诺如病毒实验室检测

诺如病毒实验室检测
诺瓦克病毒（Norwalk Viruses，NV）是人类杯状病毒科(Human Calicivirus，HuCV)中诺如病毒（Norovirus,NV）属的原型代表株。

NV是一组形态相似、抗原性略有不同的病毒颗粒。

诺瓦克病毒最早是从1968年在美国诺瓦克市暴发的一次急性腹泻的患者粪便中分离的病原。

2002年8月第八届国际病毒命名委员会批准名称为诺如病毒（Norovirus,NV）。

诺如病毒与在日本发现的札幌样病毒（Sapporo-like Virus，SLV），正式名称为札如病毒(Sapovirus,SV)，合称为人类杯状病毒。

诺如病毒感染性腹泻在全世界范围内均有流行，全年均可发生感染，感染对象主要是成人和学龄儿童，寒冷季节呈现高发。

诺如病毒抗体没有显著的保护作用，尤其是没有长期免疫保护作用，极易造成反复感染。

诺如病毒感染性强，以肠道传播为主，可通过污染的水源、食物、物品、空气等传播，常在社区、学校、餐馆、医院、托儿所、孤老院及军队等处引起集体暴发。

诺如病毒有许多共同特征：直径约为26～35nm，无包膜，表面粗糙，球形，呈二十面体对称；从急性胃肠炎病人的粪便中分离，不能在细胞或组织中培养，也没有合适的动物模型；基因组为单股正链RNA；在氯化铯密度梯度中的浮力密度为1.36～1.41g/cm3；电镜下缺乏显著的形态学特征，负染色电镜照片显示，NV是具有典型的羽状外缘，表面有凹痕的小圆状结构病毒。

诺如病毒根据遗传性分为5个基因组，至少有29个基因群，其中基因组I （GGI）有8个基因群，基因组II（GGII）有17个基因群，基因组III（GGIII）有2个基因群，基因组IV（GGIV）和基因组V（GGV）各有1个基因群。

与人类有关的主要是GGI、GGII和GGIV。

一、标本采集注意事项：
粪便标本应在发病首日采集，至多不能超过发病急性期(48～72h)，此时为稀、软便，病毒排出量最多。

一次流行，至少采集10例患者粪便，每份标本量约1～5ml，成形便和肛拭子诊断意义很小。

标本置4℃可存放2～3周，运送也要低温条件。

病人呕吐物是粪便标本的最佳补充，有助于病原的诊断。

该标本的采集、储存和运送条件同于粪便。

从流行病学角度出发，在水、食物或其它外环境标本中检出NV意义重要。

需注意检测技术要锁定在高度怀疑的传播媒介上，尽早采样并置4℃存放，若是饮用水，需用大容量(5～100L)浓集病毒后检测。

二、实验室检测：
1、电镜检查：电镜法分直接电镜法(EM)和免疫电镜法(IEM)，EM 法观察的灵敏
度较低，要求每毫升粪便样品中至少有大约 106个病毒粒子，因此只能用于患病早期病毒大量排出时采集的样本检测。

IEM 法比 EM 法的敏感性可提高100 倍，主要应用患者恢复期血清捕捉同型抗原，从而增加检出率。

电镜法的缺陷在于设备昂贵，不能广泛普及；检测结果与操作者的技能和经验有直接关系；灵敏度相对较低；不适于大规模流行病学调查。

2、免疫法：免疫法包括放射免疫法(RIA)、生物素-亲和素免疫法(Biotin-Avidin
Immunoassy)和酶联免疫法(ELISA)。

RIA法的灵敏度比IEM 法可提高10～100倍，可以检测出抗体升高的水平，为流行病学提供更有参考价值的资料。

RIA 法的不足之处在于它需要 6 d，且需要放射性同位素标记。

为了简化方法，美国疾病预防控制中心建立了生物素-亲和素免疫法，其灵敏度与 RIA 法相当，该方法已成为美国疾病预防控制中心检测NLV抗原和抗体的标准实验方法之一。

1992年Jiang 等重组杆状病毒表达NV衣壳蛋白成功后，建立起的 NV 酶联免疫检测方法快速、灵敏、经济，其不足之处是免疫反应的株型特异性太强，所以应用范围还比较窄。

酶链免疫法特异性强，灵敏度高，诊断迅速，且较经济，是可广泛应用的检测方法。

3、分子生物学检测：分子生物学检测方法杂交技术和逆转录聚合酶链反应
(RT-PCR)除了能更准确、灵敏地检测标本中的NV，尤其是低浓度的NV感染外，最大的优点在于可以进一步对病毒进行基因型的研究，不会受到获得分型单克隆抗体的限制，对流行病学研究具有重要意义。

等温核酸扩增法(NASBA)直接扩增RNA 来检测 NV，样品中病原RNA得到指数级扩增，产物通过琼脂糖凝胶电泳或斑点印迹杂交鉴定结果。

该方法的灵敏度略低于 RT-PCR 法；整个过程只有一步RNA扩增，避免了RT-PCR存在的RNA交叉污染；缩短了操作时间；假阳性率低。

RT-PCR检测食物中NV存在样品病毒量含量低，样品量大且成分复杂等问题，因此病毒富集浓缩、样品处理是检测的关键，其中有两个重要方面影响检测结果，一是样品中病毒浓缩后的回收率，二是抽提核酸的完整程度和纯度。

病毒浓缩病毒浓缩 NV 浓缩方法一般分为两大类，一类为有机絮凝沉淀法，主要使用聚乙二醇（PEG）沉淀，PEG 是具有强
烈吸水性以及凝聚和沉淀蛋白作用的高分子聚合物，先改变样品 pH 值，使毒粒与样品微粒分开，PEG 把病毒沉淀下来，达到浓缩的目的。

目前对于固体样品 PEG 沉淀法是最有效的浓缩方法。

膜过滤法是另一类有效浓缩病毒的方法，通过改变膜的pH值使之与带有电荷的毒粒结合捕捉病毒，这种方法通常用在浓缩大体积的黏度小、内容颗粒小的液体食品或水中。

检测海水、生活污水中的NV曾用过这种方法，为瓶装水和其他饮料浓缩NV提供了参考。

核酸提取食品样品成分复杂，所含有的脂肪、蛋白质、金属离子等物质都是RT-PCR 反应抑制因子。

NV是单链RNA病毒，核酸提取方法的优劣取决于两个方面：核酸的质量和去除抑制因子的能力。

应用较成熟广泛的是胍法 RNA 提取法，即（异）硫氰酸胍-苯酚-氯仿联合裂解抽提法，该方法改进后制成市售的TRIzol、RNAzol、Ultraspec 等产品，与石英砂、磁珠等多孔颗粒相结合，已结合了poly(dT) 或特异探针的磁珠能较高程度的提纯mRNA，去除反应抑制因子。

石英砂或磁珠纯化 RNA与传统的有机试剂（异丙醇、乙醇）沉淀 RNA 相比起来，效果较好，只是成本偏高。