食品中铜绿假单胞菌检测
铜绿假单胞菌的检验流程
铜绿假单胞菌的检验流程
铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的检验流程可以包括以下步骤：
1. 样品采集：从疑似感染源（如伤口、尿液、呼吸道分泌物等）采集样品。
确保采集过程无菌，并采用适当的采样器具和技术。
2. 培养基选择：选择适合于铜绿假单胞菌生长的培养基，如血琼脂、MacConkey琼脂等。
根据需要，还可以选择特殊的培养基，如铜绿假单胞菌选择性培养基。
3. 培养：将采集的样品在选择的培养基上进行斑点接种、刷涂或点菌法接种。
根据不同的培养基和环境条件，培养时间一般为24-48小时。
4. 形态观察：观察培养基上的菌落形态特征。
铜绿假单胞菌的菌落通常呈绿色或蓝绿色，具有金属光泽。
5. 鉴定测试：进行铜绿假单胞菌的鉴定测试，以确认菌株的身份。
常见的鉴定测试包括：
•革兰氏染色：观察菌株的革兰氏染色特征。
•氧化/还原测试：进行氧化/还原测试，如氧化酮酸试验等。
•水解反应：检测菌株的葡萄糖、麦芽糖等的水解反应。
•生化试验：进行生化试验，如氧化酶试验、产芽孢试验等。
6. 进一步确认：根据鉴定测试的结果，可以进行进一步的确认。
例如，可以使用API系统或分子生物学方法（如PCR）进行确认。
请注意，以上是一般的检验流程，具体的步骤和方法可能会因实验室的设备、方法选择和要求而有所不同。
在进行任何检验之前，建议遵循实验室的操作规范和相应的检验标准。
1/ 1。
饮用水中铜绿假单胞菌快速检测的研究进展
食品科技饮用水中铜绿假单胞菌快速检测的研究进展丁言炎1，章小洪2，郑连宝1，沈敏炬1*（1.德清县食品药品检验检测中心，浙江湖州 313200；2.丽水市质量检验检测研究院，浙江丽水 323000）摘 要：铜绿假单胞菌是一种条件致病菌，广泛存在于各类水体环境中，对消毒剂、紫外线等因素具有很强的抵抗力，可引起急性肠道炎等各种疾病。
本文主要阐述了5种饮用水中铜绿假单胞菌快速检测技术的优点和具体应用，可为饮用水中铜绿假单胞菌的检验检测和质量控制工作提供参考。
关键词：铜绿假单胞菌；快速检测；饮用水Research Progress of Rapid Detection of Pseudomonasaeruginosa in Drinking WaterDING Yanyan1, ZHANG Xiaohong2, ZHENG Lianbao1, SHEN Minju1*(1.Deqing Food and Drug Inspection and Testing Center, Huzhou 313200, China; 2.Lishui Institute for QualityInspection and Testing, Lishui 323000, China)Abstract:Pseudomonas aeruginosa is a opportunistic pathogen that widely exists in various water environments. It has strong resistance to disinfectants, ultraviolet rays, and other factors, and can cause various diseases such as acute enteritis. This paper mainly expounds the advantages and specific applications of rapid detection technology of Pseudomonas aeruginosa in five kinds of drinking water, which can provide reference for the detection and quality control of Pseudomonas aeruginosa in drinking water.Keywords:Pseudomonas aeruginosa; rapid detection; drinking water铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）又称绿脓杆菌，是一种常见的水源性致病菌，广泛存在于各类水体中，对消毒剂、紫外线等理化因素具有很强的抵抗力，可引起败血症、脑膜炎和急性肠道炎等疾病。
牙膏中铜绿假单胞菌检验方法
牙膏中铜绿假单胞菌检验方法Detection of Pseudomonas Aeruginosa in Toothpaste1范围本规范规定了牙膏中铜绿假单胞菌的检验方法。
本规范适用于牙膏中铜绿假单胞菌的检验。
2定义铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa属于假单胞菌属，为革兰氏阴性杆菌，氧化酶阳性，大部分能产生绿脓菌素。
3仪器3.1恒温培养箱：36℃±1℃、42℃±1℃。
3.2三角瓶：250mL。
3.3试管：18mm×150mm。
3.4灭菌平皿：直径90mm。
3.5无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或者移液器及吸头。
3.6显微镜。
3.7载玻片。
3.8接种针、接种环。
3.9电磁炉。
3.10高压灭菌器。
3.11恒温水浴箱。
4培养基和试剂4.1SCDLP液体培养基见总则3.1。
4.2十六烷基三甲基溴化铵培养基成分：牛肉膏3g蛋白胨10g氯化钠5g十六烷基三甲基溴化铵0.3g琼脂20g蒸馏水1000mL制法：除琼脂外，将上述成分混合加热溶解，调pH为7.4~7.6，加入琼脂，115℃高压灭菌20min后，制成平板备用。
4.3乙酰胺培养基成分：乙酰胺10.0g氯化钠 5.0g无水磷酸氢二钾 1.39g无水磷酸二氢钾0.73g硫酸镁（MgSO4.7H2O）0.5g酚红0.012g琼脂20g蒸馏水1000mL制法：除琼脂和酚红外，将其他成分加到蒸馏水中，加热溶解，调pH为7.2，加入琼脂、酚红，121℃高压灭菌20min后，制成平板备用。
4.4绿脓菌素测定用培养基成分：蛋白胨20g氯化镁 1.4g硫酸钾10g琼脂18g甘油（化学纯）10g蒸馏水1000mL制法：将蛋白胨、氯化镁和硫酸钾加到蒸馏水中，加热使其溶解，调pH至7.4，加入琼脂和甘油，加热溶解，分装于试管内，115℃高压灭菌20min后，制成斜面备用。
4.5明胶培养基成分：牛肉膏3g蛋白胨5g明胶120g蒸馏水1000mL制法：取各成分加到蒸馏水中浸泡20min，随时搅拌加热使之溶解，调pH至7.4，分装于试管内，经115℃高压灭菌20min后，直立制成高层备用。
铜绿假单胞菌的分离鉴定及流行病学调查
铜绿假单胞菌的分离鉴定及流行病学调查铜绿假单胞菌是一种常见的细菌，它属于铜绿假单胞菌属，是一类极耐环境和抗生素的细菌。
铜绿假单胞菌广泛存在于自然环境中，如土壤、水体、植物等。
它也是人体的正常菌群之一，可以在人体的皮肤、呼吸道、胃肠道等部位自然存在。
然而，在一些病理条件下，铜绿假单胞菌也可以引起各种感染，威胁人类健康。
铜绿假单胞菌的分离鉴定是为了了解其在环境中的分布情况及其对人体的感染能力。
流行病学调查的目的是确定感染源和传播途径，为疫情的控制和防止提供参考。
首先，进行铜绿假单胞菌的分离。
分离铜绿假单胞菌的方法一般是通过在不同的样本（如土壤、水、食品等）上进行菌落计数，从中选取典型的铜绿假单胞菌菌落进行进一步的分离。
常用的分离培养基有MacConkey琼脂和铜绿红脂琼脂两种。
分离完成后，可以通过染色和显微观察来初步鉴定。
其次，进行铜绿假单胞菌的鉴定。
铜绿假单胞菌的鉴定可以使用生化试验和分子生物学方法。
常用的生化试验包括氧化/发酵试验、涂片鉴别、目视鉴别等。
通过观察菌落形态、菌液性状和气泡产生情况等特征，可以初步鉴定铜绿假单胞菌。
进一步的鉴定可以使用分子生物学技术。
通过提取细菌的基因组DNA，可以进行PCR扩增和测序，根据16S rRNA或其它特定基因的序列，与数据库中的铜绿假单胞菌序列进行比对，从而确认其物种鉴定。
最后，进行流行病学调查。
流行病学调查的主要目标是确定感染源和传播途径，以便采取相应的控制措施。
调查可以从病例调查开始，通过回顾病例的流行病学信息，如患者的接触史、食物来源等，可以初步确定感染源。
此外，还可以进行对病例周围环境的调查，包括采集患者及其周围环境的标本，并进行铜绿假单胞菌的分离和鉴定，以确定感染源。
流行病学调查还需要进行流行病学学者之间的信息交流与合作，以便对大规模的疫情进行及时的跟踪和分析。
同时，通过对病例的进一步调查和控制措施的实施，可以减少铜绿假单胞菌感染的发生率，保障人们的健康。
食品中铜绿假单胞菌检测.课件(1).ppt
• 铜绿假单胞菌的菌体形态
无芽孢，无夹膜，革兰氏染色后为红色， 革兰阴性杆菌，有单鞭毛或丛鞭毛，运动 活泼。菌体的大小为0.5～1µm×1.5～ 3.0µm，菌体笔直或弯曲。
三、铜绿假单胞菌的检测
（一）检测方法（滤膜法） （二）检测原理 （三）试剂和设备 （四）检测步骤 （五）报告
（一） 铜绿假单胞菌检测方法 （滤膜法）
课堂测验
❖ 1. GB19298-2014《包装饮用水》的微生物指标中， 增加了 的检测，删除了 的检测。
❖ A.菌落总数 B. 大肠菌群 C. 铜绿假单胞菌 D.霉菌
❖ 2. 铜绿假单胞菌可引起局部化脓性炎症，也可引
起
。
❖ A.中耳炎 B.角膜炎 C.胃肠炎 D.以上都是
❖ 3.下列
不是铜绿假单胞菌的检测试剂。
国内污染情况：
-瓶装天然矿泉水铜绿假单胞菌的检出率1.2％～ 23.6％； -瓶装饮用纯净水铜绿假单胞菌的检出率11.6％。
➢ 国外污染情况：
-Richards等在104件检品中的4件分离到铜绿假单 胞菌； -Rosenberg报告德国1.2％～10.2％的瓶装矿泉水 检出铜绿假单胞菌。
一、检测背景
（4）产氨试验
未加入钠氏试剂
深黄色到砖红色
阳性
阴 性
加入钠氏试剂
6.计数
• 计数滤膜上产绿脓色素的菌落以获得铜绿假单胞菌 的数量。
• 在紫外灯下产生荧光且在乙酰胺肉汤中产氨的所有 菌落证实为铜绿假单胞菌，并进行计数。
•将氧化酶反应阳性、 乙酰胺肉汤产氨、金氏B培养基 上显荧光的红褐色菌落进行计数。
5. 确证性试验
➢ （1）营养琼脂纯化 ➢ （2）氧化酶试验 ➢ （3）金氏B培养 ➢ （4）产氨试验
包装饮用水中铜绿假单胞菌检测
227科研与教育2020年第3期包装饮用水中铜绿假单胞菌检测钟 杰（深圳市计量质量检测研究院，广东 深圳 518000）摘 要：随着现代生活水平的提高，饮用水安全问题越来越受到关注。
铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种极具危害性的致病菌，检测其在饮用水中是否符合规定，对提高包装饮用水品质、普及健康用水理念有很大帮助。
检测方法参考新标准《食品安全国家标准包装饮用水生产卫生规范》（GB 19304—2018）中的铜绿假单胞菌滤膜-过滤法，并将检测出铜绿假单胞菌的水质通过PCR法扩增进行验证实验。
分析实验条件对结果的影响，并将结果与标准规定比对，判断抽取包装饮用水的质量，为消费者生产商提供可靠数据，为相关质量卫生部门加强监督管理提供依据。
关键词：包装饮用水；铜绿假单胞菌；滤膜-过滤法；PCR法中图分类号：R123.1 文献标志码：A 文章编号：2096-3092（2020）03-0227-02随着生活水平的提高，包装饮用水已在人们的日常生活中得到普及。
矿泉水方便易携带且口感好，桶装水便于家庭饮用且健康、安全，这些改变了人们长期以来的饮水习惯。
近年曝光的包装饮用水企业，很多是因为不合乎标准，微生物（铜绿假单胞菌）超标引起水质污染。
造成包装饮用水中铜绿假单胞菌超标的主要原因为水源遭受铜绿假单胞菌污染或生产过程中卫生控制不严格没有及时杀灭病菌，这对抵抗力较弱的人群存在较大健康风险。
因此，及时检测避免其带来经济损失是非常重要的。
为了进一步了解广东省包装饮用水的卫生状况，现随机从市面抽检包装饮用天然矿泉水和饮用纯净水进行检测。
机选取在2017年55批、2018年90批和220批。
1.2 菌株菌体有1～3根鞭毛，运动活泼。
/CN琼脂，乙酰胺肉试剂：萘啶酮酸（CN琼脂配套试剂），甘油，钠氏试剂（乙酰胺肉汤配套试剂），氧化酶试纸。
1.4 评价标准包装饮用矿泉水和饮用纯净水测定方法和标准参考新发行的标准《食品安全国家标准包装饮用水生产卫生规范》（GB 19304—2018）进行。
食品检验检测指标种类
食品检验检测指标种类食品安全是事关每个家庭、每个人的重大基本民生问题，加强监管、提升食品行业素质是实现食品安全形势持续稳定好转的根本基础。
食品检测作为食品安全的重要组成部分和关键环节，具有十分重要的意义。
一、微生物类项目1.菌落总数菌落总数是指示性微生物指标，并非致病菌指标。
主要用来评价食品清洁度，反映食品在生产过程中是否符合卫生要求。
菌落总数超标说明个别企业可能未按要求严格控制生产加工过程的卫生条件，或者包装容器清洗消毒不到位；还有可能与产品包装密封不严，储运条件控制不当等有关。
2.大肠菌群大肠菌群是国内外通用的食品污染常用指示菌之一。
食品中检出大肠菌群，提示被致病菌（如沙门氏菌、志贺氏菌、致病性大肠杆菌）污染的可能性较大。
本次检出大肠菌群超标的产品均未检出致病菌，结合居民膳食结构、抽检情况等因素综合分析，健康风险较低，但反映该食品卫生状况不达标。
大肠菌群超标可能由于产品的加工原料、包装材料受污染，或在生产过程中产品受人员、工器具等生产设备、环境的污染、有灭菌工艺的产品灭菌不彻底而导致。
3.霉菌霉菌超标主要原因可能是原料或包装材料受到霉菌污染，产品在生产加工过程中卫生条件控制不到位，生产工器具等设备设施清洗消毒不到位或产品储运条件不当而导致。
4.霉菌和酵母霉菌和酵母超标原因可能是加工用原料受霉菌污染，也可能是流通环节抽取的样品霉菌和酵母超标，后者为储运条件控制不当导致。
霉菌和酵母在自然界很常见，霉菌可使食品腐败变质，破坏食品的色、香、味，降低食品的食用价值。
5.铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌是一种条件致病菌，广泛分布于各种水、空气、正常人的皮肤、呼吸道和肠道等，易在潮湿的环境存活，对消毒剂、紫外线等具有较强的抵抗力，对于抵抗力较弱的人群存在健康风险。
天然矿泉水中铜绿假单胞菌超标可能是源水防护不当，水体受到污染；生产过程中卫生控制不严格，如从业人员未经消毒的手直接与矿泉水或容器内壁接触；或者是包装材料清洗消毒有缺陷所致。
铜绿假单胞菌检验标准方法
铜绿假单胞菌检验标准方法本标准是由《铜绿假单胞菌检验标准方法》编写，由中国国家质量技术监督局批准，现予以公布。
一、总则1.1 本标准规定了铜绿假单胞菌的检测方法。
1.2 本标准适用于含有铜绿假单胞菌的药物，食品，生物制品，洗涤剂等产品的检测。
二、试剂2.1 生化培养基：肉汤培养基，布洛绿培养基，糖胞培养基，等。
2.2 其他试剂：自热蓝钝化试剂，绿色磷酸钴溶液，盐酸苯溴醇溶液，1.45%氯化钠溶液，洗涤剂，烧杯，胶体金，正确滴定管，滤纸等。
三、标本预处理3.1 根据样品的不同，采用不同的预处理方法，如：（1）药物检验：①总菌数：将标本加水（按标本类型要求）搅拌分散，置温度25℃-35℃条件下培养3-5小时，取其液滴，用10倍浓缩液滴定管稀释后，每管各滴取3滴，移液到细菌晶胞培养基中，置温控设备培养2-4天；②尿路感染：将标本通过磨细处理，搅拌均匀，取1mL稀释，加入9mL布洛绿培养基中，摇匀，滴入滤纸上，用芳香族氯酚橙溶液杀菌，置温控设备培养1-2天；（2）食品检验：①总菌数：将标本加水（按标本类型要求）搅拌分散，取其液滴，用10倍浓缩液滴定管稀释后，每管各滴取3滴，移液到肉汤培养基中，置温控设备培养2-4天；②污染菌：将标本通过磨细处理，搅拌均匀，取0.1mL分装，加入9.9mL糖胞培养基中，摇匀，置温控设备培养4-8小时；（3）洗涤剂检验：①总菌数：将标本加水（按标本类型要求）搅拌分散，取其液滴，用10倍浓缩液滴定管稀释后，每管各滴取3滴，移液到肉汤培养基中，置温控设备培养2-7天；②污染菌：用1.45%氯化钠溶液，洗涤剂混合清洗烧杯，将标本加入，搅拌均匀，取1mL稀释，加入9mL糖胞培养基中，摇匀，置温控设备培养4-8小时。
四、检测方法4.1 鉴别：通过观察培养基上菌落性质，如颜色，形态，菌落外观，大小，来确定菌株；4.2 鉴定：采用通用鉴定方法（如，免疫学鉴定，生物学鉴定，代谢鉴定等），以确定所测菌株是否是铜绿假单胞菌。
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3、生化特性 • 氧化酶和过氧化氢酶阳性。O/F试验为氧化型，
还原硝酸盐为亚硝酸盐，分解乙酰胺产生氨。 98 ％菌株产生水溶性荧光色素。铜绿假单胞菌能 液化明胶，酪蛋白水解，但淀粉不水解。90 ％以 上的菌株产生蓝绿色色素。 • 分解蛋白质能力强，发酵糖类能力较低，氧化分 解葡萄糖，产酸不产气，不分解甘露醇、乳糖及 蔗糖，能液化明胶，分解尿素，不形吲哚，氧化 酶试验阳性，还原硝酸盐产气，靛基质阴性，不 产硫化氢。
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计数结果说明
• 菌落计数公式： N＝P＋F(cF/nF)＋R(cR/nR)
– P是呈蓝/绿色的菌落数（所有证实为铜绿假单胞 菌的菌落）。
– F是没有绿脓色素但显荧光的菌落数。 – R是呈红褐色的菌落数。 – nF是进行产氨测试的显荧光菌落数。 – cF是产氨阳性的显荧光菌落数。 – nR是进行产氨、氧化酶、金氏B培养基上显荧光
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• 铜绿假单胞菌可由多种途径传播，但主要是通过 污染医疗器械、用具及带菌医护人员引起医源性 感染，因此，对烧伤病房、手术器械及治疗器械 应进行严格消毒灭菌，以保证无铜绿假单胞菌的 污染。对铜绿假单胞菌感染的治疗，可应用庆大 霉素、多粘菌素B和羧苄青霉素。
• 铜绿假单胞菌抵抗力较其他革兰阴性菌强， 56℃1h可杀灭，对很多抗生素具有耐受性。对消 毒剂、干燥、紫外线等理化因素及不良环境抵抗
纯化
• 营养琼脂：将需验证的可疑菌落划线接 种营养琼脂培养基，于36℃±1℃培养 20h～24h，对可疑菌进行纯化。
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将最初显红褐色的菌落进行氧化酶试验 • 氧化酶试验 ： • 原理：氧化酶（细胞色素氧化酶）是细胞色素呼吸酶系统
的最终呼吸酶。具有氧化酶的细菌，首先使细胞色素C氧 化，再由氧化型细胞色素C使对苯二胺氧化，生成有色的 醌类化合物。 • 操作：取2～3滴新鲜配制的氧化酶试剂滴到放于平皿里的 洁净滤纸上。用铂金丝接种环或玻璃棒，将适量的纯种培 养物涂布在预备好的滤纸上。在10秒内显深蓝紫色的视为 阳性反应。也可以按照商品化氧化酶测试产品的说明书进 行该项测试。
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培养基和试剂
• 假单胞菌琼脂基础培养基/CN琼脂（低温避 光保存）
• 金氏B 培养基（低温避光保存） • 乙酰胺肉汤 • 营养琼脂 • 氧化酶试剂 • 钠氏试剂（配制好之后低温避光保存）
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设备和仪器
• 玻璃器具：所有玻璃器皿使用前需121℃高 压蒸汽灭菌15分钟
• 恒温培养箱：36℃±1℃ • 紫外灯：波长应为360±20nm • 滤膜：直径47mm，微孔径为0.45μｍ （处理方法
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国内外污染情况- 参考文献
• 国内污染情况： -瓶装天然矿泉水铜绿假单胞菌的检出率1.2％～23.6％； -瓶装饮用纯净水铜绿假单胞菌的检出率11.6％。
• 国外污染情况： -Richards等在104件检品中的4件分离到铜绿假单胞菌； -Rosenberg报告德国1.2％～10.2％的瓶装矿泉水检出铜 绿假单胞菌。
测试的红褐色菌落数。 – cR是产氨、氧化酶、金氏B培养基上显荧光测试
均呈阳性的红褐色菌落数。
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• 举例
N=17+16×(2/5)+10×(3/5) – 17：呈蓝/绿色的菌落数； – 16：没有绿脓色素但显荧光的菌落数； – 2：产氨阳性的显荧光菌落数； – 5：进行产氨测试的显荧光菌落数； – 10：呈红褐色的菌落数； – 3：产氨、氧化酶、金氏B培养基上显荧光测试均
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结果观察
培养20h～24h观察滤膜上菌落的生长 情况并计数，防止因为培养导致菌落过分 生长而出现菌落融合。（ 40h～48h时更 容易观察产色素情况和荧光情况）。
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可疑菌落计数情况
• 计数所有显蓝色或绿色（绿脓色素）的菌落，初步 判定为铜绿假单胞菌。
力强，对化学药物的抵抗力比一般革兰氏阴性菌 强大。
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二、生物学特性
1. 培养特性 本菌属于假单胞菌属，是一种
非发酵革兰阴性无芽孢杆菌，菌体 细长且长短不一，有时呈球杆状或线状，成对或 短链状排列。菌体的一端有单鞭毛，在暗视野显 微镜或相差显微镜下观察可见细菌运动活泼。 2．菌体形态
无芽孢，无夹膜，革兰阴性杆菌，有单鞭毛 或丛鞭毛，运动活泼。菌体的大小为0.5～ 1µm×1.5～3.0µm，菌体笔直或弯曲。
自动生化鉴定仪器 生化试剂条（以国标法为参照，二者符 合率99.6％- 参考文献）
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铜绿假单胞菌
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一、概 述
• 铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）俗称绿脓杆菌， 因为在代谢过程中产生水溶性的绿色色素பைடு நூலகம்使伤 口与创面呈绿色，故名绿脓杆菌。
• 铜绿假单胞菌能在许多污染物质中存活并繁殖， 生长营养需求不高，善于利用各种碳源和氨化合 物作为氮源，在水、土壤、食品以及医院等环境 广泛存在，甚至在蒸馏水、消毒液也不例外，如 季铵类消毒液，特别是含有一些有机物的液体。
• 计数滤膜上所有发荧光不产绿脓色素疑似铜绿假单 胞菌菌落，并进行乙酰胺肉汤确定试验。
（在紫外线下检查滤膜时，应避免长时间在紫外光 下照射，否则可能会将平板上的菌落杀灭，而导 致无法在证实培养基上生长。）
• 将其它所有红褐色不发荧光的菌落进行氧化酶试验 、乙酰胺肉汤、金氏B培养基确证实验。
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：如滤膜未经灭菌，则使用前需先将滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水，置于沸水浴中煮沸灭菌3次， 每次15 min。前两次煮沸后需更换水，用蒸馏水洗涤2次～3次，以除去残留溶剂。建议使用一次性 无菌滤膜。）
• 显微镜：10×～100× • 冰箱：0℃～8℃
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操作步骤-水样过滤
在100级的洁净工作台进行过滤操作。 首先用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分， 将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上， 固定好滤器，将250mL水样或稀释液通 过孔径0.45μm的滤膜过滤，然后将过滤 后的滤膜贴在已制备好的CN琼脂平板上， 平铺并避免在滤膜和培养基之间夹留着 气泡。
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产荧光素实验（金氏B培养基）
• 原理：蛋白胨提供氮源，磷酸盐促进荧光素 的产生并抑制绿脓色素的产生，硫酸镁为 荧光素的产生提供必须的阳离子，琼脂是 培养基的凝固。
• 操作：将上述呈红褐色的且氧化酶反应呈阳 性的培养物接种于金氏B培养基上，于 36℃±1℃恒温箱培养24h～5d。 每天需取 出在紫外灯下检查其是否产生荧光性，将 5d内产生荧光的菌落记录为阳性。
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三、致病性
• 主要致病物质是内毒素，此外尚有菌毛、荚膜、胞外 酶和外毒素等多种致病因子。可引起局部化脓性炎症 ，也可引起中耳炎、角膜炎、尿道炎、胃肠炎、心内 膜炎 、脓胸，还可引起菌血症、败血症及引起婴儿严 重的流行性腹泻。 • WHO的HACCP评估明确指出铜绿假单胞菌是婴儿瓶装 饮用水的危害指示菌，可造成婴儿腹泻。尤其是抵抗 力较差的老弱病幼孕人群，饮用含铜绿假单胞菌的瓶 装水很可能导致疾病的发生，患者食入103~104个菌体细 胞即可被侵害。铜绿假单胞菌的生长还将增加亚硝酸 盐的含量-参考文献。
呈阳性的红褐色菌落数； – 5：进行产氨、氧化酶、金氏B培养基上显荧光测
试的红褐色菌落数。
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• 样品稀释 若样品污染严重，建议对样品进行稀
释，如10倍递增稀释：取30ml样液加入 至270ml无菌生理盐水中，混匀，以此类 推，进行系列稀释。
• 报告 结果以 CFU/250ml计。
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• 其他确证试验方法
• 刚出厂的产品中铜绿假单胞菌数量较少，但有文献报 道5加仑桶装产品（15～31天的保存期），铜绿假单胞 菌可生长繁殖达到 CFU/ml。
• 国内卫生标准：0 CFU/250ml
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三、实验室检验
GB/T 8538-2008 铜绿假单胞菌检测（滤膜法）
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原理
将250mL水样用孔径为0.45μm的滤膜过滤， 并将滤膜移至CN琼脂培养基上，于36℃士1℃恒 温箱中培养48h，能够在CN琼脂上生长并产生绿 脓菌素，或者能够在CN琼脂上生长并且氧化酶呈 阳性、紫外光（360±20nm）照射下能发荧光、 能够利用乙酰胺产氨的革兰氏阴性无芽孢杆菌， 经证实为铜绿假单胞菌，则其检测结果为阳性。
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产氨实验（乙酰胺肉汤）
• 原理：铜绿假单胞菌产生一种脱酰胺酶，可使 乙酰胺经脱酰胺作用释放氨，滴加钠氏试剂（ 碘化汞钾），氨在碱性条件下与碘化汞钾作用 ，生成红色的络合物。
• 操作：将纯培养物接种到装有乙酰胺肉汤的试 管中，在36℃±1℃下培养20h～24h。然后向 每支试管培养物加入1～2滴钠氏试剂，检查各 试管的产氨情况，如表现出从深黄色到砖红色 的颜色变化，则为阳性结果，否则为阴性。