原核表达及蛋白质的纯化与浓度测定
维真生物-原核蛋白的表达、分离和纯化
原核蛋白的表达、分离和纯化实验原理：携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21中，在37℃，IPTG 诱导下，超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸（NTA）使镍离子（Ni2+）固相化的层析介质加以提纯，实为金属熬合亲和层析（MCAC）。
蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。
实验材料：大肠杆菌BL21试剂、试剂盒：LB液体培养基、氨苄青霉素、Washing Buffer、Elution Buffer、IPTG、蒸馏水、胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠仪器、耗材：摇床、离心机、层析柱、离心管、移液枪、枪头盒、烧杯、玻璃棒实验步骤：一、试剂准备1. LB液体培养基：Trytone 10 g，yeast extract 5 g，NaCl 10 g，用蒸馏水配至1000 mL。
2. 氨苄青霉素：100 mg/mL。
3. 上样缓冲液：100 mM NaH2PO4，10 mM Tris，8M Urea，10 mM2-ME，pH8.0。
4. Washing Buffer：100 mM NaH2PO4，10 mM Tris，8 M Urea，pH6.3。
5. Elution Buffer：100 mM NaH2PO4，10 mMTris，8M Urea，500 mM Imidazole，pH8.0。
6. IPTG：100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。
二、获得目的基因1. 通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。
2. 通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。
人乳酸脱氢酶a基因的原核表达及其蛋白的纯化
人乳酸脱氢酶a基因的原核表达及其蛋白的纯化人乳酸脱氢酶a基因的原核表达及其蛋白的纯化人乳酸脱氢酶a基因在细胞过程中起着至关重要的作用。
对于这个主题，我们将从原核表达开始深入探讨，并结合蛋白的纯化过程，逐步展开全面评估和详细讨论。
1. 人乳酸脱氢酶a基因的重要性人乳酸脱氢酶a基因是一种编码人体内催化丙酮酸还原为乳酸的酶的基因。
该基因的表达与细胞内能量代谢息息相关，对于维持细胞内稳态至关重要。
深入了解这一基因在细胞中的表达和功能具有重要意义。
2. 原核表达的意义和挑战在研究人乳酸脱氢酶a基因时，选择合适的表达系统是至关重要的。
原核表达系统由于其高效、简便以及成本低廉而备受青睐。
然而，在原核表达过程中仍然存在着诸多挑战，例如蛋白的溶解和折叠问题，对于这些问题的解决将直接影响目标蛋白的纯化。
3. 蛋白的纯化过程蛋白的纯化过程对于后续实验的结果和分析至关重要。
在纯化过程中，采用合适的方法和技术能够有效地去除杂质，确保目标蛋白的纯度满足后续实验的需求。
4. 个人观点和理解在进行人乳酸脱氢酶a基因的原核表达及其蛋白的纯化过程中，科学家们需要克服不少困难，但一旦成功将获得来自对基因和蛋白的深入理解。
对于这一主题，我认为深入挖掘其相关的细胞机制，有利于我们更好地理解细胞内的代谢过程，从而为细胞生物学和分子生物学领域的研究提供重要参考。
总结回顾在本文中，我们深入探讨了人乳酸脱氢酶a基因的原核表达及其蛋白的纯化过程。
通过从原核表达的意义和挑战开始，逐步对蛋白的纯化过程展开论述，希望能够给读者带来全面、深刻和灵活的理解。
在探讨的过程中，我们也共享了个人的观点和理解，期望能够引发更多学术讨论和思考。
以上是一篇有关人乳酸脱氢酶a基因的原核表达及其蛋白的纯化的文章，希望对你有所帮助。
人乳酸脱氢酶a基因的原核表达及其蛋白的纯化是生物技术领域中一个极其重要的课题。
通过对这一过程的研究，人们可以更深入地了解基因的表达调控机制，以及蛋白质的结构和功能特点。
原核蛋白表达流程
原核蛋白表达是一种常用的蛋白质生产方法，可以通过大肠杆菌等原核细菌表达目标蛋白。
以下是一个典型的原核蛋白表达流程：1. 选择表达系统和载体：选择适合的原核表达系统和载体。
常用的原核表达系统包括大肠杆菌系统（如E.coli），常用的载体包括pET、pGEX等。
2. 构建重组质粒：将目标基因克隆到选定的表达载体上，通常采用限制性内切酶切割和连接方法，确保目标基因正确插入载体。
3. 转化宿主菌：将构建好的重组质粒转化入宿主菌中，一般选择适当的大肠杆菌菌株，如BL21(DE3)等。
4. 培养菌液：将含有重组质粒的宿主菌接种到适当的培养基中，进行菌液的培养。
培养条件可根据所选的菌株和载体进行优化，包括温度、培养时间、培养基成分等。
5. 诱导表达：在适当的生长阶段，向培养基中加入适量的诱导剂，常用的诱导剂包括异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）。
6. 细胞破碎：经过一定时间的表达后，收集培养菌液并将细菌进行破碎，释放目标蛋白。
破碎方法可以选择超声波破碎、高压破碎等。
同时添加适量的蛋白酶抑制剂，避免蛋白质的降解。
7. 蛋白纯化：通过一系列的蛋白纯化步骤，如亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等，分离纯化目标蛋白。
此步骤可以根据目标蛋白的特性和需求进行优化。
8. 鉴定和确认：对纯化得到的蛋白进行鉴定和确认，如SDS-PAGE凝胶电泳、Western blot等。
确保表达的目标蛋白符合预期。
9. 储存和应用：将纯化好的目标蛋白进行适当的保存和储存，确保其稳定性和活性。
根据需要，可以进行后续的功能研究、结构分析、制备抗体等应用。
需要注意的是，原核蛋白表达流程可以根据实验目的和具体要求进行调整和优化。
不同的表达系统和载体可能需要适应性调整。
此外，对特定蛋白的表达可能需要进一步优化培养条件和蛋白纯化步骤。
EMSA操作方法(原核表达纯化蛋白)
三、凝胶滞留试验(EMSA)凝胶迁移滞留试验(electrophoretic mobility shift assays,EMSA)是研究核酸与蛋白质相互作用简单、快速、敏感的方法,目前已经成为转录因子研究的经典方法,并且用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。
其基本原理是蛋白质可以与末端标记的核酸探针结合,电泳时这种复合物比无蛋白结合的自由探针在凝胶中泳动的速度慢,即表现为相对滞后。
(一)转录因子-标签融合蛋白和标签蛋白的原核表达纯化以GST标签为例。
裂解液:25mM pH7.8Tris-HCl、100mM NaCl、2 mM NaEDTA、1mM DTT和21×Complete Protease InhibitorCocktail。
洗脱液:50 mMpH7.8Tris-HCl、200mM NaCl、1mM DTT、0.02%(v/v)Triton X-100和10 mM还原性谷胱甘肽。
EDTA、1mM DTT和1×Complete 透析液:25mM pH8.0 Tris-HCl、1mM Na2Protease InhibitorCocktail。
1将转化了pGEX-4T-2载体或者pGEX-4T-2-目的基因重组载体的BL21大肠杆菌在5 mL含100 μg mL-1氨苄青霉素的LB培养液中37℃、200 rpm震荡培养12 h。
2 取1 mL菌液加入100 mL 含100 μg mL-1氨苄青霉素的LB培养液中,37℃、200 rpm震荡培养至OD600为0.5左右。
3 加入IPTG至终浓度为0.5 mM,28℃、200 rpm培养6 h。
4 冰上放置10 min,4℃、3000×g离心15 min,收集菌体并称重。
5 每克菌体加入3 mL裂解液,重悬菌体,加入溶菌酶至终浓度为0.5 mgmL-1,在冰上温和地搅动菌液30 min。
6 超声波破碎30 s(破碎10 s停10 s)。
人脂联素基因的原核表达_纯化及活性检测
ＴｉａｎｊｉｎＭｅｄＪ，Ｓｅｐ２００７，Ｖｏｌ３５Ｎｏ９人脂联素（ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ）基因全长１７ｋｂ，位于染色体３ｑ２７，包含３个外显子和２个内含子。
该基因编码的脂联素蛋白在血浆中分子质量为２８ｋｕ。
脂联素在血循环中含量较高，其血浆浓度约占总血浆蛋白的０．０１％［１］。
目前，脂联素在调节血糖稳态、抗动脉粥样硬化及抗炎等方面的作用已有较为肯定的认识［２］。
脂联素在治疗领域的尝试也已开始，为了能够更好地了解脂联素的结构及作用机制，本研究利用Ｇａｔｅｗａｙ表达系统快速构建了人脂联素原核表达载体，表达并纯化了重组脂联素蛋白。
１材料与方法１．１材料大肠杆菌ＤＨ５α及ＢＬ２１（ＤＥ３）均为本实验室保存，质粒ｐＭＤ１８－Ｔ，ｒＴａｑＤＮＡ聚合酶，ＤＮＡ凝胶回收试剂盒为大连宝生物公司产品。
质粒ｐＤＯＮＲ２０１，ｐＥＴ－ＤＥＳＴ４２以及Ｇａｔｅｗａｙ表达体系均为Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司产品（澳大利亚新南威尔士大学齐建成教授馈赠）。
Ｍ－ＭＬＶ逆转录酶为ｐｒｏｍｅｇａ产品。
兔抗人脂联素多克隆抗体购自Ｂｉｏｖｅｎｄｏｒ公司；辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）标记的羊抗兔ＩｇＧ为北京中杉公司产品。
蛋白纯化试剂盒以及１６４０培养基为Ｎｏｖｏｇｅｎ公司产品。
蛋白复性用ＮＤＳＢ２０１由美国Ｓａｎｔａｃｒｕｚ公司ＴｏｍｍｉｅＬｅｅＳｔａｒｌｉｎｇ先生馈赠。
异丙基硫代－β－Ｄ－半乳糖苷（ＩＰＴＧ），二硫苏糖醇（ＤＴＴ）等均为进口或国产分析纯试剂。
１．２方法１．２．１人脂肪组织总ＲＮＡ的提取和脂联素基因的克隆新鲜皮下脂肪组织标本取自一行子宫瘤切除术且无代谢性疾病者，提取总ＲＮＡ。
将１μｇ总ＲＮＡ，７２℃变性２ｍｉｎ后迅速冰浴降温，加入１５μＬ逆转录酶混合液（２ＵＲｎａｓｅ抑制剂，摘要目的：在大肠杆菌中表达具有活性的重组人脂联素蛋白。
方法：利用ＰＣＲ技术扩增人脂联素基因完全编码序列，选用Ｇａｔｅｗａｙ原核表达体系，经过ＢＰ反应、ＬＲ反应两步反应，将ＰＣＲ产物克隆入ｐＥＴ－ＤＥＳＴ４２质粒，构建融合表达载体ｐＥＴ－ＤＥＳＴ４２／ａｔｔＢ－ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ，转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３），以异丙基硫代－β－Ｄ－半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导表达脂联素融合蛋白，经镍柱亲和层析纯化，ＮＤＳＢ２０１高效复性后，使重组蛋白作用于体外培养的肝细胞，ＲＴ－ＰＣＲ法检测重组脂联素对肝细胞葡萄糖－６－磷酸酶转录水平的影响。
蛋白质的高效表达和纯化技术
蛋白质的高效表达和纯化技术蛋白质是细胞中最为基本的分子，不仅构成细胞的基本结构，也参与到细胞的代谢、信号转导等生命活动中。
因此，蛋白质的高效表达和纯化技术是生命科学研究的重要基础。
蛋白质的表达技术主要包括原核和真核表达系统。
原核表达系统包括大肠杆菌和酵母表达系统，这两种表达系统都具有高效的蛋白质表达能力，并且易于操作和大规模生产。
在酵母表达系统中，通常会将目的蛋白质基因插入到酵母表达载体中，然后通过转化酵母细胞实现表达。
大肠杆菌表达系统则是将目的蛋白质基因插入到大肠杆菌表达载体中，然后通过转化大肠杆菌细胞进行表达。
相比于酵母表达系统，大肠杆菌表达系统具有更高的表达速率，但表达的蛋白质常常是未折叠的形态，需要进一步的纯化和折叠过程。
真核表达系统则利用真核细胞本身的细胞器完成蛋白质的表达和折叠，这类表达系统可以用于表达大多数复杂的蛋白质。
例如，哺乳动物细胞表达系统（如CHO细胞和HEK293细胞）是利用哺乳动物细胞自身的蛋白合成机制进行表达的，这种表达系统通常会得到高质量的蛋白质，但生产成本相对较高。
对于高效的蛋白质表达来说，关键是基因的优化和载体的选择。
在基因的优化方面，通常会进行基因的序列优化、信号肽的选取、启动子的选择等操作，以提高蛋白质的表达量和纯度。
而载体的选择则需要根据具体的表达需求进行选择，例如对于大肠杆菌表达系统来说，常用的载体有pET系列载体和pBAD系列载体；对于酵母表达系统来说，常用的载体有pYES2和pGAPZ系列载体；对于哺乳动物细胞表达系统来说，常用的载体有pCDNA3.1和pEF系列载体。
在蛋白质的纯化方面，常用的方法有离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤等。
离子交换层析是利用离子交换树脂对带有带电的蛋白质进行分离，在这个过程中，可以通过改变洗脱缓冲液的pH或离子浓度来调节分离效果。
亲和层析则是通过利用蛋白质与其特异性配体之间的亲和性实现分离，例如亲和层析树脂中的金属离子会与带有多个组氨酸残基的蛋白质结合形成配位键，从而实现分离。
原核表达及检测
原核表达及检测摘要：本实验采用IPTG诱导GFP在大肠杆菌中的表达，表明随着时间的推移GFP的表达量越来越多。
随后用SDS-PAGE检测蛋白纯化情况关键词：原核表达SDS-PAGE凝胶电泳广义的原核表达，是指发生在原核生物内的基因表达。
狭义的原核表达，常出现于生物工程中。
是指通过基因克隆技术，将外源目的基因，通过构建表达载体并导入表达菌株的方法，使其在特定原核生物或细胞内表达。
一个完整的表达系统通常包括配套的表达载体和表达菌株。
如果是特殊的诱导表达还包括诱导剂，如果是融合表达还包括纯化系统或者Tag检测等等。
因为只有融合体蛋白才具有生物活性，所以还要进行融合体/包涵体检测。
选择表达系统通常要根据实验目的来考虑，比如表达量高低，目标蛋白的活性，表达产物的纯化方法等等。
绿色荧光蛋白( green fl uorescent protei n, GFP)是238个氨基酸组成的单体蛋白, 其分子量为27kDa 。
1974年由Morie等从海洋生物水母中分离出来[ 1], 并且Prasher等在1992年从水母Aequoreavictoria中成功克隆出了GFP的cDNA[ 2 ]。
GFP作为一种新的报告基因,与以往lacZ、CAT等报告基因相比, 有很多无可比拟的优越性: GFP不具有种属依赖性, 在多种原核和真核生物细胞中都表达;荧光强度高, 稳定性高; 不需要反应底物与其他辅助因子,受蓝光激发产生绿色荧光, 尤其适用于体内的即时检测; 另外GFP分子量小,易于融合, 适用于多种转化方式,对受体无毒害,安全可靠; 并且通过替换一些特殊氨基酸,可以使之产生不同颜色的光,从而适应不同的研究需要。
SDS-PAGE的原理：组成蛋白质的氨基酸在一定pH的溶液中会发生解离而带电，带电的性质和带电量的多少取决于蛋白质的性质及溶液的pH值和离子强度。
聚丙烯酰胺凝胶在催化剂过硫酸铵（简称Ap）和加速剂N,N,N’N’-四甲基乙二胺（简称TEMED）的作用下，聚合形成三维的网状结构。
利用原核和真核系统在重组蛋白质表达中的比较
利用原核和真核系统在重组蛋白质表达中的比较当今生物科学领域中，蛋白质表达技术的发展一直备受关注。
利用原核和真核系统来重组蛋白质，是常见的两种方法。
这两种系统在蛋白质表达中有着各自的优势和适用范围。
一、原核系统的蛋白质表达原核系统主要指大肠杆菌（Escherichia coli，简称E.coli）等细菌，并且是最常用的蛋白质表达系统之一。
原核细胞具有复制速度快、易于培养、表达量高等特点，使其成为研究人员的首选。
在原核系统中，通常使用表达载体质粒将目标基因插入到细菌细胞中，并利用细菌自身的转录、翻译系统来实现蛋白质的合成。
在表达载体上，一般包含启动子、转录终止子、选择性标记等功能元件，以控制目标基因的表达和纯化。
原核系统的蛋白质表达具有高效、简便、经济等优势。
然而，由于原核细胞的风险素材含量高，存在内源性的蛋白质翻译后修饰机制有限等局限，某些复杂蛋白质的表达可能会受到限制。
二、真核系统的蛋白质表达真核系统主要指哺乳动物细胞（如CHO细胞）、昆虫细胞（如Sf9细胞）等，相对于原核系统，真核系统具有更接近生物体内蛋白质表达的环境，更能实现复杂蛋白质的表达。
在真核系统中，常用的蛋白质表达包括稳定转染和瞬时转染两种方式。
稳定转染是将目标基因整合到宿主细胞的基因组中，从而实现长期稳定的表达。
而瞬时转染则是将目标基因引入宿主细胞的质粒中，通过短时间高表达来获得大量蛋白质。
真核系统的蛋白质表达能够实现更多的翻译后修饰，如糖基化、磷酸化、乙酰化等。
这些修饰对于某些蛋白质功能的发挥至关重要。
此外，真核细胞中包含更多复杂的蛋白翻译机制和分子伴侣蛋白，有利于蛋白正确折叠和纯化。
然而，真核系统的蛋白质表达过程更为复杂，所需时间和成本也相对较高。
此外，真核细胞具有更严格的质控机制和蛋白降解系统，蛋白质的表达稳定性较差。
三、原核与真核系统的比较原核和真核系统的选择应根据具体的研究目的和需求。
如果目标是表达小分子量、水溶性和结构简单的蛋白质，原核系统是较好的选择。
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操作步骤
• 通过PCR或RT-PCR获得目的基因 • 构建重组表达质粒 • 获得含重组表达质粒的表达菌种 • 诱导表达
诱导表达
挑取含重组质粒的菌体单克隆至5ml含相应抗生素的LB液 体培养基中37℃振荡过夜培养。（同时以空载体作为对照 ） 按1∶100比例稀释过夜菌，一般将1ml菌液接入到100ml
防止二价Ni被还原。
不能含离子型的去垢剂，比如SDS，防止Ni流失。 建议在破碎细胞的时加入蛋白酶抑制剂，如0.11mM的PMSF，防止目的蛋白被降解。
缓冲液里可以加入甘油，防止蛋白之间由于疏水
相互作用而发生聚集沉淀，甘油浓度最高可达 50%（v/v）。 缓冲液里NaCl的浓度应在300mM到2M之间。 可加入非离子型去垢剂，如Triton，Tween等，最 高2%，可以减少背景蛋白污染和去除核酸污染。
LB液体培养基中， 37℃振荡培养2-3h。
取部分液体作为未诱导的对照组，余下的加入诱导剂 IPTG至终浓度0.8mM作为实验组，37℃继续振荡培 养3h，4h，5h，6h 。
不同时间点分别取1ml菌体，12000rpm离心1min 或8000rpm离心6min收获菌体沉淀，用40ul灭菌水 重悬沉淀，加入5×蛋白上样缓冲液10ul混匀， 沸水煮5min。 剩余的样品（约95ml）然后12000rpm离心1min，用 灭菌水重悬菌体，用低温超高压细胞破碎仪或超声 破碎仪破碎重悬的菌体，4℃ 12000rpm离心10min ， 上清倒入另一管中，沉淀用10ml的灭菌水重悬，然后 分别取40ul，加入5×蛋白上样缓冲液10ul混匀， 沸水煮5min，做SDS-PAGE等分析。
Tips
与超声波破碎仪相比，低温超高压连续流细胞 破碎仪的优点有： 保持细胞活性（4-6℃的环境） 省时
不同菌体的破碎最适压力是不同的。 例如：一般大肠杆菌的破碎压力为1000mpa， 压力过大可能会对蛋白的活性有影响。
选择表达宿主之前，要先对靶基因中的密
码子进行分析。
如果有细菌不常用的密码子，需要考虑更换 表达菌株。例如:不能使用BL21(DE3)进行表达， 可以选择Rosetta系列菌株，如Rosetta 2。这种携 带pRARE2质粒的BL21衍生菌，补充了大肠杆菌 缺乏的七种（AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA 及CGG）稀有密码子对应的 tRNA，所以这类菌 株能够明显改善大肠杆菌中由于稀有密码子造成 的表达限制。
记录测定结果。
用灭菌水清洗侦测台5-6次，退出系统，关闭计算机。
存备用。
Tips
透析第一天更换TE buffer次数稍多一些，换5次 左右，后两天的次数可减少，早中晚各一次。 使用前沸水煮5min即可，冷却后装样，加样时要 带手套，防止手上油脂堵塞透析袋的孔，影响透 析效果。用时要检查是否会有液体的漏出，使用 后的透析袋应浸泡在20%的酒精中。 若蛋白浓度太高，在透析的过程中会有蛋白的析 出，建议在加入透析袋之前做等量体积的稀释。 透析之后的蛋白分装到EP管中，既避免浪费，又 可避免蛋白因反复冻融而影响自身的活性。
• 加入1 mL GST Elution Buffer，轻摇10 min。 • 2000 rpm离心5 min，收集上清。 • 重复上述两步骤至少两次。
• SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度，微量紫外分光光
度计检测蛋白浓度。 • 将蛋白分装置于-80℃保存。
Tips
各种缓冲液中不能有强螯合剂，如EDTA，EGTA等。 各种缓冲液里不能有高浓度的强还原剂，如DTT，
在进行SDS可能是： • 由于静电荷的原因相差10kDa左右 • 由于稀有密码子的问题也会造成表达产物 的截短（特殊情况）
蛋白质的提取与纯化
实验原理
亲和层析就是通过将
具有亲和力的两个分子中一 个固定在不溶性基质上，利 用分子间亲和力的特异性和 可逆性，对另一个分子进行 分离纯化。被固定在基质上 的分子称为配体，配体和基 质是共价结合的，构成亲和 层析的固定相，称为亲和吸 附剂。
• 4℃ 12000rpm离心20min，取上清 。 • 加20% PEG4000 至终浓度为0.2％，50mM （0.03g/mL）的氧化型谷胱甘肽至终浓度为１mM，
100mM（0.03g/mL）的还原型谷胱甘肽至终浓度为
2mM，静置2小时。 • 以1×TE（pH8.0)透析72小时，取出分装后-80℃保
蛋白浓度测定
特点
检测只需1微升的样本，适用于极 微量样本的检测。
直接使用加样器将待检测样本加在
检测的表面上，无需使用比色皿和 毛细管。 不浪费样本，节省消耗品费用。 样本无需进行稀释，即可进行快 速、简便的检测，检测范围宽。
操作步骤
在主画面点选“Protein A280”，计算机与仪器自动完成 联机。 先用灭菌水清洗侦测台5-6次，最后一次点“OK”确定。 依照Pro所溶于之液体准备该溶液取出2ul点在侦测台 上，放下上臂后再按“Blank”。 将样品混匀，取出2ul点在侦测台上，放下上臂后再按 “Measure”。
GST标签蛋白的纯化
• 诱导200mL菌体，4℃ 12000rpm 离心1min集菌，然后用 PBS洗涤诱导后的菌体2-3次，Buffer A（一般用1/10体 积）重悬菌体，超声波破碎至清亮 ，12000rpm离心 20min取上清，在上清中加入适量经处理过的50%的 Glutathione Sepharose 4B，室温摇床轻轻晃动作用1h，使 蛋白充分吸附。 • 2000 rpm离心5min，弃上清。 • 加入至少10倍体积PBS，轻摇至Glutathione Sepharose 4B 悬浮于溶液中，2000rpm离心5min弃上清。 • 重复上步两次。
原核表达
实验原理
大肠杆菌是重要的原核表达体系,在重组 基因转化入大肠杆菌菌株以后，通过温度 的控制，诱导其在宿主菌内表达目的蛋白 质，然后将表达样品进行SDS-PAGE以检测 表达的蛋白质。 实验室常采用IPTG诱导外源基因表达，不 同的表达质粒表达方法并不完全相同，由 于启动子不同，诱导表达要根据具体情况 而定。
不溶性包涵体的提取
• 诱导200mL菌体，4℃ 12000rpm离心1min集菌，PBS洗涤 菌体2-3次，然后用Buffer A（一般用1/10体积）重悬菌体， 超声破碎至清亮。 • 4℃ 12000rpm离心20min，弃上清。
• 用PBS洗涤沉淀2-3次。
• 往沉淀中加19.7ml Buffer A以及19.7ul的DTT(终浓度为 0.5mM/L)及0.3ml 20%的SKL贮存液，剧烈搅动，使其缓 慢溶解，4℃静置过夜。