乳酸菌培养及诱导培养基
乳酸菌菌种的培养筛选方法
乳酸菌菌种的培养筛选方法
简介
本文档介绍了乳酸菌菌种的培养筛选方法。
乳酸菌是一种有益菌，常被应用于食品工业和医药领域。
通过培养筛选方法，可以有效筛选出优质的乳酸菌菌种，以满足特定需求。
培养基准备
1. 选择适合乳酸菌生长的培养基，如MRS培养基。
2. 按照培养基的使用说明准备培养基溶液。
3. 灭菌培养基溶液，可使用高压灭菌器或高温灭菌法。
菌种接种
1. 从已有的乳酸菌菌种中选择适合的菌株。
2. 取一定量的菌种，注意保持无菌操作。
3. 将菌种转移到培养基中，可采用无菌环或吸管接种法。
4. 将接种好的培养基培养物置于恒温培养箱中，保持适宜的温度和氧气条件。
筛选方法
1. pH值筛选：选择适宜pH范围的培养基进行培养，通常在
pH 4-6之间。
2. 温度筛选：通过调整培养温度来筛选适应不同温度的菌种。
3. 抗性筛选：将菌种暴露在一定浓度的抗生素中，筛选出对抗
生素具有抗性的菌株。
4. 发酵性筛选：观察菌种在培养基中发酵的能力，以选择产酸
产气能力强的菌株。
筛选结果评估
1. 观察培养基的菌落形态，如形状、颜色等特征。
2. 测定菌株的生长速度和产酸量等。
3. 利用分子生物学方法进行菌株鉴定，如PCR、16S rRNA测
序等。
结论
通过以上培养筛选方法，可以高效地筛选出优质的乳酸菌菌种。
根据特定需求，可以选择适应不同环境和具有良好生产特性的菌株，为食品工业和医药领域的应用提供基础支持。
以上为乳酸菌菌种的培养筛选方法的简要介绍，希望对您有所帮助。
乳酸菌的培养
乳酸菌的培养作者：王庆起来源：《科技资讯》 2012年第18期王庆起(山东睿鹰先锋制药有限公司山东菏泽 274039)摘要:乳酸菌是发酵食品中应用最为广泛的细菌之一。
基于其特殊的生理功能,在发酵工程中,首先要选育优良菌种,但由于微生物在自然条件下都是杂居混生的,因此要选育良种,就必须对其中的纯种微生物进行分离或鉴定。
关键词:乳酸菌生理鉴定中图分类号:TS252.1 文献标识码:A 文章编号:1672-3791(2012)06(c)-0093-01乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)是一类可发酵碳水化合物产生乳酸的革兰氏阳性细菌的总称,主要包括乳杆菌、乳球菌、明串珠菌、片球菌、链球菌及双歧杆菌等。
1 乳酸菌的生理功能乳酸菌的生理功能主要有:(1)具有粘附性和定植能力。
(2)产生抑菌活性的代谢产物。
(3)降低胆固醇。
(4)具有抗变异原性。
(5)改善肝脏功能。
(6)增强免疫功能。
2 乳酸菌的类型乳酸菌大体上可分为两大类。
一类是动物源乳酸菌,一类是植物源乳酸菌。
3 材料与方法3.1 材料3.1.1 样品市售进口奶酪。
3.1.2 培养基(1)MRS液体培养基:蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、葡萄糖20g、乙酸钠5g、柠檬酸三铵1.45g、K2HPO4·H2O 2.6g、MgSO4·7H2O 0.58g、MnSO4·4H2O 0.25g、吐温80 1.0g、蒸馏水1000mL。
(pH 6.2～6.4,121℃,灭菌20min)。
(2)BCG培养基:A、B液灭菌后混匀。
A液:脱脂奶粉50g,1.6%溴甲酚绿酒精液0.35ml,蒸馏水250ml.(90℃,开盖灭菌10min).B液:酵母膏5g,琼脂10g,蒸馏水250ml。
(pH 6.8,121℃灭菌20min)A、B液灭菌后在无菌状态下混匀后倒平板。
3.2 方法3.2.1 样品的处理奶酪的处理:以无菌操作取奶酪1g,放入含有9mL灭菌加热至含40℃左右的生理盐水的灭菌广口瓶内,待奶酪溶解制成1∶10的均匀稀释液,并用无菌生理盐水逐级稀释至10-3、10-4、10-5。
食品中干酪乳杆菌的保存及促进生长的关键因素
食品中干酪乳杆菌的保存及促进生长的关键因素干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）作为一种常见的益生菌，在食品加工和保健品行业中被广泛应用。
了解干酪乳杆菌的保存方法以及促进其生长的关键因素对于保证产品质量和增强其功能性具有重要意义。
本文将以食品中干酪乳杆菌的保存和促进生长为主题，探讨其关键因素。
一、干酪乳杆菌的保存方法1. 低温储存：干酪乳杆菌在低温下能够长时间存活，一般在2-8摄氏度的冷藏环境下保存。
冷藏可延缓菌株的新陈代谢和生长速度，延长其存活时间，但需注意避免低温冷冻，因为低温下可能导致菌株死亡。
2. 乳酸菌培养基：乳酸菌培养基是一种富含营养物质的培养基，可促进菌株生长。
将干酪乳杆菌接种于适宜的培养基中，进行适当的温度和湿度控制，有助于保持其菌落数量和活力。
二、促进干酪乳杆菌生长的关键因素1. pH值：干酪乳杆菌对环境pH敏感，适宜的pH范围对促进其生长至关重要。
一般而言，干酪乳杆菌偏好在pH为4.5-5.5的酸性环境中生长。
在食品加工过程中，可通过调整食品的pH值来提供适宜的生长环境，从而促进干酪乳杆菌的繁殖。
2. 温度：干酪乳杆菌在不同的温度条件下具有不同的生长速率和生长温度范围。
一般来说，干酪乳杆菌较适宜在30-37摄氏度的温暖环境中生长。
在食品加工和储存过程中，务必控制好适宜的温度，以保证干酪乳杆菌的生长和活性。
3. 营养物质：干酪乳杆菌的生长受营养物质的影响。
葡萄糖作为主要碳源，是干酪乳杆菌繁殖所必需的。
此外，氮源、无机盐和微量元素对菌株的生长也起着重要作用。
在食品生产中，可通过添加适量的营养物质来促进干酪乳杆菌的生长，提高菌株的数量和活力。
4. 抗生素：一些抗生素对干酪乳杆菌具有抑制作用，可能会破坏或减缓其生长。
因此，在食品加工和储存过程中，应尽量避免或减少抗生素的使用，以促进干酪乳杆菌的繁殖和生长。
5. 氧气含量：干酪乳杆菌属于厌氧菌，对氧气敏感。
高氧环境会抑制干酪乳杆菌的生长和代谢。
乳酸杆菌
分布区域
乳酸杆菌广泛分布于周围的环境中，特别是动物的消化道、阴道。
为革兰氏阳性杆菌，常呈链状排列，无动力，不形成芽胞，微需氧或厌氧，营养要求严格，较难培养。常见 于牛乳、乳制品，肉制品、啤酒、葡萄酒、水果及果汁，泡菜及麦芽汁中。也寄生于人和动物的口腔、肠道、阴 道中。极少有致病性。
代表菌种
乳酸乳杆菌
广泛分布于自然界，有些菌株是人和动物口腔、肠道及阴道的正常菌群之一，很少致病，除极偶尔引起亚急 性细菌性心内膜炎外，对人基本无害。寄生于口腔的乳酸杆菌在龋齿发生中起重要作用。一般认为寄生于肠道和 阴道的乳酸杆菌对机体有保护作用某些乳杆菌如嗜酸性乳杆菌、保加利亚乳杆菌，常用于饮料的发酵工业。
已经从动物粪便、阴道分泌物、奶酪、酸菜等分离到40多种乳酸杆菌，它们共同属于乳酸杆菌属。它们能拮 抗致病菌，有助于维持机体对抗原的细胞和体液免疫反应。所有乳酸杆菌广泛地应用于腌制泡菜、制作酸奶、青 贮饲料等加工工业。
主要价值
乳酸杆菌在维护人和高等动物机体健康方面具有重要的作用。在营养生理方面，乳酸杆菌可提高蛋白质、乳 糖和钙等营养物质的消化吸收，可产生多种维生素为机体消化吸收所利用；可抑制肠道内腐败菌、致病菌的繁殖， 降低血氨和血中胆固醇的含量，并具有维持肠道内菌群平衡的整肠作用。乳酸杆菌具有免疫调节作用，如能明显 促进细胞分裂、促进抗体产生、活化巨噬细胞，诱导产生干扰素等，提高机体的抗病能力。乳酸杆菌对巨噬细胞 具有活化作用，使巨噬细胞的细胞毒性增强。而且乳酸杆菌还能诱导人外周血单个核细胞（PBMC）产生IL-12， IL-18和γ-干扰素，从而诱导产生Th1型细胞免疫反应。此外，乳酸菌能抑制羟甲基戊二酸辅酶A还原酶，减少肠 道胆固醇的吸收，从而降低体内的胆固醇含量。很多研究也已证明乳酸菌具有降低血清胆固醇和甘油三酯的作用。 乳酸杆菌对胃上皮细胞有高度的亲和力，可通过与病原菌竞争黏附位点，产生乳酸、乙酸、乙酸醋酸等有机酸， 大量分布在消化道黏膜，对病原菌的黏附起屏障作用等机制拮抗病原菌，并产生有机酸细胞素样蛋白等物质和影 响细菌毒物产生的相关代谢，对胃肠道起保护作用。 值得指出的是，乳酸杆菌的作用具有株的特异性，即使是 传统认为安全的乳酸杆菌菌种也不能保证种内所有菌株均安全，因此对乳酸杆菌进行鉴定和检测非常重要。
育肥猪发酵饲料用乳酸菌的培养基及培养条件优化
育肥猪发酵饲料用乳酸菌的培养基及培养条件优化杨胜;张利平;范寰;乔家运;王文杰【摘要】通过正交试验和响应面试验对用于育肥猪发酵饲料的乳酸菌培养基及培养条件进行了优化.结果表明:优化后的培养基配方为酵母粉10 g/L,蛋白胨15 g/L,葡萄糖6 g/L,MgSO4·7H2O 0.2 g/L,MnSO4 0.05 g/L,K2HPO40.2 g/L;优化后的培养条件为培养基初始pH值7.25,培养温度36℃,转速165 r/min.【期刊名称】《甘肃农业大学学报》【年(卷),期】2013(048)004【总页数】5页(P11-14,19)【关键词】乳酸菌;发酵饲料;育肥牛;培养基;响应面试验【作者】杨胜;张利平;范寰;乔家运;王文杰【作者单位】甘肃农业大学动物科学技术学院,甘肃兰州 730070;天津市畜牧兽医研究所,天津300112;甘肃农业大学动物科学技术学院,甘肃兰州 730070;天津市畜牧兽医研究所,天津300112;天津市畜牧兽医研究所,天津300112;天津市畜牧兽医研究所,天津300112【正文语种】中文【中图分类】Q93-335乳酸菌作为一种益生菌，具有调节机体胃肠道正常菌群、保持其微生态平衡、提高饲料消化率的功能[1].乳酸菌在发酵饲料的过程中能产生乳酸菌素和乳酸等有机酸，形成厌氧环境，可以抑制大肠杆菌等致病菌的增值，降低发病率[2－3].代永刚等报道，乳酸菌可分解食物中的蛋白质和糖类，对脂肪也有微弱的分解能力，能促进食物的消化吸收，产生对风味起决定性作用的芳香类物质，提高饲料的适口性[4].巩德球等研究发现，乳酸菌发酵饲料可以提高饲料消化率，降低料肉比和药物使用量，从而增加效益，生产出更优质安全的产品[5].本研究拟通过正交试验优化乳酸菌培养基，响应面试验优化乳酸菌培养条件，以期为发酵饲料用乳酸菌的大规模生产提供一定的科学参考.1 材料与方法1.1 种子培养基酵母粉10g／L，蛋白胨10g／L，MnSO4 0.05g／L，K2HPO40.2g／L，MgSO4·7H2O 1g／L，葡萄糖6g／L，pH 7.0，121℃灭菌15min.1.2 菌种活化将保存于斜面的菌种接一菌环到种子培养基，40℃、140r／min，培养24h，置于4℃冰箱保存，备用.1.3 种子液制备取40mL种子培养基于100mL三角瓶中，灭菌后接入10%活化的菌种，40℃、140r／min培养24h.1.4 菌体浓度测定菌体浓度的测定用分光光度法[6].1.5 活菌总数计数活菌总数用平板计数法测定[7].1.6 培养基优化正交试验设计试验设计为4因素3水平L9（34）的正交试验[8]，试验因素有酵母粉、蛋白胨、葡萄糖和MgSO4·7H2O（表1）.1.7 培养条件优化响应面试验设计根据Design Expert 8软件中的Box－Behnken中心组合设计原理，在单因素试验的基础上，以pH、温度和转速3个因素为自变量，益生菌的生物量为响应值，做3因素3水平的响应面分析试验[9].共17个试验点，每个试验3个重复（表2）.表1 L9（34）正交试验因素水平Tab.1 Factors and levels of L9（34）orthogoral experiment （g·L－1）水平 A酵母粉B蛋白胨C葡萄糖D MgSO4·7H2O 1 10 10 5 0.2 2 15 15 6 0.5 3 20 20 20 1.0表2 响应面试验因素水平表Tab.2 Factors and levels of response surface designx2温度／℃x3转速／（r·min－1）水平 x1 pH值－1 6.5 20 140 0 7.0 30 170 1 7.5 40 2002 结果与分析2.1 正交试验结果培养基成分正交分析试验设计结果见表3，从极差（R）可以看出，4种成分对D600的影响次序依次为：酵母粉＞MgSO4·7H2O＞葡萄糖＞蛋白胨，最优组合A1B2C2D1，即酵母粉 10g／L，蛋白胨15g／L，葡萄糖6g／L，MgSO4·7H2O 0.2g／L.表3 培养基成分正交试验结果Tab.3 The results of orthogonal experiment试验号 A B C D D600 1 1 1 1 1 1.939 2 1 2 2 2 1.906 3 1 3 3 3 1.808 4 2 1 2 3 1.885 5 2 2 3 1 1.933 6 2 3 1 2 1.817 7 3 1 3 2 1.676 8 3 2 1 3 1.713 9 3 3 2 1 1.783 k1 5.653 5.5 5.469 5.655 k2 5.635 5.552 5.574 5.399 k3 5.172 5.408 5.417 5.406 k1 1.884 1.833 0.823 1.885 k2 1.878 1.851 1.858 1.800 k3 1.7241.803 1.807 1.802 R 0.160 0.048 0.052 0.085 32.2 验证试验结果在以上优化培养基配方下进行3次验证试验，平均值为1.964.培养4h后乳酸菌进入生长对数期，18h后达到最大生物量，此后培养时间内生物量基本维持稳定.2.3 响应面试验结果2.3.1 响应面实验设计及结果培养基成分优化后，为了得到最佳培养条件，对温度、转速和pH值3个因素进行了响应面设计试验，以培养18hD600为生物量响应值，试验结果见表4.表4 培养条件相应面试验设计及结果Tab.4 Response surface design and its results of culture conditions试验号 x1 pH值x2转速量x3温度生物量1 0 1 1 1.718 2 0 －1 1 1.980 3 0 0 0 2.105 4 －1 0 1 0.316 5 1 0 －1 2.027 6 1 1 0 1.766 7 －1 1 0 0.424 8 0 －1 －1 1.919 9 0 0 0 2.193 10 1 －1 0 1.912 11 －1 －1 0 0.244 12 1 0 1 1.957 13 0 1 －1 1.916 14 0 0 0 2.129 15 －1 0 10.781对表4数据进行二次回归拟合，以生物量（y）为因变量，pH 值（x1）、转速（x2）和温度（x3）为自变量建立回归方程如下：在利用响应面图分析因素对响应值的影响时，如果响应曲面坡度比较平缓，则表明因素变化对响应值影响不大；如果坡度非常陡，则说明因素变化对响应值影响显著[10].从图1～3可以看出，各因素交互作用对响应值对D600的影响，pH值和温度对D600的交互效应最为显著.从表5可知，x1、x12、x22影响是极显著的.F值的大小可以判断各因素对18hD600影响的强弱.F值越大，影响作用越强[11－12].因此各因素影响程度依次是pH值、温度和转速.模型P值＜＜0.01影响是很显著的，失拟项P＝0.115 4＞＞0.05，说明回归方程具有较好的拟合程度，模型选择合适.通过回归模型和图1分析得y极大值是在：x1＝0.506，x2＝－0.179，x3＝0.617，即 pH 值、转速和温度分别在7.25、164.62r／min和36.17 ℃时D600存在最大值，为2.278.考虑到实际操作的可行性，将最优条件在回归方程得到的理论值基础上修正为：pH 7.3，转速165r／min，温度36℃.2.3.2 模型验证在以上优化条件下进行3次验证试验，平均值为2.129，与预测值较为接近，表明预测值与试验值有较好的拟合性，证明响应面分析法得到该乳酸菌培养条件是真实可靠的.表5 响应面方差分析表Tab.5 Variance analysis table of response surface design来源平方和自由度均方 F Pr＞F Model 7.15 9 0.79 75.47 ＜0.000 1 x1 4.35 1 4.35 413.25 ＜0.000 1 x2 6.632E－003 1 6.632E－003 0.63 0.463 2 x3 8.256E－003 1 8.256E－003 0.78 0.416 2 x1x2 0.027 1 0.027 2.55 0.171 4x1x3 0.072 1 0.072 6.81 0.047 7 x2x3 0.017 1 0.017 1.59 0.262 4 x21 2.57 1 2.57 244.38 ＜ 0.000 1 x22 0.18 1 0.18 17.20 0.008 9 x23 5.289E－003 1 5.289E－003 0.50 0.510 0残差 0.053 5 0.011失拟项 0.048 3 0.016 7.82 0.115 4纯误差 4.130E－003 2 2.065E－003所有项7.20 14图1 转速和温度交互作用响应面Fig.1 Effect of ratational speed and temperature on response surface图2 温度和pH值交互作用响应面Fig.2 Effect of temperature and pH on response surface图3 转速和pH值交互作用响应面图Fig.3 Effect of rotatinal speed and pH on response surface2.3.3 生长曲线菌种在接种后前4h生长较为缓慢，为生长迟滞期（0.4×108cfu／mL），4～14h为生长对数期（1.2×108cfu／mL），30h达到最大吸光度，即最大菌体浓度（2.2×108cfu／mL），此后菌体浓度相对稳定（图4）.图4 试验菌种生长曲线Fig.4 The growth curve of strains3 结论采用正交试验和响应面试验对该乳酸菌的培养基成分和培养条件进行了优化，通过分光光度法在波长600nm处测定培养18h的菌体浓度作为评价指标，得到最优培养基配方为酵母粉10g／L，蛋白胨15g／L，葡萄糖6g／L，MgSO4·7H2O 0.2g／L，MnSO40.05g／L，K2HPO40.2g／L.在最优培养基配方基础上，通过响应面试验，确定该乳酸菌最佳培养条件为pH值7.25，转速165r／min，温度36℃.参考文献[1] 姜旭德，游进，王春华.乳酸菌在畜牧业的应用[J].畜牧兽医科技信息，2007（8）：28－29[2] 杨雪海，赵娜，魏金涛，等.植物乳杆菌对致病性大肠杆菌的抑制效果研究[J].饲料研究，2011（1）：27－28[3] 谷巍，郭洪新，杨长庚.微生态发酵饲料在断奶仔猪初步应用的研究[J].饲料博览，2007（23）：37－40[4] 代永刚，田志刚，南喜平.乳酸菌及其生理功能研究进展[J].农产品加工·学刊，2009（7）：24－27[5] 巩德球，关玮，陆逵，等.热带地区乳酸菌发酵饲料对育肥猪生产性能的影响[J].饲料工业，2012，33（15）：26－28[6] 陈金春.微生物学实验指导[M].北京：清华大学出版社，2005：63－65[7] 中华人民共和国卫生部.GB 4789.2－2010食品微生物学检验菌落总数测定[S].北京：标准出版社，2010：1－5[8] 中国科学院教学研究所数理统计组.正交试验法[M].北京：人民教育出版社，1975[9] 李玉珍，肖怀秋，杨涛，等.响应面优化低值豆粕液态制备多肽工艺[J].大豆科学，2012，31（4）：654－654[10] Yin G H，Dang Y L.Optimization of extraction technology of the Lycium barbarum polysaccharides by 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乳酸菌的制作原理
乳酸菌的制作原理
乳酸菌的制作原理是指利用合适的培养基和条件培养乳酸菌菌株，使其产酸和生长，最终得到活性乳酸菌产品的过程。
乳酸菌的制作过程可以分为以下几个步骤：
1. 菌株的选取：乳酸菌菌株的选择通常基于其对人体有益的特性，如抗菌作用、免疫调节功能等。
常见的乳酸菌菌株包括嗜酸乳杆菌、双歧杆菌等。
2. 培养基的准备：选择合适的培养基是保证乳酸菌生长和繁殖的重要条件。
常用的培养基包括牛乳、乳清、大豆蛋白等，其中添加了一定的碳水化合物作为乳酸菌的能量来源。
3. 接种和培养：将选取的乳酸菌菌株接种到准备好的培养基中，然后在适当的温度和湿度下进行培养。
乳酸菌通常适合在温度为35-40摄氏度的环境中进行培养，而pH值在
4.5-6.5之间是
乳酸菌最适宜的生长条件。
4. 发酵和产酸：培养一段时间后，乳酸菌会开始进行发酵作用，将培养基中的碳水化合物转化为乳酸。
乳酸的积累会降低培养基的pH值，创造出适宜乳酸菌生长的环境。
5. 停止发酵和分离：发酵达到一定程度后，需要停止发酵过程。
通常通过改变培养条件或者降低温度来停止发酵。
然后通过离心、过滤等方法将乳酸菌分离出来。
6. 产品加工和包装：分离出的乳酸菌经过适当的处理和加工，如冻干、稳定剂添加等，最终制成乳酸菌产品。
然后将其进行严格的检验，包装并储存，以保持其活性和稳定性。
总之，乳酸菌的制作原理是通过选择适宜的菌株和培养条件，促使乳酸菌进行发酵作用并产酸，最终得到高活性的乳酸菌产品。
怎样培养天然乳酸菌的方法
怎样培养天然乳酸菌的方法
要培养天然乳酸菌，可以按照以下步骤进行：
1. 准备材料：需要乳酸菌菌种和培养基。
乳酸菌菌种可以从天然的发酵食品中获得，如酸奶或酸菜。
培养基可以用牛奶、酸奶或乳酸菌培养基粉等准备。
2. 准备培养容器：选择一个干净的容器，最好是玻璃或塑料容器。
要确保容器在使用前已经彻底清洁和消毒。
3. 准备培养基：将培养基加热至40-50摄氏度，让其稍微变暖。
4. 加入乳酸菌菌种：将乳酸菌菌种加入培养基中。
要根据菌种和培养基的使用说明来确定加入的数量。
5. 摇晃或搅拌培养容器：将培养容器盖好，用手轻轻摇晃或用棒子轻轻搅拌，使培养基和乳酸菌菌种充分混合。
6. 存放和保温：将培养容器放置在温暖的地方，温度最好在35-40摄氏度之间。
可以使用保温箱或将容器包裹在保温材料中，以保持温度稳定。
7. 观察和维护：每天观察培养容器中的菌落，注意是否有任何变化。
如果需要，可以定期添加新的培养基来维持菌种的生存和繁殖。
8. 储存：一旦乳酸菌培养达到预期的水平，可以将其存储在冰箱中。
将培养物过滤，得到的滤液可以储存于冰箱中，并在之后使用。
需要注意的是，在培养乳酸菌的过程中要注意卫生，避免细菌污染。
另外，如果不具备培养乳酸菌的条件或技术，也可以选择购买乳酸菌制剂，以确保获得健康和安全的乳酸菌产品。
乳酸菌实验报告
乳酸菌实验报告一、实验目的本次实验旨在研究乳酸菌的生长特性、代谢产物以及其在食品发酵中的应用效果，为进一步开发和利用乳酸菌提供科学依据。
二、实验材料与方法（一）实验材料1、菌种：从市场购买的活性乳酸菌饮品中分离得到的乳酸菌菌株。
2、培养基：MRS 培养基（用于乳酸菌的培养和计数）。
3、仪器设备：恒温培养箱、显微镜、pH 计、分光光度计等。
（二）实验方法1、乳酸菌的分离与纯化将购买的活性乳酸菌饮品进行梯度稀释，然后涂布于 MRS 固体培养基上，在 37℃恒温培养箱中培养 48 小时。
挑取单菌落进行多次划线分离，直至得到纯培养的乳酸菌菌株。
2、乳酸菌的生长曲线测定将纯化后的乳酸菌接种到 MRS 液体培养基中，在 37℃恒温摇床中培养。
每隔一定时间取样，测定培养液的 OD600 值（光密度值），绘制乳酸菌的生长曲线。
3、乳酸菌的产酸能力测定在培养过程中，定期测定培养液的 pH 值，以评估乳酸菌的产酸能力。
4、乳酸菌发酵食品的制作选择酸奶和泡菜作为发酵食品的代表，分别将乳酸菌接种到牛奶和蔬菜中，按照常规的发酵工艺进行制作，观察发酵过程中的变化，并对成品进行感官评价和质量检测。
三、实验结果与分析（一）乳酸菌的生长曲线经过测定，乳酸菌的生长曲线呈现出典型的“S”型。
在培养初期，乳酸菌处于适应期，生长缓慢；随后进入对数生长期，细胞数量迅速增加；最后进入稳定期，细胞生长速度减缓，数量趋于稳定。
（二）乳酸菌的产酸能力随着培养时间的延长，培养液的 pH 值逐渐降低，表明乳酸菌具有较强的产酸能力。
在培养 48 小时后，pH 值下降到 40 左右。
（三）乳酸菌发酵食品的制作1、酸奶接种乳酸菌后的牛奶在 42℃恒温培养箱中发酵 6-8 小时，形成了质地细腻、口感酸甜的酸奶。
在发酵过程中，牛奶的酸度逐渐增加，蛋白质凝固，形成了酸奶特有的组织状态。
通过感官评价，自制酸奶的口感和风味与市售酸奶相当。
2、泡菜将乳酸菌接种到蔬菜中，在常温下发酵 3-5 天，制成了泡菜。
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嗜酸乳杆菌试验方法
一株嗜酸乳杆菌产共轭亚油酸条件的优化[J]. 中国酿造，2009
1、基础培养基(脱脂乳培养基)
12.0 g脱脂奶粉，蒸馏水100 mL，pH自然，115℃灭菌20 min。
2、MRS固体培养基
葡萄糖20.0g，蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母浸膏5.0g，
无水乙酸钠5.0g，磷酸氢二钾2.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，
MgSO4·7H2O 0.58g，MnSO4·H2O 0.33g，
琼脂15g，pH 6.8左右，加蒸馏水至1000mL，121℃灭菌20min。
3、产酶培养基：
脱脂乳培养基，并加入一定浓度的亚油酸来诱导产酶。
1 出发菌株的活化及纯化
保藏的嗜酸乳杆菌接种于液体MRS培养基，摇匀后置36℃恒温箱中培养12h，接种于液体培养基中活化2次。
划线接种到MRS固体培养基，36℃恒温培
养36h，嗜酸乳杆菌在120r／min的状态下培养有利于嗜酸乳杆菌的繁殖*。
长出单个菌落后，挑取菌落进行革兰氏染色镜检，确定是否纯种。
嗜酸乳杆菌的形态与菌落特征
在MRS琼脂培养基上需氧培养48h后，菌落微小，不规则，微隆起，有光泽，灰白色，呈透明的玻璃霜花样。
10倍显微镜观察表面凸凹不平，边缘为丝状或卷发样。
革兰氏染色后可见菌体呈短杆状，单个或短链状排列，革兰氏染色阳性。
肉眼观察，嗜酸乳杆菌菌落较小,平台状，不规则、圆形凸起、边缘整齐、质地柔软、灰白色、有光泽。
1）500mL MRS液体培养基
2）5个250mL的三角瓶，橡胶塞，牛皮纸，绳子
3）5个培养皿
4）1个接种环，酒精灯，打火机，酒精
2 种子的制备
活化的菌种接种于基础培养基，于36℃恒温培养24 h，保藏备用。
增菌培养基最佳接种量为3%（活菌数为108个/mL）★
3 产酶诱导培养
用脱脂乳配成12%的产酶液体培养基，每250mL三角瓶中装入100mL(含12g脱脂乳、1.50‰亚油酸)，加入1mL吐温80，115℃灭菌30 min后，接入2 mL 种子液(每mL含菌体5×108个)，36℃培养36h。
▲
100mL 三角瓶装40mL的脱脂乳(含4.8g脱脂乳、1.50‰亚油酸)，将活化后的菌种按3%接种（接种量为1.2mL），混匀，在36℃下静止培养36h。
并添加0.1%(m/v)的乳糖，0.1%的硫酸铵，0.1%的氯化钠。
1）5个100mL的三角瓶
第一次
直接添加LA比较好，且LA添加量为 1.50‰
反应温度为36℃
发酵时间为36h
第二次（回归正交）每个试样平行3次。
（菌种接种量2%、3%、4%、5%、6%）
（发酵时间为12h、24h、36h、48h）
（D-果糖添加量0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%(m/v)）
果糖为产CLA的最佳碳源
（硫酸铵添加量0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%(m/v)）
结合有机物牛肉膏更有利于乳酸菌的生长，CLA产量也最高。
硫酸铵的添加量增加CLA产量反而有所减少。
铵离子被吸收会导致培养基的pH下降不利于CLA 的产生。
※
※于国萍，寇秀颖. 产共轭亚油酸乳酸菌的选育及培养基的确定[J]. 食品工业科技, 2005,26(5):60～62.
（氯化钠添加量0、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%(m/v)）
（直接添加LA比较好，且LA添加量为0.50‰、1.00‰、1.50‰、2.00‰(v/v)）（反应温度为25℃、30℃、36℃、40℃）
（发酵时间为12h、24h、36h、48h）
考察菌体接种量、亚油酸(LA)的添加量、反应温度等因素对菌株嗜酸乳杆菌转化培养条件的影响。
4 分离纯化
培养结束后离心高速冷冻离心机(6000r/m，10min，4℃)收集菌体细胞。
用蒸馏水洗涤2次，离心后称重，及得生物量。
离心后加入4倍体积的pH4.0的缓冲液混匀，以0.5%(m/v)的量添加溶菌酶(30℃保温，1h)，然后再使用超声波细胞破碎仪(超声3s，间歇4s，90次，400W)在冰水浴中进行细胞破碎。
破碎完成后进行离心(8000r/m，10min，4℃)，所得上清液及为粗酶液。
粗酶液的合成反应
取上述制取粗酶液5mL加2mLLA乳浊液底物(5% LA+5% Tween80+90% pH4.0缓冲液，放入冰水浴中超声10min，功率400w)，放在摇床中30℃，120r/min反应3h。
反应结束后，待测。
5 共轭亚油酸的检测
脂肪酸的提取
反应后的溶液中加入5ml正己烷，充分震荡萃取，静置后待分层，收集上清液，在正己烷溶液中加如无水NH3SO4吸水干燥。
与30℃旋转蒸发，去除有机溶剂，将余下的液体收集在试管中待测。
GC-MS检测共轭亚油酸
以未接入菌种、其他步骤和条件同上的情况下所得到的正己烷萃取液为参比、正己烷为溶剂，于波长200nm～300nm处扫描样品，观察波长233nm处有无特征吸收峰。
若在该波长处有特征吸收峰者，表明其发酵液中有CLA生成，读取波长234nm处吸光度值，根据CLA标准曲线所得CLA浓度，计算发酵液中CLA的生成量。
用UV-1600可见紫外分光光度计在190nm～300nm对共轭亚油酸进行波长扫描，以确定其最大的吸收波长。
其波长扫描图如图 2.1，得其最大吸收波长233nm。
图2.1 CLA最大吸收波长扫描图
Fig.2.1 Absorption wave maximum of CLA
* 张智，余萍. 嗜酸乳杆菌的筛选及培养基的优化[J]. 中国乳品工业, 2007, 35(6)：25～27.
★陈洪仪，杨楠. 嗜酸乳杆菌培养的研究[J]. 现代食品科技, 2009, 25(6)：656～660.
▲张浩，曹健，张国艳. 保加利亚乳杆菌中德亚油酸异构酶的研究[J]. 食品研究与开发, 2006, 127(7)：102～107.。