微生物细胞计数及染色操作.pptx
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微生物的显微直接计数PPT课件
计算
每一个大方格边长为1毫米，则每一大方格 面积为1平方毫米。盖上盖玻片后，载玻片计数 室与盖玻片之间的高度为0.1毫米，所以每个计数 室（大方格）的体积为0.1立方毫米。
在计数时，通常数五个中方格的总菌数，求 得平均值。再乘上16或25就得一大方格中的总菌 数。然后再换算成1毫升菌液中的总菌数。 （1毫升＝1立方厘米＝1,000立方毫米）
实验四
微生物的显微直接计数
目的要求 实验原理 实验材料 实验程序 思考题
目的要求
• 了解血球计数板的构造和使用方法。 • 学习使用血球记数板测定微生物数量的方
法。
实验原理
血球计数板通常是一块特制的厚载玻片，载玻 片上有四条槽而构成三个平台。中间的平台较 宽，其中间又被一短横槽而隔成两半，每个半 边上面各刻有一个方格网，每个方格网共分九 大格，其中间的一大格又称为计数室，微生物 的计数就在此大格中进行。
1. 取清洁无油的血球计数板，在计数室上面加盖玻片。
2. 取酵母菌液，摇匀，用滴管由盖玻片边缘滴一小滴（ 不宜过多），使菌液自行渗入，计数室内不得有气泡。
3. 静置5分钟后，将血球计数板置于显微镜载物台上， 先用低倍镜找到计数板的大方格网位置。寻找时光圈要 缩小，光线要偏暗些，并将计数室移至视野中央。
4. 在高倍镜下计数：随机地计数五个中格内的菌数， 然后求得每个中格的平均值。乘上16（或25）就得出 一大格中的总菌数，最后再换算到每毫升菌液中的含 菌数量。由于菌体细胞在血球计数板上处于不同的空 间位置，要在不同的焦距下才能看到，故观察时必须 不断调节微调节器，方能数到全部菌体，以免遗漏。
5. 计算方法： 酵母菌细胞数／毫升=[（X1+X2+X3+X4+X5）/5]*25 （或16）×10×1000×稀释倍数
(完整)实验三 微生物染色观察精品PPT资料精品PPT资料
环直接涂于载玻片上。 拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿，更不可倾斜拿。
coli cells
Figure 2 - Gram stain of Gram –
不准擅自拆卸N显微o镜t的e任s何:部件1,以）免损载坏。玻片要洁净无油迹 2）滴生理盐水和取
菌不宜过多 3）涂片要涂抹均匀，不宜过厚。
取少许菌苔于水滴中，混合并涂成薄膜。 很多原来由于在透镜及载片表面的反射和折射而损失的
7、复染：加复红染色1-2分钟。 2、干燥 室温自然干燥
如用菌悬液或液体培养物，可用接种环挑取1-2 C）再用一小片擦镜纸擦去镜头上可能残留的二甲苯。 简单染色是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。 拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿，更不可倾斜拿。
染色
镜检
操作步骤（continued）
菌悬液
涂片
干燥
滴加无 菌水
取菌苔
涂片
固定
1、涂片
操作步骤（continued）
常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。
取两块载玻片，各滴一小滴（或用接种环沾取） 细菌个体微小，一般使用油镜观察细菌个体形态。
细菌个体微小，一般使用油镜观察细菌个体形态。
4.拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座， 不可单手拿，更不可倾斜拿。
5.显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉 菌而腐蚀镜片。
操作步骤
现场演示
1.低倍镜观察：粗调、细调。依次再进行中倍、高倍 观察
2.油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，在标本中 央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调 至看清物象为止。
涂片 细菌细胞微小，透明，不易观察，需染上颜色。
coli cells
Figure 2 - Gram stain of Gram –
不准擅自拆卸N显微o镜t的e任s何:部件1,以）免损载坏。玻片要洁净无油迹 2）滴生理盐水和取
菌不宜过多 3）涂片要涂抹均匀，不宜过厚。
取少许菌苔于水滴中，混合并涂成薄膜。 很多原来由于在透镜及载片表面的反射和折射而损失的
7、复染：加复红染色1-2分钟。 2、干燥 室温自然干燥
如用菌悬液或液体培养物，可用接种环挑取1-2 C）再用一小片擦镜纸擦去镜头上可能残留的二甲苯。 简单染色是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。 拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿，更不可倾斜拿。
染色
镜检
操作步骤（continued）
菌悬液
涂片
干燥
滴加无 菌水
取菌苔
涂片
固定
1、涂片
操作步骤（continued）
常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。
取两块载玻片，各滴一小滴（或用接种环沾取） 细菌个体微小，一般使用油镜观察细菌个体形态。
细菌个体微小，一般使用油镜观察细菌个体形态。
4.拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座， 不可单手拿，更不可倾斜拿。
5.显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉 菌而腐蚀镜片。
操作步骤
现场演示
1.低倍镜观察：粗调、细调。依次再进行中倍、高倍 观察
2.油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，在标本中 央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调 至看清物象为止。
涂片 细菌细胞微小，透明，不易观察，需染上颜色。
微生物常用染色法-PPT
微生物常用染色法
1
细菌染色的一般程序
涂片(干燥)---固定---染色---脱色---复染
2
涂片制备
血液,分泌物,排泄物,穿刺液和液体培养物,直接 在载玻上作薄涂片. 固体培养基上的菌落或菌 苔的制片,用接种环取1 环9g/L氯化钠溶液置载 玻片中央.再用无菌接种环取少量的培养物在 氯化钠溶液中磨匀,涂成人1CM*1CM大小的涂 面.置室温下自然干燥或火慢慢烘干.
18
涂片见G+球菌，呈葡萄状排列
19
涂片见G+球菌，呈链状排列
20
染色原理:
最广泛接受观点认为与细菌细胞壁结构及化学 组成有关. G+菌细菌壁结构致密,肽聚糖层厚, 脂质含量少,形成结晶紫_碘复合物.脱 色过程 中,虽然溶解细菌壁脂质成分形成小孔.脱水作 用使细胞壁收缩又 构成屏障,阻止结晶紫—碘 复合物被乙醇溶出,细菌保持紫色.G-菌细菌壁 疏松,肽聚糖层较薄,脂质含量高,乙醇溶解脂质, 经复染细菌呈红色.
– 复染色法 用两种或以上的不同颜色的染料进行 染色，可将不同细菌或同一细菌的不同结构染成 不同颜色
9
大家有疑问的，可以询问和交流
可以互相讨论下，但要小声点
10
革兰染色
– 细菌涂片经火焰固定,加结晶紫染液1min,清水冲去染液. – 加碘液媒染1min,水洗,甩干. – 用95%乙醇脱色,轻轻摇动约30S,至无紫色洗落为止,水洗,
24
染色原理
抗酸性染色细菌与细胞壁成分有关.分枝杆菌 细胞壁含脂质较多,其中主要成分是分枝菌酸. 决定抗酸性染色反应,用乙醚脱去分 分枝菌酸,则呈非抗酸染色性.
25
剂.也可用加热法促进着色.
6
脱色
使已着色的被染物脱去颜色.常用乙醇,丙酮等 作为脱色剂.脱色剂可以查出细菌与染料结合 的稳定程度,作为鉴别染色用.
1
细菌染色的一般程序
涂片(干燥)---固定---染色---脱色---复染
2
涂片制备
血液,分泌物,排泄物,穿刺液和液体培养物,直接 在载玻上作薄涂片. 固体培养基上的菌落或菌 苔的制片,用接种环取1 环9g/L氯化钠溶液置载 玻片中央.再用无菌接种环取少量的培养物在 氯化钠溶液中磨匀,涂成人1CM*1CM大小的涂 面.置室温下自然干燥或火慢慢烘干.
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涂片见G+球菌，呈葡萄状排列
19
涂片见G+球菌，呈链状排列
20
染色原理:
最广泛接受观点认为与细菌细胞壁结构及化学 组成有关. G+菌细菌壁结构致密,肽聚糖层厚, 脂质含量少,形成结晶紫_碘复合物.脱 色过程 中,虽然溶解细菌壁脂质成分形成小孔.脱水作 用使细胞壁收缩又 构成屏障,阻止结晶紫—碘 复合物被乙醇溶出,细菌保持紫色.G-菌细菌壁 疏松,肽聚糖层较薄,脂质含量高,乙醇溶解脂质, 经复染细菌呈红色.
– 复染色法 用两种或以上的不同颜色的染料进行 染色，可将不同细菌或同一细菌的不同结构染成 不同颜色
9
大家有疑问的，可以询问和交流
可以互相讨论下，但要小声点
10
革兰染色
– 细菌涂片经火焰固定,加结晶紫染液1min,清水冲去染液. – 加碘液媒染1min,水洗,甩干. – 用95%乙醇脱色,轻轻摇动约30S,至无紫色洗落为止,水洗,
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染色原理
抗酸性染色细菌与细胞壁成分有关.分枝杆菌 细胞壁含脂质较多,其中主要成分是分枝菌酸. 决定抗酸性染色反应,用乙醚脱去分 分枝菌酸,则呈非抗酸染色性.
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剂.也可用加热法促进着色.
6
脱色
使已着色的被染物脱去颜色.常用乙醇,丙酮等 作为脱色剂.脱色剂可以查出细菌与染料结合 的稳定程度,作为鉴别染色用.
微生物细胞计数及染色操作
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微生物细胞计数及染色操作
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微生物细胞计数及染色操作
•大肠杆菌革兰氏染色
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微生物细胞计数及染色操作
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炭疽芽胞杆菌
微生物细胞计数及染色操作
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微生物细胞计数及染色操作
•(二)酵母细胞数的测定操作方法 •1.血球计数板的构造
• 血球计数板是由一块比普通载玻片厚的特制玻 片制成的。玻片中有四条下凹的槽，构成三个平台。
• 显微镜、物镜测微尺、目镜测微尺、血球 计数 板、载玻片等。
• 麦芽汁培养基、酵母菌。 • 吸管、吸水纸等。
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微生物细胞计数及染色操作
四、实验步骤
•（一） 染色实验
1．涂片：将培养24小时的大肠杆菌和未 知菌，培养12-18小时的枯草芽孢杆球 菌、分别作涂片（注意涂片切不可过于 浓厚），干燥、固定。固定时通过火焰 1～2次即可，不可过热，以载玻片不烫 手为宜。
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微生物细胞计数及染色操作
•革兰阳性菌细胞壁特殊组分
•膜磷壁 •壁磷壁酸 酸
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微生物细胞计数及染色操作
•革兰阴性菌细胞壁特殊组分
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微生物细胞计数及染色操作
•革兰阳性菌与阴性菌细胞壁结构比较
细胞壁 强度 厚度
肽聚糖层数 肽聚糖含量
磷壁酸 外膜
脂蛋白 脂多糖
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微生物细胞计数及染色操作
2．染色
（1）初染：加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟， 水洗。
（2）媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖约一 分钟，水洗。
（3）脱色：将载玻片上面的水甩净，并衬以 白背景，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚 不出现紫色时为止，约20～30秒钟，立即 用水冲净酒精。
微生物实验二细菌的简单染色和革兰氏染色_图文_图文
染色结果
金黄色葡萄球菌革兰氏染色结果
染色结果
大肠杆菌革兰氏染色结果
染色结果
金黄色葡萄球菌和大肠杆菌混合菌样的革兰氏染色结果
四、实验结果
显微镜放大倍数＝物镜放大倍数×目镜放大倍数
绘图记录观察结果
思考题
1、在制作涂片中，为什么要进行固定这 一步？
2、革兰氏染色中哪一步关键，为什么？
革兰氏染色法所以能将细菌分为革兰氏阳 性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁 的结构和组成不同决定的。
二、实验原理---革兰氏染色
革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂 结晶紫进行初染，再用碘液媒染，然后用 乙醇(或丙酮)脱色，最后用复染剂(如番红 )复染。经此方法染色后，细胞保留初染剂 蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞 中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染 剂的颜色(红色)，该菌属于革兰氏阴性菌 。
2、干燥：将涂片置火焰高处微热烘干或自然干燥。 3、固定：涂面朝上，通过微火2-3次。 4、染色：待玻片泠却后加结晶紫1-2滴于涂片上，覆盖涂
面染色1-2分钟。 5、水洗：倾去染色液，用水自玻片一端轻轻冲洗至流下的
水变无色为止（注：勿冲去菌体）。 6、干燥：自然干燥，或用吸水纸吸干。 7、镜检：油镜观察并绘图。
二、实验原理---简单染色
染色前必须固定细菌。其目的有二：一是 杀死细菌并使菌体粘附于玻片上；二是增 加其对染料的亲和力。常用的有加热和化 学固定两种方法。固定时尽量维持细胞原 有的形。
二、实验原理---革兰氏染色
革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家 ChristainGram氏创立的，革兰氏染色法可 将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+） 和革兰氏阴性菌（G-）两大类。革兰氏染 色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。
微生物染色ppt课件
2019 3
2.革兰氏染色法
是 1884 年由丹麦病理学家 C.Gram 所创立 的。革兰氏染色法是细菌学上最常用的鉴别 染色法，因为通过此法染色，可将细菌鉴别 为革兰氏阳性菌（ G+ ）和革兰氏阴性菌（ G- ） 两大类。
2019
-
4
革兰氏染色法原理：
革兰氏染色法将细菌分为G＋和G- ，这由两类细菌细胞壁的结构和 组成的不同而决定。用结晶紫初染后，所有的细菌都染上蓝紫色。碘作 为媒染剂能与结晶紫结合形成结晶紫-碘的复合物，增强了染料与菌体的 结合力。用乙醇脱色处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。G＋细菌 的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，且壁厚、类脂含量低，用 乙醇脱色时使细胞壁脱水、网状结构孔径缩小，通透性降低，使得结晶 紫—碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内。虽经洗脱和复染仍然保持 初染剂的蓝紫色。G-细菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄，类脂含 量高，所以在脱色处理时，类脂被乙醇溶解，细胞壁的通透性增大，使 结晶紫—碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染 上复染剂的颜色。
绘出枯草杆菌和大肠杆菌的形态图，并注明 两菌的革兰氏染色的反应性。
1 ．你认为哪些环节会影响革 兰氏染色结果的正确性？其中最关 键的环节是什么？ 2 ．当你对一株未知菌进行革 兰氏染色时，怎样能确证你的染色 技术操作正确，结果可靠？
2019 11
实验二
细菌的芽孢染色
实验目的
1、继续学习微生物标本的制作方法；
2019 2
单染色步骤
1．涂片 取一块载玻片，用记号笔划分出两区域 并做上记号，在两区域中央各滴半滴无菌水，用接种 环以无菌操作法分别取两种菌种在左右两滴水中，和 匀后涂成薄膜。 2．干燥 室温自然干燥或吹干。 3．固定 涂面朝上，通过火焰2~3次。 4．染色 在涂片薄膜上滴加结晶紫染液，使之覆 盖2分钟。 5．水洗 傾倒去染液，斜置载玻片，用洗瓶小水 流沿玻片边缘冲洗，直至水呈无色为止。 6．干燥 室温自然干燥或用吸水纸吸干。
2.革兰氏染色法
是 1884 年由丹麦病理学家 C.Gram 所创立 的。革兰氏染色法是细菌学上最常用的鉴别 染色法，因为通过此法染色，可将细菌鉴别 为革兰氏阳性菌（ G+ ）和革兰氏阴性菌（ G- ） 两大类。
2019
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4
革兰氏染色法原理：
革兰氏染色法将细菌分为G＋和G- ，这由两类细菌细胞壁的结构和 组成的不同而决定。用结晶紫初染后，所有的细菌都染上蓝紫色。碘作 为媒染剂能与结晶紫结合形成结晶紫-碘的复合物，增强了染料与菌体的 结合力。用乙醇脱色处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。G＋细菌 的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，且壁厚、类脂含量低，用 乙醇脱色时使细胞壁脱水、网状结构孔径缩小，通透性降低，使得结晶 紫—碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内。虽经洗脱和复染仍然保持 初染剂的蓝紫色。G-细菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄，类脂含 量高，所以在脱色处理时，类脂被乙醇溶解，细胞壁的通透性增大，使 结晶紫—碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染 上复染剂的颜色。
绘出枯草杆菌和大肠杆菌的形态图，并注明 两菌的革兰氏染色的反应性。
1 ．你认为哪些环节会影响革 兰氏染色结果的正确性？其中最关 键的环节是什么？ 2 ．当你对一株未知菌进行革 兰氏染色时，怎样能确证你的染色 技术操作正确，结果可靠？
2019 11
实验二
细菌的芽孢染色
实验目的
1、继续学习微生物标本的制作方法；
2019 2
单染色步骤
1．涂片 取一块载玻片，用记号笔划分出两区域 并做上记号，在两区域中央各滴半滴无菌水，用接种 环以无菌操作法分别取两种菌种在左右两滴水中，和 匀后涂成薄膜。 2．干燥 室温自然干燥或吹干。 3．固定 涂面朝上，通过火焰2~3次。 4．染色 在涂片薄膜上滴加结晶紫染液，使之覆 盖2分钟。 5．水洗 傾倒去染液，斜置载玻片，用洗瓶小水 流沿玻片边缘冲洗，直至水呈无色为止。 6．干燥 室温自然干燥或用吸水纸吸干。
微生物染色技术(课堂PPT)
包括：脂蛋白：向内与肽聚糖（ＤＡＰ） 相连
脂质双层：液态，似细胞膜 脂多糖：G－菌的内毒素，由 类脂A、核心多糖、特异性多糖组成
2021/3/29
30
（1）革兰氏阴性菌“肽聚糖” （大肠杆 菌）包括聚糖骨架、四肽侧链
四肽侧链的第三位
氨基酸由二氨基庚
二酸（DAP）替代，
以肽健直接与相邻
四肽侧链中的D-丙
N-乙酰葡萄糖胺（N-acetyl glucosamine，G）
溶菌酶作用点
N-乙酰胞壁酸 （N-acetyl muramicacid， M）
2021/3/29
青霉素作用点
26
（2）磷壁酸（Teichoic acid）
G+菌特有，是由核糖醇(Ribitol)或甘油 (Glyocerol)残基经磷酸二酯键相互连接而成的多 聚物，并带有一些氨基酸或糖。约30个或更多磷 壁酸分子组成的长链，穿插于肽聚糖中。
细菌细胞膜的结构与真核细胞 者基本相同，由蛋白质、脂类 和少量的多糖组成。所含的脂 类均为磷脂，不含胆固醇。磷 脂由磷酸、甘油、脂肪酸和含 氮的碱基构成。
2021/3/29
23
凡能破坏肽聚糖结构或抑制其合成的物 质，都能损伤细胞壁而使细菌变形或 杀伤细菌，如：
– 溶菌酶能水解肽聚糖支架的β-1，4糖苷键， 引起细菌裂解。
– 青霉素和头孢霉素能抑制四肽侧链上D-丙 氨酸与五肽桥之间的联结，使细菌不能合 成完整的细胞壁，可导致细菌死亡。
2021/3/29
外膜
①脂蛋白：
位于肽聚糖层和脂质双层之间，起连 接作用，使外膜和肽聚糖构成一个整体。
②脂质双层：
磷脂双层，内嵌外膜蛋白（out membrane protein OMP），具有不同的 功能。如有的外膜蛋白为孔蛋白是小分子 的通道；有的是噬菌体、性菌毛、细菌素 的受体。
脂质双层：液态，似细胞膜 脂多糖：G－菌的内毒素，由 类脂A、核心多糖、特异性多糖组成
2021/3/29
30
（1）革兰氏阴性菌“肽聚糖” （大肠杆 菌）包括聚糖骨架、四肽侧链
四肽侧链的第三位
氨基酸由二氨基庚
二酸（DAP）替代，
以肽健直接与相邻
四肽侧链中的D-丙
N-乙酰葡萄糖胺（N-acetyl glucosamine，G）
溶菌酶作用点
N-乙酰胞壁酸 （N-acetyl muramicacid， M）
2021/3/29
青霉素作用点
26
（2）磷壁酸（Teichoic acid）
G+菌特有，是由核糖醇(Ribitol)或甘油 (Glyocerol)残基经磷酸二酯键相互连接而成的多 聚物，并带有一些氨基酸或糖。约30个或更多磷 壁酸分子组成的长链，穿插于肽聚糖中。
细菌细胞膜的结构与真核细胞 者基本相同，由蛋白质、脂类 和少量的多糖组成。所含的脂 类均为磷脂，不含胆固醇。磷 脂由磷酸、甘油、脂肪酸和含 氮的碱基构成。
2021/3/29
23
凡能破坏肽聚糖结构或抑制其合成的物 质，都能损伤细胞壁而使细菌变形或 杀伤细菌，如：
– 溶菌酶能水解肽聚糖支架的β-1，4糖苷键， 引起细菌裂解。
– 青霉素和头孢霉素能抑制四肽侧链上D-丙 氨酸与五肽桥之间的联结，使细菌不能合 成完整的细胞壁，可导致细菌死亡。
2021/3/29
外膜
①脂蛋白：
位于肽聚糖层和脂质双层之间，起连 接作用，使外膜和肽聚糖构成一个整体。
②脂质双层：
磷脂双层，内嵌外膜蛋白（out membrane protein OMP），具有不同的 功能。如有的外膜蛋白为孔蛋白是小分子 的通道；有的是噬菌体、性菌毛、细菌素 的受体。
《微生物染色法》PPT课件
编辑ppt
13
细菌分裂过程：
➢ ①菌体伸长，核质体分裂 ➢ ②形成横隔壁 ➢ ③子细胞分离
☆少数有菌毛的菌可进行有性繁殖
编辑ppt
8
五、细菌的群体形态
（一）种类：
▲固体培养时的群体形态： ① 菌落（colony) ②单菌落（clone) ③菌苔(lawn)
culture plate
▲液体培养时的群体形态： 编辑ppt
分为发色基团，可与细胞中带正电的组分结合。如Eosin, Congo red , Acid fuchsin 等。
③脂溶性染料—如Sudan black。
编辑ppt
7
四、细菌的繁殖
方式
无性繁殖 有性繁殖
一般为无性繁殖，二分裂法。
➢ 同形裂殖：裂殖后形成的子细 胞大小相等。
➢ 异形裂殖：分裂产生两个大小 不等的子细胞。
二菌落形态1大小2颜色3透明度4表面状态5质地6边缘形态7隆起形状正面观samplesweretakenfromnumberedcoloniesexaminedmicroscopically三影响菌落形态的因素各种微生物在一定条件下形成的菌落其形态特征有一定的稳定性和专一性因而可以作为识别鉴定菌种的一个依据但也受某些因素的影响观察时应加以注意
三 、细菌染色法:
细菌染色
活菌染色
死菌染色
正染色
负染色
普通染色
特殊染色
简单染色法
复杂染色法
芽孢染色法
荚膜染色法 细胞壁染色法
抗酸染色 革兰氏染色
编辑ppt
1
负染色
编辑ppt
2
简单染色
制备涂片标本→染色
涂片
干燥
固定
水洗、吸干
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微生物细胞计数及染色操作
河南师范大学 环境科学与工程实验教学中心
一、目的要求
• 学会血球计数板的使用方法
• 了解革兰氏染色的原理 • 学习并掌握革兰氏染色的方法
二 酵母细胞计数原理
微生物常用的计数方法有两种，即直接计数法和 间接计数法。前者利用血球计数板在显微镜下直接计 数，能立即得到数值，但死活细胞都计数在内。后者 是在乎板上长成菌落后再计数，反应较真实，但费时 太长。本实验是利用血球计数板进行直接计数。计数 前需对样品做适当稀释，按照规定方法及计算公式运 算后，即可得出实际数值。
2．思考题 （1）作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？
其染色成败的关键一步是什么？
（2）当你对一株未知菌进行革兰氏染色时， 怎样能确证你的染色技术操作正确，结果 可靠？
• 9、春去春又回，新桃换旧符。在那桃花盛开的地方，在这醉人芬芳的季节，愿你生活像春天一样阳光，心情像桃花一样美丽，日子像桃子一样甜蜜。20. 6.2820.6.28Sunday, June 28, 2020
(3)将血球计数板用擦镜纸擦净，在中央的计数室上 加盖专用的厚玻片。
(4)将稀释后的酵母菌悬液，用吸管吸取一滴置于盖 玻片的边缘，使菌液缓缓渗入，多余的菌液用吸水
纸吸取，捎待片刻，使酵母菌全部沉降到血球计数 室内。
(5)计数时，如果使用16格×25格规格的计数室，要 按对角线位，取左上、右上、左下、右下4个中格 （即100个小格）的酵母菌数。如果规格为25格 ×16格的计数板，除了取其4个对角方位外，还需 再数中央的一个中格(即80个小方格)的酵母菌数。
• 麦芽汁培养基、酵母菌。 • 吸管、吸水纸等。
四、实验步骤
（一） 染色实验
1．涂片：将培养24小时的大肠杆菌和未 知菌，培养12-18小时的枯草芽孢杆球 菌、分别作涂片（注意涂片切不可过于 浓厚），干燥、固定。固定时通过火焰 1～2次即可，不可过热，以载玻片不烫 手为宜。
．染色
（1）初染：加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟， 水洗。
• 碱性染料初染液——结晶紫（crystal violet）
• 媒染剂——碘（iodine）
• 脱色剂——95％的酒精（ethanol）
• 复染液——番红
三、实验器材
• 大肠杆菌，枯草芽孢杆菌、未知菌；
• 草酸铵结晶紫，番水水溶液，碘液，95% 乙醇，载玻片，显微镜等。
• 显微镜、物镜测微尺、目镜测微尺、血球 计数 板、载玻片等。
细菌染色基本原理
• 革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。 • 它是1884年由丹麦医师Gram创立的。 • 革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌
的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色 反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示； 染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性 细菌，用G-表示。 • 细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细 胞壁的成分和结构不同而造成的。
（2）媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖约一 分钟，水洗。
（3）脱色：将载玻片上面的水甩净，并衬以 白背景，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚 不出现紫色时为止，约20～30秒钟，立即 用水冲净酒精。
（4）复染：用番红液染1～2分钟，水洗。
（5）干燥和镜检：干燥后，置油镜观察。革 兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。 以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准， 过于密集的细菌，常常呈假阳性。
计数室通常有两种规格。一种是大方格内分为16中格， 每一中格又分为25小格；另一种是大方格内分为25中 格，每一中格又分为16小格。但是不管计数室是哪一 种构造；它们都有一个共同的特点，即每一大方格 都是由16×25=25×16=400个小方格组成，见图。
2.血球计数板的使用 (1)用血球计数板计数酵母菌悬液的酵母菌个数。 (2)样品稀释的目的是便于酵母菌悬液的计数，以每 小方格内含有4-5个酵母细胞为宜，一般稀释10倍即 可。
（6）同法在一载玻片上以大肠杆菌与枯草芽 孢杆菌混合制片，作革兰氏染色对比。
• 革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度， 如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱 色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌 龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或 已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。
大肠杆菌革兰氏染色
细胞壁 强度 厚度
肽聚糖层数 肽聚糖含量
磷壁酸 外膜
脂蛋白 脂多糖
革兰阳性菌 较坚韧 20-80nm
可多达50层 占细胞壁干重50%-80%
+ — — —
革兰阴性菌 较疏松 10-15nm 1-2层
占细胞壁干重5%-20% — + + +
• 革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料 （basic dye）初染液；媒染剂 （mordant）；脱色剂（decolorising agent）和复染液（counterstain）。
肽聚糖(peptidoglycan)
革兰阳性菌肽聚糖—聚糖骨架、四肽侧链、五肽交联桥
N-乙酰葡糖胺 N-乙酰胞壁酸
溶菌酶作用点
青霉素作用点
肽聚糖(peptidoglycan)
革兰阴性菌肽聚糖—聚糖骨架、四肽侧链
革兰阳性菌细胞壁特殊组分
膜磷壁酸 壁磷壁酸
革兰阴性菌细胞壁特殊组分
革兰阳性菌与阴性菌细胞壁结构比较
炭疽芽胞杆菌
(二)酵母细胞数的测定操作方法 1.血球计数板的构造
血球计数板是由一块比普通载玻片厚的特制玻
片制成的。玻片中有四条下凹的槽，构成三个平台。 中间的平台较宽，其中间又被一短横槽隔为两半， 每半边上面个刻有一个方格网。方格网上刻有9个 大方格，其中只有中间的一个大方格为计数室，供 微生物计数用。这一大方格的长和宽各为1m，深度 为，其体积为0.1mm3。
4.血球计数板的清洁 血球汁数板使用后，用自来水冲洗，切
勿用硬物洗刷，洗后自行晾干或用吹风机吹 干，或用95％的乙醇、无水乙醇、丙酮等有 机溶剂脱水使其干燥。通过镜检观察每小格 内是否残留菌体或其他沉淀物。若不干净， 则必须重复清洗直到干净为止。
五、实验报告
1．结果
列表比较大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和未知菌 的染色反应，并判断它们分别是G-或G+.
河南师范大学 环境科学与工程实验教学中心
一、目的要求
• 学会血球计数板的使用方法
• 了解革兰氏染色的原理 • 学习并掌握革兰氏染色的方法
二 酵母细胞计数原理
微生物常用的计数方法有两种，即直接计数法和 间接计数法。前者利用血球计数板在显微镜下直接计 数，能立即得到数值，但死活细胞都计数在内。后者 是在乎板上长成菌落后再计数，反应较真实，但费时 太长。本实验是利用血球计数板进行直接计数。计数 前需对样品做适当稀释，按照规定方法及计算公式运 算后，即可得出实际数值。
2．思考题 （1）作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？
其染色成败的关键一步是什么？
（2）当你对一株未知菌进行革兰氏染色时， 怎样能确证你的染色技术操作正确，结果 可靠？
• 9、春去春又回，新桃换旧符。在那桃花盛开的地方，在这醉人芬芳的季节，愿你生活像春天一样阳光，心情像桃花一样美丽，日子像桃子一样甜蜜。20. 6.2820.6.28Sunday, June 28, 2020
(3)将血球计数板用擦镜纸擦净，在中央的计数室上 加盖专用的厚玻片。
(4)将稀释后的酵母菌悬液，用吸管吸取一滴置于盖 玻片的边缘，使菌液缓缓渗入，多余的菌液用吸水
纸吸取，捎待片刻，使酵母菌全部沉降到血球计数 室内。
(5)计数时，如果使用16格×25格规格的计数室，要 按对角线位，取左上、右上、左下、右下4个中格 （即100个小格）的酵母菌数。如果规格为25格 ×16格的计数板，除了取其4个对角方位外，还需 再数中央的一个中格(即80个小方格)的酵母菌数。
• 麦芽汁培养基、酵母菌。 • 吸管、吸水纸等。
四、实验步骤
（一） 染色实验
1．涂片：将培养24小时的大肠杆菌和未 知菌，培养12-18小时的枯草芽孢杆球 菌、分别作涂片（注意涂片切不可过于 浓厚），干燥、固定。固定时通过火焰 1～2次即可，不可过热，以载玻片不烫 手为宜。
．染色
（1）初染：加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟， 水洗。
• 碱性染料初染液——结晶紫（crystal violet）
• 媒染剂——碘（iodine）
• 脱色剂——95％的酒精（ethanol）
• 复染液——番红
三、实验器材
• 大肠杆菌，枯草芽孢杆菌、未知菌；
• 草酸铵结晶紫，番水水溶液，碘液，95% 乙醇，载玻片，显微镜等。
• 显微镜、物镜测微尺、目镜测微尺、血球 计数 板、载玻片等。
细菌染色基本原理
• 革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。 • 它是1884年由丹麦医师Gram创立的。 • 革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌
的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色 反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示； 染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性 细菌，用G-表示。 • 细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细 胞壁的成分和结构不同而造成的。
（2）媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖约一 分钟，水洗。
（3）脱色：将载玻片上面的水甩净，并衬以 白背景，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚 不出现紫色时为止，约20～30秒钟，立即 用水冲净酒精。
（4）复染：用番红液染1～2分钟，水洗。
（5）干燥和镜检：干燥后，置油镜观察。革 兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。 以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准， 过于密集的细菌，常常呈假阳性。
计数室通常有两种规格。一种是大方格内分为16中格， 每一中格又分为25小格；另一种是大方格内分为25中 格，每一中格又分为16小格。但是不管计数室是哪一 种构造；它们都有一个共同的特点，即每一大方格 都是由16×25=25×16=400个小方格组成，见图。
2.血球计数板的使用 (1)用血球计数板计数酵母菌悬液的酵母菌个数。 (2)样品稀释的目的是便于酵母菌悬液的计数，以每 小方格内含有4-5个酵母细胞为宜，一般稀释10倍即 可。
（6）同法在一载玻片上以大肠杆菌与枯草芽 孢杆菌混合制片，作革兰氏染色对比。
• 革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度， 如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱 色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌 龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或 已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。
大肠杆菌革兰氏染色
细胞壁 强度 厚度
肽聚糖层数 肽聚糖含量
磷壁酸 外膜
脂蛋白 脂多糖
革兰阳性菌 较坚韧 20-80nm
可多达50层 占细胞壁干重50%-80%
+ — — —
革兰阴性菌 较疏松 10-15nm 1-2层
占细胞壁干重5%-20% — + + +
• 革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料 （basic dye）初染液；媒染剂 （mordant）；脱色剂（decolorising agent）和复染液（counterstain）。
肽聚糖(peptidoglycan)
革兰阳性菌肽聚糖—聚糖骨架、四肽侧链、五肽交联桥
N-乙酰葡糖胺 N-乙酰胞壁酸
溶菌酶作用点
青霉素作用点
肽聚糖(peptidoglycan)
革兰阴性菌肽聚糖—聚糖骨架、四肽侧链
革兰阳性菌细胞壁特殊组分
膜磷壁酸 壁磷壁酸
革兰阴性菌细胞壁特殊组分
革兰阳性菌与阴性菌细胞壁结构比较
炭疽芽胞杆菌
(二)酵母细胞数的测定操作方法 1.血球计数板的构造
血球计数板是由一块比普通载玻片厚的特制玻
片制成的。玻片中有四条下凹的槽，构成三个平台。 中间的平台较宽，其中间又被一短横槽隔为两半， 每半边上面个刻有一个方格网。方格网上刻有9个 大方格，其中只有中间的一个大方格为计数室，供 微生物计数用。这一大方格的长和宽各为1m，深度 为，其体积为0.1mm3。
4.血球计数板的清洁 血球汁数板使用后，用自来水冲洗，切
勿用硬物洗刷，洗后自行晾干或用吹风机吹 干，或用95％的乙醇、无水乙醇、丙酮等有 机溶剂脱水使其干燥。通过镜检观察每小格 内是否残留菌体或其他沉淀物。若不干净， 则必须重复清洗直到干净为止。
五、实验报告
1．结果
列表比较大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和未知菌 的染色反应，并判断它们分别是G-或G+.