和过滤。 ➢ 离心分离速度快，效率高，操作时卫生条件
转筒真空过滤器
II
1 2
4 III
6 7
5
3
a.转动盘
b.固定盘
I
1－转筒；2－滤饼；3－割刀；4－分配头；5－吸走滤液的真空凹槽； 6－吸走洗水的真空凹槽；7－通入压缩空气的凹槽I－过滤区； II－洗涤脱水区；III－卸渣区
（2）细胞破碎
❖ 按微生物细胞酶的分布分为三类 ❖ 细胞破碎是指通过物理、化学或生物的方法，
❖ 组织捣碎器：这是一种较剧烈的破碎细胞的 方法，通常可先用家用食品加工机将组织打 碎，然后再用10000r/min～20000r/min 的内刀式组织捣碎机(即高速分散器)将组织 的细胞打碎。
物理破碎
通过各种物理因素 的作用，使组织、 细胞的外层结构破 坏，而使细胞破碎。
冻结-融化法 压榨法 渗透压法 超声波破碎法
纯度要求 极高纯度（>99%）
高纯度（95%-99%）
一般纯度（<95%）
用途 医疗用途
理化性质研究
生产抗原
2、明确目标蛋白与主要杂质的性质
❖ 检测目标酶蛋白稳定条件，至少检测pH 值和离子强度两个条件。
❖ 了解目标酶和杂质的性质：分子大小、 等电点、溶解度等。
第二节分离纯化步骤及方法
一、步骤
发酵产品
1、酶的提取
固液分离，破碎，抽 提，浓缩
2、初分离
3、 纯化
精制品
4结晶
保藏
酶分离纯化总体步骤
1、酶液的提取
（1）发酵液的固液分离 （2）细胞破碎
（1）发酵液的固液分离
❖ 常用的分离方法有离心和过滤。 ➢ 离心分离速度快，效率高，操作时卫生条件
转筒真空过滤器
II
1 2
4 III
6 7
5
3
a.转动盘
b.固定盘
I
1－转筒；2－滤饼；3－割刀；4－分配头；5－吸走滤液的真空凹槽； 6－吸走洗水的真空凹槽；7－通入压缩空气的凹槽I－过滤区； II－洗涤脱水区；III－卸渣区
（2）细胞破碎
❖ 按微生物细胞酶的分布分为三类 ❖ 细胞破碎是指通过物理、化学或生物的方法，
❖ 组织捣碎器：这是一种较剧烈的破碎细胞的 方法，通常可先用家用食品加工机将组织打 碎，然后再用10000r/min～20000r/min 的内刀式组织捣碎机(即高速分散器)将组织 的细胞打碎。
物理破碎
通过各种物理因素 的作用，使组织、 细胞的外层结构破 坏，而使细胞破碎。
冻结-融化法 压榨法 渗透压法 超声波破碎法
纯度要求 极高纯度（>99%）
高纯度（95%-99%）
一般纯度（<95%）
用途 医疗用途
理化性质研究
生产抗原
2、明确目标蛋白与主要杂质的性质
❖ 检测目标酶蛋白稳定条件，至少检测pH 值和离子强度两个条件。
❖ 了解目标酶和杂质的性质：分子大小、 等电点、溶解度等。
酶的分离纯化及活性测定
第五节酶的分离、纯化及活性测定1一、酶的分离、纯化•:一类由细胞内产生然后分泌到细胞外进行作用胞外酶生然后分到行作的酶，这类酶大多都是水解酶类。
•胞内酶:另一类酶在细胞内合成后在细胞内起催化作用的，这类酶数量较多。
的多2一般原则：般原则：防止强酸、强碱, 要求加入的化学试剂不使酶变性；在低温下操作，全部操作在低温0～4℃；在分离提纯过程中避免剧烈搅拌 在分离提纯过程中，避免剧烈搅拌；在提纯溶剂中加一些保护剂如少量EDTA 在提纯溶剂中加一些保护剂，如少量EDTA、少量β-巯基乙醇；在不破坏所需酶的条件下，可使用各种“激烈的烈”的手段。
3酶的分离提纯三个基本环节：第一抽提，即把酶从材料转入溶剂中制成酶溶液；第二纯化，即把杂质从酶溶液中除掉或从酶溶液中把酶分离出来；第三制剂，即将酶制成各种剂型。
在酶的分离纯化过程中．每步都须做三件事：第一第，测定酶活力(IU/ml)；第二，测定蛋白质含量(mg/ml)；第三，测量体积(ml)。
4基本操作程序微生物、动物、选材植物加入提取液抽提胞内酶先破碎抽提先净化处理再沉淀法分离离子交析分离纯化换层析，凝胶过滤，液相色谱，亲和色谱和超滤等5（一）酶的抽提（）酶的抽提1、破碎细胞对于细胞外酶可用水缓冲液浸泡过对于细胞外酶可用水、缓冲液浸泡过滤后，可得粗抽提液。
对于细胞内酶要破碎细胞、动物细胞较易破碎，通常用匀浆器捣碎机，制成较易破碎，通常用匀浆器、捣碎机，制成匀浆离心后可得酶抽提液。
细菌细胞壁较厚，需用超声波、溶胞壁较声溶菌酶等抽提。
酶等提62、酶的抽提酶的抽提一般的酶可用稀酸或稀碱的水溶液抽提出来。
抽提条件：提出来抽提条件⑴抽提溶的pH选择应该在酶的pH稳定，并离范围之内，并且最好远离等电点。
低温下抽提⑵低温下抽提（0～40C）7（二）酶的纯化（）酶的纯化抽提液中除含有所需有酶外，还含有其它大抽提液中除含有所需有酶外还含有其它大分子物质。
常用分离纯化的方法：①溶解度②电荷性质③大小或质量④亲和部位。
酶的分离纯化
超声波破碎法
化学破碎法： 甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等有机溶剂和Triton、
Tween等表面活性剂
酶促破碎法
自溶法 加酶处理
G+菌：溶菌酶 G-菌：溶菌酶、巯基乙醇等 酵母菌：β-葡聚糖酶和溶菌酶 霉菌：几丁质酶
四、抽提 指在一定的条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充
分溶解到溶剂中的过程，也称为酶的提取。
2、按膜孔径或截留物质的大小：
微滤 —— 超滤 —— 纳滤 、电渗析 、透析 —— 反渗透
膜
孔
径大
小
灰尘 细菌
膜
病毒 生物大分子 生物小分子 盐类 水
灰尘 细菌 病毒 生物大分子
生物小分子 盐类 水
微滤（MF）
（0.2-2um）
超滤（UF）
（10-200nm）
灰尘 细菌 病毒 生物大分子 生物小分子
选择性热变性法、选择性酸碱变性法、 选择性表面变性法
亲和层析、亲和电泳
ห้องสมุดไป่ตู้
第三节 酶的沉淀分离
盐析沉淀法√、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、复合沉淀法
一、盐析沉淀法 1、原理： 2、硫酸铵盐析的优点
优点：①在水中溶解度大，溶解的温度系数小； ②价廉，便宜； ③可保护酶。
缺点：溶解过程随浓度增加的体积变化是非线性的变化。
(25℃)
当溶液体积不大，要达到的盐浓度不高，可以加 入饱和硫酸铵溶液；当溶液体积较大，要达到的盐 浓度又较高，此时加入固体硫酸铵较好。
4、为了得到较好的盐析效果，应控制下列因素
（1）不同酶，盐析时所需的盐浓度各不相同。实际料液中目 标酶的盐析沉淀操作前，所需的硫酸铵浓度或饱和度可通过实 验确定。
（2）加盐操作时，防止局部盐浓度过高，防止产生泡沫。
微生物学第四章酶的分离纯化
（4）蛋白质浓度：一般控制在2.5~3.0% 为宜。 （5）脱盐：超滤、透析或层析。
（二）有机溶剂沉淀法
1、作用原理 ①去水膜；②降低介电常数；③破坏氢键。
2、操作注意 低沸点，易燃易爆；低温操作，沉淀析出后要尽
快分离。
（三）等电点沉淀
1、原理
2、实际操作 与其他方法一起使用（盐析、有机溶剂沉淀、复
中空纤维超滤膜组件
借助于一定孔径的半透膜，将不同大小、不同形 状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的技术。
膜分离技术已被国际上公认为20世
纪末至21世纪中期最有发展前途，甚
至会导致一次工业革命的重大生产技
术，所以可以称为前沿技术，是世界
渗出液各国ຫໍສະໝຸດ 究的热点。广泛应用于生物工程、化学、制药、 饮料、电力、冶金、海水淡化、资源 再生等领域。
合沉淀）。 单独使用时，主要是用于从粗酶液中除去某些等
电点相距较大的杂蛋白 。
3、注意 加酸碱调节pH值时，防止局部酸碱过高。
（四）选择性变性沉淀法
选择一定的条件使酶液中存在的某些蛋白质等杂 质变性沉淀，而不影响所需的酶。
1、热变性法：根据目的酶与杂蛋白热稳定性差异， 可以在较高温度下，使杂蛋白变性沉淀，而酶则保持 可溶状态。
（78.3%）
凝胶电泳
（88.9%）
共六步，总收率仅为16%
staehelin等人： 硫酸铵盐析 免疫亲和层析
阳离子交换层析 仅三步，总收率达81.0%
在实践工作中选择方法时:
首先，应对被纯化的酶的理化性质有一个比较全面的 了解;
其次，判断采用的方法和条件是否得当，始终以活力 回收率和纯化倍数为指标；
常用中性盐：（NH4）2SO4
优点：①溶解度大，温度系数小； ②价廉易得； ③可保护酶。
（二）有机溶剂沉淀法
1、作用原理 ①去水膜；②降低介电常数；③破坏氢键。
2、操作注意 低沸点，易燃易爆；低温操作，沉淀析出后要尽
快分离。
（三）等电点沉淀
1、原理
2、实际操作 与其他方法一起使用（盐析、有机溶剂沉淀、复
中空纤维超滤膜组件
借助于一定孔径的半透膜，将不同大小、不同形 状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的技术。
膜分离技术已被国际上公认为20世
纪末至21世纪中期最有发展前途，甚
至会导致一次工业革命的重大生产技
术，所以可以称为前沿技术，是世界
渗出液各国ຫໍສະໝຸດ 究的热点。广泛应用于生物工程、化学、制药、 饮料、电力、冶金、海水淡化、资源 再生等领域。
合沉淀）。 单独使用时，主要是用于从粗酶液中除去某些等
电点相距较大的杂蛋白 。
3、注意 加酸碱调节pH值时，防止局部酸碱过高。
（四）选择性变性沉淀法
选择一定的条件使酶液中存在的某些蛋白质等杂 质变性沉淀，而不影响所需的酶。
1、热变性法：根据目的酶与杂蛋白热稳定性差异， 可以在较高温度下，使杂蛋白变性沉淀，而酶则保持 可溶状态。
（78.3%）
凝胶电泳
（88.9%）
共六步，总收率仅为16%
staehelin等人： 硫酸铵盐析 免疫亲和层析
阳离子交换层析 仅三步，总收率达81.0%
在实践工作中选择方法时:
首先，应对被纯化的酶的理化性质有一个比较全面的 了解;
其次，判断采用的方法和条件是否得当，始终以活力 回收率和纯化倍数为指标；
常用中性盐：（NH4）2SO4
优点：①溶解度大，温度系数小； ②价廉易得； ③可保护酶。
微生物技术应用：第四章 微生物发酵产物的分离与纯化
三、分离纯化方法的综合运用与工艺优化
应作好工序间的衔接工作，从加工产物质量、 产物收率与纯度的平衡、时间与经济性等角度出 发，对影响工艺流程整体纯化效果的加工条件进 行优化：
1 收率与纯度之间的平衡 2 经济性考虑 3 工艺放大 4 纯化过程中对产品的检测
1 收率与纯度之间的平衡
发酵产品有效成分分离纯化过程中，产品的 纯度与产率之间是一对矛盾的关系。比如，微生 物发酵产物为药品时，其有效成分的纯度是衡量 其质量优劣的重要指标，特别是非肠道药物，其 纯度的高低直接关乎用药的安全性。纯化产品产 率的提高往往伴随着纯度的下降，反之对产品纯 度要求的提高意味着纯化成本的提高和产物收率 的降低。
微生物发酵产物的分离纯化
第二节 分离纯化技术
一、细胞破碎技术 二、沉淀分离纯化技术 三、离心分离纯化技术 四、膜分离纯化技术 五、层析分离纯化技术 六、萃取技术 七、冷冻干燥技术
第二节 分离纯化技术
一、细胞破碎技术
（一）发酵液的预处理和固液分离 目的：分离菌体和其他悬浮颗粒(细胞碎片、核 酸和蛋白质的沉淀物)；除去部分可溶性杂质和 改变滤液性质，以利于提取和精制的顺利进行。 方法：高价无机离子的去除方法，杂蛋白质的去 除，发酵液的凝聚和絮凝。
一、建立分离纯化工艺的根据
1.微生物发酵产物的特点
➢另一个特点是欲提取的生物物质通常很不 稳定，遇热、极端pH、有机溶剂会引起失 活或分解。
➢发酵或培养都是分批操作、生物变异性大， 各批发酵液不尽相同，要求下游加工有一 定的弹性。
一、建立分离纯化工艺的根据
2.原理
（1）物理性质 ① 力学性质：重力、离心力、筛分； ② 热力学性质：状态变化、相平衡； ③ 传质性质：粘度、扩散、热扩散； ④ 电磁性质：电泳、电渗析、磁化；
酶的提取与分离纯化
.
2
酶的提取、分离纯化技术路线
细胞破碎 动物、植物或微生物细胞
酶提取( 粗提) 酶分离纯化
发酵液
酶浓缩 酶贮存
离心分离，过滤分离，沉淀分 离，层析分离，电泳分离，萃 取分离，结晶分离等。
.
3
酶分离纯化不同阶段
酶的纯化过程，约可分为三个阶段：
(1) 粗蛋白质 (crude protein): 采样 → 均 质打破细胞 → 抽提出全蛋白，多使用 盐析沉淀 法；可以粗略去除蛋白质以外的物质。
.
14
3、超声波破碎法
超声波：通常人的耳朵可听到的 声音频率范围为16-20kHz，频率 高于20 kHz的波。
其破碎机理可能与空化现象引起 的冲击波和剪切作用有关。在超 声波作用下，细胞膜由于空穴作 用而破碎。
由于空化作用而使液体形成局部 减压引起液体内部发生流动，旋 涡生成与消失时，产生很大的压 力使细胞膜破裂到达破碎细胞的 效果。
.
5
表4-1 细胞破碎方法及其原理
分类
细胞破碎方法
捣碎法
机械破碎法 研磨法
匀浆法
温度差破碎法
压力差破碎法 物理破碎法 超声波破碎法
反复冻融法
干燥法
细胞破碎原理
通过机械运动产生的剪切力， 使组织、细胞破碎
通过各种物理因素的作用，使 组织、细胞的外层结构破坏， 而使细胞破碎
.
6
化学破碎法
添加有机溶剂、 通过各种化学试剂对细胞膜 添加表面活性剂 的作用，而使细胞破碎
.
22
2、表面活性剂
可促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞 的破碎。表面活性剂可与细胞膜中的磷脂及脂蛋白 作用而破坏膜结构，增加膜的通透性。
酶工程-04-酶的提取与分离纯化
三足离心机 32 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
1、差速离心
采用不同的离心速度和离心时间，使不同沉降速度的颗粒 先后分离的方法。
应用范围:大小和密度有较大差别的颗粒。
大
中
小
33 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
2、密度梯度离心
在离心管中用5~60%的蔗糖溶液，形成由管底到液面逐渐 降低的梯度，将样品放在密度梯度溶液的表面，经过离心，不 同大小、具有一定沉降系数差异的颗粒在密度梯度溶液中形成 若干条不连续的区带。
广泛应用于生物工程、化学、制药、 饮料、电力、冶金、海水淡化、资源 再生等领域。
渗出液 40
膜分离技术的地位和影响
美国官方文件曾说“18世纪电器改变了整个工业进程 ，而20世纪膜技术将改变整个面貌”，“目前没有一 种技术，能像膜技术这么广泛地被应用”
日本和欧洲则把膜技术作为21世纪的基盘技术进行研 究和开发。
常用的离心介质：铯盐，如CsCl，Cs2SO4，CsBr
36 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
先把一定浓度的铯盐溶液与样品液混合均匀，也可将一定量 的铯盐加到样品液中使之溶解。 在选定的离心力作用下，经过足够时间的离心分离。 铯盐在离心力的作用下，在离心力场中沉降，自动形成密度 梯度。 样品中不同浮力密度的颗粒在其各自的等密度点位置上形成 区带。
梯度介质：蔗糖密度梯度系统
34 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
密度梯度的制备：密度梯度混合器
35 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
3、等密度梯度离心
当欲分离的不同颗粒的密度范围处于离心介质的密度范围 时，在离心力的作用下，不同浮力密度的颗粒一直移动到与他 们各自的浮力密度恰好相等的位置，形成区带。
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把酶从生物组织或细胞中以溶解状态释放 出来的过程，即将尽可能多的酶，尽量少的杂 质从原料中引入溶液。
提取原则
a. 相似相溶。 b. 远离等电点的pH值，溶解度增加。
提取方法：
（一）盐溶液提取 常用稀盐（常用NaCl）溶液（盐溶），
对酶稳定性好、溶解度大 ，最常用。 （二）酸、碱溶液提取 （三）有机溶剂提取
酶纯化的基本原则：
①建立一个方便灵敏的分析方法；
②选择有效的纯化方法，尽可能减少纯化 步骤；
③常在低温（4℃）条件下进行纯化，以避 免酶的变性。
第一节 细胞破碎
（一）细胞壁组成
各种微生物细胞壁的结构与组成
微生 物
壁厚 /nm
层次
主要 组成
革兰氏阳性 革兰氏阴性 放线
细菌
细菌
菌
15 ~ 50
10 ~ 13 同G+
适用于：蛋白质溶液原来体积已经很大，而要 达到的盐浓度又很高时。
实际使用时，可直接查表 （各种饱和度下 需加固体硫酸铵的量）。
调整硫酸铵溶液饱和度计算表
盐析操作
低饱和度：饱和溶液滴加法。易于迅速混合均匀，一般终 饱和度不超过40％。
高饱和度：固体盐添加法。不会大量增加溶液体积。 1）固体硫酸铵充分研细，温和搅拌中缓慢加入。 2）冰箱中（4℃）放置过夜，待沉淀完全后高速离心。 3）沉淀再溶解后可用超滤（ultrafiltration） 、透析
（二） 有机溶剂沉淀（降低介电常数）
利用酶等蛋白质在有机溶剂中的溶解度不 同而使之分离的方法。 1. 沉淀机理
降低溶液的介电常数 部分地引起蛋白质脱水 2. 常用有机溶剂 乙醇、丙酮、甲醇，用量一般为酶液体积的2 倍左右，终浓度为70%。
3.优缺点：
优点：1）分辨率比盐析法高 2） 沉淀不需脱盐 3）溶剂易蒸发，沉淀易离心
②中和电荷
不同蛋白质分子量、表面电荷不同，在不同 盐浓度下沉淀，逐渐增大盐浓度，不同蛋白 质先后析出，称分段盐析。
2. 盐析用盐
1）中性盐的选择 常用（NH4）2SO4
2) 调整盐浓度的方式
a. 饱和溶液法（添加饱和硫酸铵溶液）
适用于：蛋白质溶液体积不太大，而达到的盐浓 度又不太高时。
b. 添加固体硫酸铵
（dialysis）或层析（chromatography）方法脱盐。
3. 离子强度和种类（介绍盐析常数）
蛋白质溶解度与盐浓度之间的关系：
log S log S0 Ks I
I：离子强度 S：离子强度为I时的蛋白质的溶解度（g/L） S0：离子强度为0时蛋白质的溶解度（g/L） Ks：盐析常数，是与蛋白质和盐有关的特性常数。
第四章 酶的提取与分离纯化
预处理（pretreatment）：包括固液分离和细胞破碎
（分离胞内产物）等。
初步纯化（rough fractionation）（提取）：除去
与目的产物性质差异很大的杂质。
高度纯化（fine fractionation）（精制）：除去与
产物性质相似的杂质。
浓缩与干燥（concentration and desiccation） （成品加工）:使酶与溶剂分离的过程。
⑴ 热变性
⑵ pH变性
⑶ 有机溶剂变性
举例：牛红细胞提取Cu，Zn－SOD的生产工艺：
收集
新鲜牛血 除血浆
离心
浮选
溶血
红细胞
干净红细胞
2％NaCl
去血红蛋白
溶血液 乙醇、氯仿
上清
分级沉淀 丙酮
热变性
沉淀物 70℃ SOD粗酶液
Ks代表盐析效率 ，其含义是随着盐浓度的增加，蛋 白质溶解度降低的速度，Ks越大盐析效果越好。
当温度和pH一定时，S0对于某一溶质是 常数，用β表示，盐析方程式可改写为：
log S = β- Ks I 两种盐析法： Ks分段盐析法 ：在一定的pH和温度条件下， 通过改变离子强度或盐浓度（即改变I值）使 不同酶先后沉淀的方法。 β分段盐析法 ：在一定盐和离子强度下，通 过改变溶液的pH及温度的沉淀方法。
酵母菌 100 ~ 300
霉菌 100 ~ 250源自单层肽聚糖 (40% ~ 90%)
多糖 胞壁酸 蛋白质 脂多糖 (1%〜2%)
多层
肽聚糖 (5% ~ 10%)
脂蛋白 脂多糖 (11% ~ 22%)
磷脂 蛋白质
多层
多层
葡聚糖(30% ~ 40%) 多聚糖
甘露聚糖(30%) (80% ~ 90%)
几丁质(1% ~ 2%)
（四）复合沉淀法
1. 作用机理： 与有机溶剂类似 ，是发展较快的一种新方法。
2. 沉淀剂： 常用聚乙二醇 （Polyethyene glycol，简写 PEG 多用分子量为6000～20000的 PEG ）、单宁等
（五）选择性变性沉淀法
选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白质变性 沉淀而不影响所需蛋白质的方法。
向蛋白质或酶的水溶液中加入中性盐，可产 生两种现象：
1) 盐溶（salting in） ： 低浓度的中性盐增加蛋白质的溶解度。 2) 盐析（salting out） ： 高浓度的中性盐降低蛋白质的溶解度。
蛋白质的盐析
盐溶
盐析
离子强度 硫酸铵对马血红蛋白的溶解度的影响
原因：
高盐 ：①与蛋白质分子争夺水
脂类
蛋白质(6% ~ 8%) 蛋白质
脂类(8.5% ~ 13.5%)
细菌细胞壁的结构
酵母菌细胞壁的结构 M—甘露聚糖；P—磷酸二酯键；G—葡聚糖
（二）细胞破碎的方法
机械法:搅拌;研磨 物理法：渗透压或温度突变 化学法：化学试剂改变细胞膜结构 生物法（酶解）：外加酶法或自溶法
第二节 酶的提取(extraction)
第三节 沉淀分离（根据溶解度的不同）
•使溶液中的溶质由液相转变为固相析出 •古老、实用、简单的初步分离方法
在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法： ⑴中性盐沉淀（盐析法） ⑵有机溶剂沉淀 ⑶选择性沉淀（热变性和酸碱变性） ⑷等电点沉淀 ⑸复合沉淀法
（一）盐析沉淀法（改变离子强度）
1. 基本原理（盐溶和盐析）
缺点：1）容易引起蛋白质变性失活 2)有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高。
（三） 等电点沉淀(isoelectric precipitation)
1.原理
蛋白质在等电点时溶解度最低 不同的蛋白质具有不同的等电点
2. 使用方法
单独使用较少（用于从粗酶液中除去某些等电点 相距较大的杂蛋白），多与其它方法联合使用（如 盐析法、有机溶剂法），因蛋白质在等电点时仍有 一定的溶解度。
提取原则
a. 相似相溶。 b. 远离等电点的pH值，溶解度增加。
提取方法：
（一）盐溶液提取 常用稀盐（常用NaCl）溶液（盐溶），
对酶稳定性好、溶解度大 ，最常用。 （二）酸、碱溶液提取 （三）有机溶剂提取
酶纯化的基本原则：
①建立一个方便灵敏的分析方法；
②选择有效的纯化方法，尽可能减少纯化 步骤；
③常在低温（4℃）条件下进行纯化，以避 免酶的变性。
第一节 细胞破碎
（一）细胞壁组成
各种微生物细胞壁的结构与组成
微生 物
壁厚 /nm
层次
主要 组成
革兰氏阳性 革兰氏阴性 放线
细菌
细菌
菌
15 ~ 50
10 ~ 13 同G+
适用于：蛋白质溶液原来体积已经很大，而要 达到的盐浓度又很高时。
实际使用时，可直接查表 （各种饱和度下 需加固体硫酸铵的量）。
调整硫酸铵溶液饱和度计算表
盐析操作
低饱和度：饱和溶液滴加法。易于迅速混合均匀，一般终 饱和度不超过40％。
高饱和度：固体盐添加法。不会大量增加溶液体积。 1）固体硫酸铵充分研细，温和搅拌中缓慢加入。 2）冰箱中（4℃）放置过夜，待沉淀完全后高速离心。 3）沉淀再溶解后可用超滤（ultrafiltration） 、透析
（二） 有机溶剂沉淀（降低介电常数）
利用酶等蛋白质在有机溶剂中的溶解度不 同而使之分离的方法。 1. 沉淀机理
降低溶液的介电常数 部分地引起蛋白质脱水 2. 常用有机溶剂 乙醇、丙酮、甲醇，用量一般为酶液体积的2 倍左右，终浓度为70%。
3.优缺点：
优点：1）分辨率比盐析法高 2） 沉淀不需脱盐 3）溶剂易蒸发，沉淀易离心
②中和电荷
不同蛋白质分子量、表面电荷不同，在不同 盐浓度下沉淀，逐渐增大盐浓度，不同蛋白 质先后析出，称分段盐析。
2. 盐析用盐
1）中性盐的选择 常用（NH4）2SO4
2) 调整盐浓度的方式
a. 饱和溶液法（添加饱和硫酸铵溶液）
适用于：蛋白质溶液体积不太大，而达到的盐浓 度又不太高时。
b. 添加固体硫酸铵
（dialysis）或层析（chromatography）方法脱盐。
3. 离子强度和种类（介绍盐析常数）
蛋白质溶解度与盐浓度之间的关系：
log S log S0 Ks I
I：离子强度 S：离子强度为I时的蛋白质的溶解度（g/L） S0：离子强度为0时蛋白质的溶解度（g/L） Ks：盐析常数，是与蛋白质和盐有关的特性常数。
第四章 酶的提取与分离纯化
预处理（pretreatment）：包括固液分离和细胞破碎
（分离胞内产物）等。
初步纯化（rough fractionation）（提取）：除去
与目的产物性质差异很大的杂质。
高度纯化（fine fractionation）（精制）：除去与
产物性质相似的杂质。
浓缩与干燥（concentration and desiccation） （成品加工）:使酶与溶剂分离的过程。
⑴ 热变性
⑵ pH变性
⑶ 有机溶剂变性
举例：牛红细胞提取Cu，Zn－SOD的生产工艺：
收集
新鲜牛血 除血浆
离心
浮选
溶血
红细胞
干净红细胞
2％NaCl
去血红蛋白
溶血液 乙醇、氯仿
上清
分级沉淀 丙酮
热变性
沉淀物 70℃ SOD粗酶液
Ks代表盐析效率 ，其含义是随着盐浓度的增加，蛋 白质溶解度降低的速度，Ks越大盐析效果越好。
当温度和pH一定时，S0对于某一溶质是 常数，用β表示，盐析方程式可改写为：
log S = β- Ks I 两种盐析法： Ks分段盐析法 ：在一定的pH和温度条件下， 通过改变离子强度或盐浓度（即改变I值）使 不同酶先后沉淀的方法。 β分段盐析法 ：在一定盐和离子强度下，通 过改变溶液的pH及温度的沉淀方法。
酵母菌 100 ~ 300
霉菌 100 ~ 250源自单层肽聚糖 (40% ~ 90%)
多糖 胞壁酸 蛋白质 脂多糖 (1%〜2%)
多层
肽聚糖 (5% ~ 10%)
脂蛋白 脂多糖 (11% ~ 22%)
磷脂 蛋白质
多层
多层
葡聚糖(30% ~ 40%) 多聚糖
甘露聚糖(30%) (80% ~ 90%)
几丁质(1% ~ 2%)
（四）复合沉淀法
1. 作用机理： 与有机溶剂类似 ，是发展较快的一种新方法。
2. 沉淀剂： 常用聚乙二醇 （Polyethyene glycol，简写 PEG 多用分子量为6000～20000的 PEG ）、单宁等
（五）选择性变性沉淀法
选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白质变性 沉淀而不影响所需蛋白质的方法。
向蛋白质或酶的水溶液中加入中性盐，可产 生两种现象：
1) 盐溶（salting in） ： 低浓度的中性盐增加蛋白质的溶解度。 2) 盐析（salting out） ： 高浓度的中性盐降低蛋白质的溶解度。
蛋白质的盐析
盐溶
盐析
离子强度 硫酸铵对马血红蛋白的溶解度的影响
原因：
高盐 ：①与蛋白质分子争夺水
脂类
蛋白质(6% ~ 8%) 蛋白质
脂类(8.5% ~ 13.5%)
细菌细胞壁的结构
酵母菌细胞壁的结构 M—甘露聚糖；P—磷酸二酯键；G—葡聚糖
（二）细胞破碎的方法
机械法:搅拌;研磨 物理法：渗透压或温度突变 化学法：化学试剂改变细胞膜结构 生物法（酶解）：外加酶法或自溶法
第二节 酶的提取(extraction)
第三节 沉淀分离（根据溶解度的不同）
•使溶液中的溶质由液相转变为固相析出 •古老、实用、简单的初步分离方法
在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法： ⑴中性盐沉淀（盐析法） ⑵有机溶剂沉淀 ⑶选择性沉淀（热变性和酸碱变性） ⑷等电点沉淀 ⑸复合沉淀法
（一）盐析沉淀法（改变离子强度）
1. 基本原理（盐溶和盐析）
缺点：1）容易引起蛋白质变性失活 2)有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高。
（三） 等电点沉淀(isoelectric precipitation)
1.原理
蛋白质在等电点时溶解度最低 不同的蛋白质具有不同的等电点
2. 使用方法
单独使用较少（用于从粗酶液中除去某些等电点 相距较大的杂蛋白），多与其它方法联合使用（如 盐析法、有机溶剂法），因蛋白质在等电点时仍有 一定的溶解度。