2 第十五章 第二节 基因工程的一般步骤
基因工程的基本操作程序 课件
限制性酶切割 DNA分子
限制片段 琼脂糖电泳
DNA
带有DNA片段的凝胶
分
用缓冲液转 转移至硝酸纤维素膜上
子
移DNA
杂
凝胶
交
滤膜
与放射性标记 DNA探针杂交
吸附有DNA片 段的膜
放射自显影
抗原-抗体杂交
重组体
转化到 E.Coli
细菌启动子 插入的真核 DNA片段
解析：DNA 分子杂交就是不同来源的 DNA 分子的单 链按碱基互补配对原则结合在一起，形成杂合双链的过 程。B 项利用了分子杂交技术(DNA 与 mRNA 之间杂交)。 检测目的基因是否翻译合成蛋白质依据的是抗原—抗体 杂交原理，未用到 DNA 分子杂交原理。
答案：C
生物 种类
植物细胞
动物细胞
微生物细胞
转化 过程
将目的基因插入Ti质 粒的T-DNA上→Ca2+ 处理导入农杆菌细胞 →侵染植物细胞→目 的基因整合到受体细 胞的染色体上DNA上 →植物组织培养→试 管苗表达目的基因→
产生相应性状。
将含有目的基因
的表达载体提纯 →取受精卵→显 微注射→获得导 入目的基因的受 体细胞→早期胚 胎培养→胚胎移 植→获得新性状
第三步：将目的基因导入受体细胞（转化 transformation） 3、将目的基因导入微生物细胞 （1）微生物作为受体的优势
①繁殖速度快，可大量生产 ②生产成本低
（2）导入方法 Ca2+处理
第三步：将目的基因导入受体细胞（转化 transformation） 3、将目的基因导入微生物细胞 （3）原核生物作为受体细胞产生的蛋白质没有空间结构， 需要在体外加工。
基因工程的基本步骤
基因工程的基本步骤
基因工程是一种利用生物技术手段来改变或调节生物体
自身基因表达的方法，从而达到改善生物体性状的目的。
其基本步骤可以概括为以下几个方面：
1. 基因克隆
基因克隆是基因工程学的基础技术之一。
首先要从生物
体的DNA中选取目标基因，并将其放入载体中，然后进行转化，使其进入宿主细胞中并被表达出来。
常用的克隆方法是PCR、
限制酶切和连接等。
2. 基因转染
基因转染是指将已构建好的目标基因载体导入到目标细
胞中，使其发生基因表达和突变。
目前常用的转染方式有病毒介导转染、转染剂克服细胞膜屏障、电穿孔和微射流等。
3. 基因突变
基因突变是一种常用的基因工程手段。
通过改变基因的
序列或结构，使其在生物体内表达的蛋白质产生变异，从而实现对生物体性状的改变。
突变方法包括化学诱变、定向突变等。
4. 基因表达
基因表达是指将生物体中的目标基因导入到宿主细胞中，并使其在细胞中高效表达的过程。
通过各种方式（如新增启动子序列、加强mRNA稳定性、引入信号肽等）来提高基因表达
效率。
5. 基因分析
基因工程完成后，需要进行基因的分析和检验，以确保
目标基因已成功表达且维持了稳定性。
常用的基因分析方法包括PCR、南方杂交、Western blot和质谱分析等。
总之，基因工程是一种综合使用多种生物技术手段的专业技术，它可以很好地提升生物体的性状和生命活力，为人类的健康和福祉做出贡献。
基因工程的基本操作程序主要包括四个基本步骤
巩固练习
1为了培育节水高产品种，科学家将大麦中与抗旱 节水有关的基因导入小麦，得到转基因小麦，其 水分利用率提高了20%。这项技术的遗传学原理 是 A．基因重组 B．基因突变 C．基因复制 D．基因分离点点生物学教学Fra bibliotek巩固练习
2利用苏云金芽孢杆菌的抗虫基因培育的抗虫棉是 否成功，最好检测 A．是否有抗生素产生 B．是否有目的基因表达 C．是否有抗虫的性状出现 D．是否能分离到目的基因
等⑤mRNA⑥核糖体
A、①②③④
B、②③④⑤
C、①③
④⑤ D、①②③⑥
点点生物学教学
巩固练习
6 获取目的基因的方法有多种，下列不属于含目的基因生物细胞中获取 D、利用PCR技术获取
点点生物学教学
巩固练习
7 下列高科技成果中，根据基因重组原理进行的 是（ ）
白基因等。
点点生物学教学
3.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理,你能分 析出不能导入单子叶植物的原因吗?若将一个抗病基因导 入小麦中,理论上讲你应该怎样做? ①要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都 可以侵染单子叶植物； ②要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使 农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌 的Vir区（诱导）的基因，使T-DNA转移并插入到染色体DNA 上。
点点生物学教学
寻根问底：将目的基因直接导入受体细胞不是更简便吗？如
果这么做，结果会怎样？ 提示：有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物中 的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物， 没有进行表达载体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气， 也无法确定什么基因导入了受体植物。此法目前争议颇多，严 格来讲不算基因工程。
基因工程操作步骤
4.目的基因的检测与鉴定 在受体细胞中稳定遗传和正 确表达。
一、目的基因的获取
1 目的基因主要是编码蛋白质的基因： 如：与生物抗性相关的基因、与优良品质相 关的基因、与生物药物和保健品相关的基因、 与毒物降解相关的基因、与工业用酶相关的 基因、具调控作用的因子等。
合成
热稳定的DNA聚合酶
特点
半保留复制、 边解旋变复制
半保留复制、 全解旋再复制
结果
形成整个DNA分子
大量的DNA片段
随堂闯关 PCR技术扩增过程
a、DNA变性（90℃-95℃）: 双链DNA模板 在热作用下， 氢断键裂，形成____单__链_
b、复性（55℃-60℃）: 系统温度D降N低A ，引物 与DNA模板结合，形成局部__双__链____。
③例: 转基因抗虫棉
2.将目的基因导入动物细胞
①方法: 显微注射法
①程序
目的基因表达载体提纯
显微注射
受精卵
取卵（受精卵） 新性状动物
3.将目的基因导入微生物细胞
①微生物作受体细胞原因:
繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少
②常用菌: 大肠杆菌
③常用法: Ca2+处理获得感受态细胞
④过程:
Ca2+处理 大肠杆菌
1.2 基因工程的基本操作程序
知识回顾: 基因工程基本操作的四个步骤
有了目的基因, 我们才能赋予
1.目的基因的获取 一种生物以另一种生物的遗 传特性。
使目的基因在受体细胞中稳
2.基因表达载体的构建 定存在, 并可进行遗传、表达 和发挥作用
载体进入受体细胞稳定表达,
3.目的基因导入受体细胞 才能实现一种生物的基因在 另一种生物中的转化。
基因工程基本操作的四个步骤
结论和总结
基因工程是一门令人兴奋和挑战的领域，它的应用潜力巨大。但同时也需要 我们认真对待其中的道德和伦理问题，并确保安全性和环境保护。
了解基本概念和基因工程在医学、农业和环境领域的应用。
基因工程的目的
为什么要进行基因工程？研究者希望通过编辑和修改生物体的基因，改变其特征和性质。
基因工程基本操作的详细解释
基因工程基本操作包括四个关键步骤：DNA提取、基因克隆、转染和转基因生物培养。
1
DNA提取
从生物体中提取DNA，这是进行基因
基因克隆
基因工程基本操作的四个 步骤
基因工程是一门前沿领域的研究，通过改变生物体的基因来实现某种目的。 了解基因工程的基本操作是学习这一领域的重要第一步。
背景介绍
基因工程是一门革命性的科学，它使用技术手段对生物体的DNA进行编辑和修改。这一领域已经 在医学、农业、环境保护等领域取得了许多重要的成就。
基因工程的定义和应用领域
基因治疗
通过基因工程的技术手段，治 疗一些遗传性疾病。
转基因作物
通过基因工程的技术手段，改 良农作物的特性，提高产量和 抗性。
环境修复
利用基因工程的技术手段，处 理和修复环境中的污染问题。
关键问题和挑战
道德和伦理问题
基因工程技术涉及一些道德和伦理问题，比 如基因改良有可能导致不可预测的后果。
安全性和风险
2
工程的第一步。
将需要编辑和修改的基因插入到载体
DNA中，形成重组DNA。
3
转染
将重组DNA导入目标生物体，使其拥
பைடு நூலகம்
转基因生物培养
4
基因工程技术的步骤详解
基因工程技术的步骤详解基因工程技术是一门重要的生物学领域，它涉及利用科学方法对生物体的基因进行修改，实现对遗传信息的精确控制和改变。
这种技术使得人类能够更好地理解生命的运作机制，并应用于医学研究、农业改良和环境保护等方面。
下面，我们将详细解析基因工程技术的步骤，以使读者对该领域有更深入的了解。
第一步：选择目标基因在进行基因工程前，首先需要确定所要操作的目标基因。
这个基因可以是来源于任何生物体，它可能与某类疾病的发展相关，或者具有对改进农作物品质有帮助的特性。
通过研究和分析，确定目标基因后，接下来就是提取该基因。
第二步：基因片段扩增提取目标基因后，需要进行基因片段扩增，以使其能够在实验中进行进一步的操作。
这一步骤主要利用聚合酶链式反应（PCR）技术，通过在有特定序列的引物的引导下，将目标基因的DNA序列进行扩增。
PCR技术可以在指定的温度下进行多轮反应，最终通过扩增使得目标基因片段得以增加到所需的数量。
第三步：构建重组DNA在获得了足够数量的目标基因片段后，下一步是构建重组DNA。
这是通过将目标基因片段与载体DNA连接，形成重组DNA分子。
载体DNA通常采用质粒或病毒基因组，因为它们可以在细胞内复制和传递基因。
连接目标基因片段和载体DNA的关键是使用限制性内切酶，使得两者的DNA序列能够精确地黏合在一起。
第四步：转化宿主细胞一旦获得了重组DNA，下一步就是将其引入宿主细胞中。
这是通过转化的过程实现的，其中最常用的转化方法是细胞热冲击和电穿孔法。
通过这些方法，重组DNA能够进入宿主细胞并稳定地维持在其中，进而实现基因的表达和传递。
第五步：筛选与表达在成功转化宿主细胞后，下一步是筛选并表达目标基因。
为了筛选出目标基因被正确地引入并表达的宿主细胞，通常会在重组DNA中引入特定的标记基因，如抗生素抗性基因。
这使得只有带有重组DNA的细胞能够在抗生素选择培养基中存活下来。
此外，通过观察目标基因的表达情况，可以确认重组DNA是否成功表达。
基因工程基本操作的四个步骤
利用PCR技术扩增
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端 互补的寡核苷酸引物。
在PCR反应中，模板DNA、引物、四种脱氧核糖核苷酸、DNA聚合酶以及适宜 的缓冲液系统被置于“热循环”的反应环境中，通过精确控制温度，在DNA聚合 酶作用下高特异性、高灵敏度地扩增目的基因。
受体细胞的选择
01
02
03
原核细胞
适用于细菌等原核生物作 为受体细胞，如大肠杆菌。
真核细胞
适用于动物和植物细胞作 为受体细胞，如CHO细胞、 动物胚胎细胞、植物愈伤 组织等。
受精卵
适用于动物基因工程，直 接将目的基因导入受精卵， 实现基因的长期稳定表达。
转化或转染方法
01
02
03
04
化学转化法
利用CaCl2、MgCl2等化 学试剂诱导细菌感受态 细胞的产生，吸收外源 DNA。
载体的构建过程
目的基因的获取和修饰
从供体细胞中获取目的基因，并进行 必要的修饰，如限制性酶切、连接等。
载体的获取和修饰
从宿主细胞中获取载体，并进行必要 的修饰，如限制性酶切、连接等。
目的基因与载体的连接
将目的基因与载体进行连接，形成重 组DNA分子。
重组DNA分子的转化
将重组DNA分子导入到宿主细胞中， 并使其在宿主细胞中复制和表达。
03 目的基因与载体的连接
限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶是一类能识别并附着特定的核苷酸 序列，并对每条链中特定部位的两个脱氧核糖核苷酸
之间的磷酸二酯键进行切割的酶。
限制性核酸内切酶的识别位点通常是DNA双链上的特 异序列，这种序列通常由4-6个核苷酸组成。
基因工程操作的基本步骤
基因工程操作的基本步骤
1.目标选择：确定需要修改的目标基因和目标生物体。
目标基因是指
具有特定功能或性状的基因，目标生物体是指需要进行基因改造的生物体。
2.基因克隆：将目标基因从生物体中分离出来。
这通常是通过使用酶
切酶酶切DNA，然后使用聚合酶链反应（PCR）等技术复制目标基因。
3.基因载体构建：将目标基因插入到合适的基因载体中。
基因载体是
一种可以携带外源基因并将其稳定地转移到目标生物体中的分子。
常见的
基因载体包括质粒、噬菌体和人工染色体等。
4.转化：将构建好的基因载体转移给目标生物体。
转化可以通过物理
方法（如电穿孔、基因枪等）或化学方法（如钙磷共沉淀法、电渗法等）
进行。
5.筛选与鉴定：使用适当的筛选方法来确定是否成功转化目标生物体。
这通常涉及在转化后检测生物体中的目标基因或目标表型。
6.获得纯合系：当目标基因转移到目标生物体中后，需要经过繁殖和
筛选多代，以获得更稳定、纯合的基因型。
7.功能验证：对获得的转基因生物进行功能验证，确定目标基因是否
能够发挥预期的作用。
8.产业化应用：对功能验证通过的转基因生物进行进一步研究和开发，以满足具体的临床、农业或工业应用需求。
需要注意的是，基因工程操作需要严格依照伦理规范和法律法规进行，并进行充分的风险评估和安全措施，以确保操作的安全性和可行性。
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真核生物的转染： 1、磷酸钙转染技术： 2、电穿孔法：原理与原核生物的电穿孔法 一样，主要用于植物细胞的转染。
3、基因枪转染法 4、激光微束穿孔法 5、 显微注射法 6、脂质体（liposome）介导法 7、 多聚物介导法
Injected of cloned DNA
四、重组DNA的筛选和鉴定
根据重组体的表型进行筛选：
插 入 灭 活 法 筛 选 重 组 体
根据标志互补进行筛选：
• 当宿主细胞存在某种基因及其表达产物
的缺陷时，可采用此方法筛选重组体。 即在载体DNA分子中插入相应的缺陷基 因，如宿主细胞重新获得缺陷基因的表 达产物，则说明该细胞中带有重组体。
筛选原理——α互补——兰白筛选：
Lac Z’是lac Z基因的突变型，编码半乳糖 苷酶N端的146个氨基酸（全长1201氨基酸）。 MCS也在这个区域内。这类载体的适合宿主细 胞必须是Z基因突变型，只具有Z基因C端的序 列。当两个Z基因的突变产物在一起时可产生 蛋白质间的互补，称α互补。
具有α互补的细菌培养在含IPTG（异丙基硫 代-β-D-半乳糖苷）及X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚β-D-半乳糖苷）的培养基上会形成的兰色菌落。 相反，不互补则产生白色的菌落。
α互补— —兰白 筛选：
根据DNA限制酶谱进行分析：
用核酸杂交法进 行分析鉴定
(southern blotting technique)
第二节 基因工程的一般步骤
一、获取目的基因的方法
目的基因的筛选和分离可采用以下方法进 行：
• purified DNA 直接从染色体DNA
中分离：
• artifical synthesis 人工合成
• 从mRNA逆转录
cDNA
• From
genomic DNA and cDNA library
DNA连接酶
DNA连接酶
本法适用于在质粒
和目的基因上没有相
重组质粒
同的酶切位点！
尾接法
质粒
内切酶
末端转移酶 +dGTP
目的基因
末端转移酶 +dCTP
DNA连接酶
重组质粒
本法适用于在质粒 和目的基因上没有相 同的酶切位点
三、重组DNA的转化和扩增
重组DNA需导入宿主细胞才能进行增 殖或表达。重组质粒通过转化 （ transformation ） 或 者 转 染 (transfection) 方 式 导 入 宿 主 细 胞 后 ， 即可在适当的培养条件下进行培养以扩 增宿主细胞。
•2、电转化：在高压电场下使细胞产生瞬
间的穿孔，这个穿孔足够大并可维持足够 的时间，使外原DNA进入受体细胞。电穿 孔法的转化效率比钙转化法高2~3个数量级。 这种方法也可用于真核生物的转染。
•3、转染：转染是指转化感染，所以凡是 以噬菌体（如M13）或病毒为载体，以转 化的方法将DNA导入细胞的方法均称为转 染。因此转染就方法来说与转化是一样的。
• polymerase
chain reaction,PCR
二、 DNA的体外重组
通常采用限制性核酸内切酶 (restriction endonuclease)，简称限 制酶，分别对载体DNA和目的基因进行 切断，并将带有切口的载体与所获得的 目的基因连接起来，得到重新组合后的 DNA分子。
粘性末端连接
• 对于带有抗药基因的质粒重组体，可采用
插入灭活法进行筛选。如pBR322中带有 抗氨苄青霉素和抗四环素基因，当将目的 基因插入抗四环素基因后，就可引起该基 因失活，细菌对氨苄青霉素耐药，而对四 环素敏感。在含氨苄青霉素的培养基上能 够生长，而在含四环素的培养基上不能生 长的细菌即为带重组体的细菌。
DNA sequencing :the ultimate way to characterize a clone
Sanger的加减法原理：极其复
杂的核苷酸排列顺序可由简单的 不同长度的核苷酸推算出来
末端终止法的原理
DNA sequence ：
五、基因工程中几个棘手的问题
1. 原核细胞的RNA聚合酶不能识别 真核细胞的启动子。
质粒
目的基因
用同一种或两种
限制性内切酶酶切
DNA连接酶 本法适用于在
质粒和目的基
因上有相同单
重组质粒
或双因 DNA连接酶
核酸酶S1
重组质粒
本法适用于在质粒 和目的基因上没有相 同的酶切位点！
用接头连接
+
目的基因 质粒
用同一种 限制性内切酶酶切
+
接头(linker)
•原 核 生 物 的 转 化 （ transfomation ） 与 转 染 （transfection）
•1 钙转化：细菌细胞在一定的生理状态（感受 态），或经CaCl2处理，或制备成原生质体的 情况下，都可吸收外源ＤＮＡ，利用这一特性 可将重组ＤＮＡ导入受体细胞中，用质粒作载 体的遗传工程一般使用这种方法。
2. 原核细胞不能剪接真核细胞 带内含子的mRNA。
3. 原核细胞表达出的真核细胞蛋白质 往往无活性。
4. 用真核细胞表达系统虽然可以表达有 活性的蛋白质，但其产量太低，成本太 高。