重组蛋白质表达与纯化
重组蛋白质表达、复性与纯化.ppt
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有前景的特殊用途的tag
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100多AA的结构域, 在大肠杆菌中被识别为生 物素化的位点. Promega的PinPointTM Xa-1; Invitrogen的pET104-DEST. • 未命名 DVEAWLGAR, 被用来和streptoavidin结合 (个人通讯)
在大肠杆菌中表达 重组蛋白质
• 如果目的蛋白质有二硫键并需要 正确的立体结构, 尽可能进行可 溶性表达;
• 如果目的蛋白质没有二硫键或只 用来制备抗血清, 采用包含体表达 比较好;
• 如果目的多肽的分子量小于 10 kDa, 一定要进行融合表达
大肠杆菌表达载体分类
按蛋白质类型分
• 单纯表达: pJLA系列, 用NcoI/NdeI导入AUG的载体 • 融合表达: 融合各种tag, GST, CBD, MAL, GFP, etc • 分泌表达: pel/ompT分泌肽
• 质粒不稳定，尚无商品化的表达 载体
其他
•乳酸菌 (Lactic acid bacteria) •沙门氏菌 (Salmonella typhimurium) •苏云金杆菌
(Bacillus thuringiensis)
真核细胞表达体系
酵母细胞 昆虫细胞 植物细胞/组织 哺乳动物细胞/组织
酵母细胞
两种主要的分子伴侣
Type I: chaperones which are functionally responsible for the correct folding, assembly and transport of newly synthesized peptide– HSP family,GroELS,ect.
重组蛋白质的表达与纯化
重组蛋白质的表达与纯化重组蛋白质是指通过基因工程技术将目标蛋白的基因导入到宿主细胞中，使其在宿主中表达并纯化得到的蛋白质。
这项技术应用广泛，被广泛用于生物制药、医学研究以及工业生产等领域。
下面将详细介绍重组蛋白质的表达与纯化过程。
一、重组蛋白质表达过程1. 选择表达宿主重组蛋白质表达宿主的选择十分重要。
常用的表达宿主包括大肠杆菌（E. coli）、酵母（yeast）、哺乳动物细胞等。
不同的表达宿主具有不同的特点和适用范围。
例如，大肠杆菌是最常用的表达宿主之一，具有高表达水平、易操作、成本低等特点。
2.构建表达载体表达载体是将目标基因导入宿主细胞的载体。
常用的表达载体有质粒、病毒载体等。
质粒是最常用的表达载体，它可轻松被细菌胞内扩增，并在细胞内产生大量目标蛋白。
3.转染和表达将构建好的表达载体导入到宿主细胞中，实现转染。
转染有多种方法，如电穿孔法、化学法、微粒子轰击法等。
转染后，宿主细胞会开始表达目标基因，合成目标蛋白。
4.优化表达条件为了提高重组蛋白质的产量和纯度，需要对表达条件进行优化。
常见的优化方法包括调节培养基成分、改变培养条件、优化诱导剂浓度等。
二、重组蛋白质的纯化过程1.细胞破碎与分离表达宿主中产生的重组蛋白质往往与其他细胞组分混合在一起，需要通过细胞破碎与分离来获取目标蛋白。
细胞破碎方法包括机械法、超声法、高压法等。
分离方法包括离心、电泳、柱层析等。
2.柱层析柱层析是常用的蛋白质纯化方法之一，它基于蛋白质在柱中不同吸附剂上的亲和力差异来实现分离纯化。
常用的柱层析方法有离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤层析等。
3.其他纯化方法除了柱层析外，还有许多其他的纯化方法可供选择。
例如，凝胶电泳、过滤、冷冻干燥等。
这些方法通常用于进一步提纯和去除杂质，以获得纯度更高的重组蛋白质。
三、重组蛋白质应用与挑战重组蛋白质的应用广泛，涉及到生物制药、医学研究、农业等领域。
例如，通过重组蛋白质技术，可以生产用于治疗疾病的药物，如人胰岛素、白介素等。
重组蛋白实验报告
一、实验目的本实验旨在通过基因工程手段，构建表达重组蛋白的载体，并在宿主细胞中进行表达，随后对表达的重组蛋白进行纯化，以获得高纯度的目标蛋白。
二、实验材料1. 实验试剂：- pET-28a载体- 目的基因片段- restriction enzymes (EcoRI, BamHI)- T4 DNA连接酶- DNA聚合酶- 限制性内切酶缓冲液- DNA分子量标准- 质粒提取试剂盒- 诱导剂 (IPTG)- 细胞培养试剂（DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶等）- 纯化柱（Ni柱）2. 实验仪器：- PCR仪- 紫外分光光度计- 凝胶电泳仪- Western Blot系统- 离心机- 流式细胞仪三、实验方法1. 基因克隆：- 使用PCR技术扩增目的基因片段，并使用EcoRI和BamHI进行酶切。
- 将酶切后的目的基因片段与pET-28a载体连接，并转化大肠杆菌感受态细胞。
- 对转化后的细胞进行PCR检测，筛选出含有目的基因的阳性克隆。
2. 重组蛋白表达：- 将阳性克隆接种于含抗生素的培养基中，培养至对数生长期。
- 加入IPTG诱导剂，调节IPTG浓度至0.1 mM，诱导表达重组蛋白。
- 收集细胞裂解物，进行SDS-PAGE电泳分析重组蛋白的表达情况。
3. 重组蛋白纯化：- 使用Ni柱对细胞裂解物进行亲和纯化。
- 通过梯度洗脱，收集含有重组蛋白的洗脱液。
- 使用Western Blot检测纯化蛋白的纯度。
4. 重组蛋白活性检测：- 使用流式细胞仪检测重组蛋白的活性，以验证其功能。
四、实验结果1. 基因克隆：- 成功构建了含有目的基因的重组质粒，经PCR和酶切验证无误。
2. 重组蛋白表达：- 在IPTG诱导下，成功表达出重组蛋白，SDS-PAGE电泳结果显示目的蛋白条带清晰。
3. 重组蛋白纯化：- 使用Ni柱纯化后，重组蛋白的纯度达到90%以上。
4. 重组蛋白活性检测：- 通过流式细胞仪检测，重组蛋白具有良好的活性。
生物制药中的蛋白质表达与纯化技术
生物制药中的蛋白质表达与纯化技术生物制药是指利用生物技术和生物制备技术生产药品。
蛋白质是重要的生物大分子，在生物制药中，利用蛋白质表达技术制备蛋白质药物已经成为制备生物制药的重要手段之一。
在蛋白质表达和纯化中，重要的问题是选择适合的表达载体和表达宿主细胞，以及优化表达条件，提高表达能力和质量。
此外，表达的蛋白质需要纯化和质量控制等关键步骤，以保证药品的安全有效。
蛋白质表达技术蛋白质表达技术是指利用基因工程技术将目标蛋白质的编码基因导入到表达宿主细胞内，通过转录和翻译等过程表达出目标蛋白质。
根据表达载体的不同，蛋白质表达技术可分为细胞自主表达和外源表达两类。
细胞自主表达是指目标蛋白质能够在宿主细胞自身的代谢和生理过程中产生和积累。
这种表达方式常见于真核细胞，例如酵母细胞、哺乳动物细胞等。
此外，还有一些原核细胞能够自主表达复杂蛋白质，如高等厌氧菌和嗜热菌等。
外源表达是指将目标蛋白质的编码基因插入到宿主细胞的表达载体中，通过改变细胞代谢和生理状态，促进目标蛋白质的表达。
目前，外源表达技术已经被广泛应用于生物制药领域。
外源表达常用的表达宿主细胞包括细菌、真菌、昆虫、植物和哺乳动物等。
在选择表达载体和表达宿主细胞时，需要考虑到许多因素，如表达载体的复制数目、启动子、选择标记、信号序列、表达宿主细胞的生长速度、生理状态、代谢途径等。
蛋白质纯化技术蛋白质纯化是指将从表达宿主细胞中获得的蛋白质经过一系列的分离、纯化和检测等步骤，去除不必要的成分和杂质，提高目标蛋白质的纯度和活性。
在纯化过程中，需要根据目标蛋白质的生化性质和物理性质选择不同的分离和检测手段，例如亲和层析、逆向层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、凝胶电泳等。
亲和层析是利用亲和基团与目标蛋白质相互作用，实现目标蛋白质的纯化。
通常，亲和基团可与目标蛋白质的某种生化或物理性质相互作用，例如其特异抗原性、活性或生物学功能等。
例如，利用亲和层析纯化抗体、酶或膜受体等蛋白质时，通常采用大量的亲和基团，如包括Ni2 +、酵母己糖、自旋素、脂肪酸酰化酶亲和基团等。
重组蛋白质的表达纯化和结构鉴定
重组蛋白质的表达纯化和结构鉴定在生物医学领域中，重组蛋白质凭借其广泛的应用前景成为了研究热点。
然而，要想获得高纯度的重组蛋白质，并对其结构进行准确的鉴定，需要经历一系列复杂而细致的实验步骤。
本文将从表达、纯化和结构鉴定三个方面介绍重组蛋白质的研究过程。
一、表达重组蛋白质的表达是研究重组蛋白质最初的关键步骤之一。
通常采用大肠杆菌（Escherichia coli）作为表达宿主。
首先，需要将目标基因克隆至表达载体中，确保其与启动子、转录因子等相互配合，并携带一定的标签，如His 标签、GST 标签等。
接着，将修饰好的表达载体转化至大肠杆菌中，采用选择性培养基筛选出目标菌株。
最后，将筛选得到的菌株进行大规模培养，促使目标基因在细胞内表达。
二、纯化获得表达目标蛋白的菌株后，需要将蛋白从细胞中纯化出来。
首先，采用超声波或高压颠破细胞壁，释放出蛋白质。
接着，通过离心等手段将蛋白质与其他细胞组分分离。
此时，可以利用目标蛋白质特异性的亲和层析柱，如镍柱、葡聚糖柱等，吸附目标蛋白质，并通过逆向洗脱等方法，得到高纯度的目标蛋白质。
三、结构鉴定获得纯度较高的重组蛋白质后，需要对其结构进行进一步的鉴定。
常用的结构鉴定方法包括X射线晶体学、核磁共振（NMR）、电子显微镜等。
X射线晶体学是目前应用最广泛的方法，通过将蛋白质结晶并进行X射线衍射实验，得到蛋白质的高分辨率结构。
NMR则通过测量蛋白质中核自旋的相对位置和相互作用关系，获取蛋白质的三维结构信息。
电子显微镜是一种能够获得蛋白质高分辨率结构的技术，主要应用于研究大分子复合物和纤维形态的蛋白质。
除了上述常用技术外，近年来还涌现出一些新的结构鉴定方法，如质谱联用技术、光学显微镜成像、负染电镜等。
这些方法的出现，为蛋白质结构鉴定提供了更多的选择和便利。
由于篇幅所限，本文仅对重组蛋白质的表达、纯化和结构鉴定进行了简要介绍。
事实上，研究重组蛋白质的过程还包括目标基因的设计与合成、蛋白质的功能分析等环节。
重组蛋白质的表达与纯化技术
重组蛋白质的表达与纯化技术蛋白质是生命体活动的重要组成部分，对于生命体的生长、繁殖和免疫功能起着至关重要的作用。
而重组蛋白质则是利用基因工程技术，将人工合成的外源基因导入到特定的宿主细胞中，通过细胞表达和纯化技术得到的转录翻译产物。
这种技术不仅可以生产天然蛋白质，还可以生产人工合成的新型蛋白质，对于疾病的治疗和新药的研发有着重要的意义。
一、蛋白质表达技术蛋白质表达是获得大量重组蛋白质的重要方法。
选择适当的宿主细胞和表达载体是获得高水平表达的关键。
常用的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。
1.大肠杆菌表达系统大肠杆菌表达系统具有生长快、表达量高等优点，广泛应用于重组蛋白质的表达和纯化。
其表达载体主要有pET和pBAD两种，pET系统一般用于产生可以形成包涵体的重组蛋白，pBAD系统用于在分泌表达中产生滞留蛋白。
2.昆虫细胞表达系统昆虫细胞表达系统包括SF9、Sf21、HighFive等细胞系，常用的表达载体为pIB/V5-His、pFastBac等。
昆虫细胞表达系统通常用于表达大分子蛋白质，如糖蛋白、膜蛋白等。
3.哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统是目前表达规模最大、表达产物最接近人体蛋白质的一种表达系统。
其表达载体主要有pCDNA3.1、pCI 等，常用于表达与人体有关的蛋白质，如抗体、生长因子等。
二、蛋白质纯化技术蛋白纯化是重组蛋白质生产的重要环节，其目的是得到高质量的、纯度较高的蛋白质样品。
常见的纯化方法包括亲和层析法、离子交换层析法、凝胶过滤层析法、逆流式层析法等。
1.亲和层析法亲和层析法是指因与载体中固定的亲和剂相互结合而纯化目标蛋白质的一种方法。
亲和剂通常是与目标蛋白质有特异性结合作用的化合物，如亲和标签、酶底物、抗体等。
常见的亲和层析方法有亲和柱层析、亲和膜层析等。
2.离子交换层析法离子交换层析法是根据蛋白质带有正或负电荷的差异性进行分离的一种方法。
离子交换层析的柱填充物常为离子交换树脂，其一般分为阴离子交换树脂和阳离子交换树脂两种。
重组蛋白药物一般生产工艺与质量控制要点
重组蛋白药物一般生产工艺与质量控制要点
重组蛋白药物是通过基因重组技术在外源宿主细胞中表达的蛋白质药物。
其生产工艺和质量控制要点包括以下几个方面：
1.细胞培养和表达：选择合适的宿主细胞（如CHO细胞、
细菌、酵母等），通过转染或转化技术将目标蛋白的基因
导入细胞中，使细胞能够表达目标蛋白。
2.发酵过程优化：对细胞培养的条件进行优化，包括培养基
成分、温度、pH值、搅拌速率等，以提高目标蛋白的产
量和纯度。
3.蛋白纯化：采用一系列的离心、过滤、层析和纯化技术，
如亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等，将目标蛋
白从细胞培养物中分离和纯化出来。
4.构建和验证二级结构：通过光谱技术，如红外光谱、紫外
吸收等方法，验证目标蛋白的二级结构，确保其与自然蛋
白相似。
5.结构和活性的确认：利用质谱等分析手段对目标蛋白进行
结构分析，确保其三维结构的正确性。
同时使用生物学活
性和特定的生物学试验来确认目标蛋白的活性。
6.病原体和杂质的清除：利用一系列的技术，如超滤、凝胶
过滤、酸碱处理等，清除生产过程中可能存在的病原体、
杂质和过剩的细胞基质。
7.生产工艺的可重复性和稳定性：建立稳定可行的生产工艺，
并对每一批次的产品进行严格的质量控制，以确保产品的一致性和稳定性。
8.特殊注意事项：由于蛋白质药物的复杂性，还需要关注蛋
白聚集、丧失活性、潜在的免疫原性等问题，并通过相关实验和分析来评估和控制这些问题。
以上是重组蛋白药物生产工艺和质量控制的一般要点，实际的生产过程和质量控制要求会根据具体的药物和工艺进行调整和优化。
蛋白质的表达纯化
400ul
750ul
1800ul
50ul
10ul
灌完浓缩胶，插入梳子。等到浓缩胶自然凝聚后，将装置放入电泳槽内,加入电泳缓冲液,小心地拔出梳子，如果拔出梳子后加样孔之间的间隔发生扭曲，可以用注射器针头小心地加以整理。
01
加样：取大肠杆菌和BSA蛋白样品加样，每个加样孔加样不宜过多，一般每孔加样10L。
1．装配制胶用的玻璃板（由助教演示）。 2．制分离胶：按所需的浓度配制12.5％分离胶。 灌完分离胶后在胶面上小心加水封（注意不要冲坏胶面），等胶自然凝聚后（这时候在胶面与水封之间可以看见清晰的界限）
5ml
3ml
4ml
120ul
20ul
30%Arc-Bis
Tris-HCl pH 6.7
H2O
10%AP
6
稀释5×SDS/电泳缓冲液至1×浓度灌入电泳槽，需800毫升。
7
注意事项
将红色玻璃夹子底座朝下、卡口打开呈直角状，放入厚薄两片玻璃，薄玻璃朝向自己。注意厚玻璃箭头向上，旁边两条小玻璃条与薄玻璃接触，使之形成一个间隙。 在平整的桌面上放下玻璃与夹子，使玻璃和夹子的底面完全对齐，向外扳动塑料卡口，关紧夹子。
氯霉素酰基转移酶重组蛋白的分离，纯化
重组蛋白的变性裂解：在冰浴中冻融50ml菌体沉淀，加入5mL上样缓冲液GLB, 用吸管抽吸重悬, 4 ℃ 12000rpm 离心 30 min, 将上清（总蛋白细胞裂解液）吸至一个干净的容器中，并弃沉淀。
NTA层析柱的准备：在层析柱中加入1mL NTA介质，并分别用8mL 去离子水，8mL上样缓冲液GLB洗涤。(调速0.5ml/3分钟 ) 。
氨苄青霉素：100mg/mL
Washing Buffer（UWB）： 100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8 M Urea, pH6.3
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第五章重组蛋白质的表达、复性与纯化为什么要重组基因表达？1.蛋白质功能研究2.生物制药和疫苗生产3.疾病的基因治疗4.食品、化工用酶制剂5.抗虫、抗逆植物改良6.细胞代谢产物的富集•基因表达体系及优劣势•大肠杆菌表达体系•蛋白质的复性•工作中经常碰到的问题基因表达体系1.原核体系2.真核体系大肠杆菌(Escherichia coli)•遗传背景清楚，基因工程操作方便，商品化表达载体种类齐全，表达效率高；•基本不分泌，易形成包含体(无正确折叠的立体结构)，无加糖等修饰枯草杆菌(Bacillus subtilis)•分泌蛋白质能力强，一般有天然立体结构；•无加糖修饰功能，培养液中蛋白酶活性高，重组蛋白易受蛋白酶的水解；•质粒不稳定，已有商品化的表达载体（枯草芽孢杆菌，巨大芽孢杆菌）。
其他•乳酸菌(Lactic acid bacteria)•沙门氏菌(Salmonella typhimurium)•苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)真核细胞表达体系酵母细胞昆虫细胞植物细胞/组织哺乳动物细胞/组织酵母细胞•可生产分泌型蛋白；有天然立体结构，有糖基化修饰功能；可进行染色体整合型基因表达;•糖链与哺乳动物加工的不一致，培养上清多糖浓度高;•商品化表达体系：酿酒酵母（Saccharomyce cerevisiae）;毕氏酵母(Pichia pastoris);裂殖酵母（Schizosaccharomyce pombe）蛋白质糖基化的分类1.O-糖基化:糖链通过GalNAc连接在蛋白质的Ser 或Thr等侧链的羟基处2.N-糖基化:糖链连接在Asn-X-Ser或Asn-X-Thr （X是除Pro以外的任何氨基酸）中Asn的氨基侧链处3.GPI-Anchor糖基化:蛋白质通过肽链的C端共价连接的糖基磷脂酸肌醇锚定在膜脂上。
昆虫细胞•可以病毒感染的形式在成虫中生产，也可在体外培养细胞生产蛋白;•适合分泌型和膜蛋白的表达，有加糖修饰；•糖链有所区别，表达量有限；•作为药物宿主细胞未被FDA认可CHO细胞•可进行分泌表达，有天然立体结构，加糖方式与人体蛋白质完全一致；•表达量不够高，培养成本较高植物组织•植物可大面积种植，可以廉价大规模生产；•转基因植物制作费时，表达的组织特异性较难控制；•表达量较难提高，分离纯化不方便动物乳腺组织•分泌生产有天然立体结构和活性的蛋白质至乳汁，产量高，分离纯化方便，特别适合药用蛋白的生产；•转基因动物制作花费巨大，实验周期长鸟类输卵管组织•分泌生产有天然立体结构的蛋白质到蛋清，产量高，容易贮存和运输，分离纯化方便；•实验成本低，饲养费用低；•加糖方式可能与人有所不同体系选择研究基因功能:大肠杆菌,裂殖酵母,昆虫细胞,CHO细胞多肽药物生产:大肠杆菌,毕氏酵母,CHO细胞,乳腺组织疫苗:大肠杆菌,酵母,大多数沿用细胞培养产物进行灭毒单抗生产:杂交瘤细胞工业酶生产:各种微生物有可能以后能做到的事•在大肠杆菌中直接生产有活性的胰岛素•在大肠杆菌中生产人凝血IX因子•在大肠杆菌生产Calcitonin类C端酰胺化短肽•在大肠杆菌中进行蛋白质的糖基化修饰•在酵母中进行与哺乳动物细胞一致的糖基化•在鸡输卵管中进行与哺乳动物细胞一致的糖基化•提高乳腺分泌表达的Factor IX类因子的活性•在植物中得到与哺乳动物细胞一致的糖基化在大肠杆菌中表达重组蛋白质•如果目的蛋白质有二硫键并需要正确的立体结构, 尽可能进行可溶性表达;•如果目的蛋白质没有二硫键或只用来制备抗血清, 采用包含体表达比较好;•如果目的多肽的分子量小于10 kDa, 一定要进行融合表达大肠杆菌表达载体分类按蛋白质类型分•单纯表达: pJLA系列, 用NcoI/NdeI导入AUG的载体•融合表达: 融合各种tag, GST, CBD, MAL, GFP, etc •分泌表达: pel/ompT分泌肽按启动子分•lac及衍生的tac , trc, pac, rac等启动子IPTG诱导•lamda phage P L和P R启动子热诱导•T7 启动子IPTG诱导•T5 启动子IPTG诱导•ara启动子阿拉伯糖诱导常用表达载体•pJLA50X 系列; pcDNAII; etc •pET 系列(T7 promoter, Novagen 公司)•pQE系列(T5 promoter, Qiagen公司)•pMAL系列(周质表达, BioLabs公司)•pGEX系列(GST融合表达, Pharmacia公司)•pBAD系列(Arabinose诱导型)•pTYB系列(CBD融合, 可以自我切割, BioLabs)各种融合蛋白表达载体•Protein A•GST（glutathione S-transferase）•CBD (chitin-binding domain, BioLabs;cellulose-binding domain, Novagen)calmodulin-binding domain, Stratagene)•MBP (maltose-binding protein)•GFP (green fluorescence protein)•Thioredoxin **帮助二硫键形成•Dsb (periplasmic enzyme DsbA, DsbC) ** 二硫键的形成与•SUMO (small ubiquitin-related modifier) •KSI (ketosteroid isomerase) 基本上全部沉淀可用亲和层析纯化帮助可溶化帮助分泌到周质让表达产物可溶化•采用MBP融合•采用GST融合•采用CBD融合•采用thioredoxin融合•采用Origami等宿主菌•降低菌体培养的速度温度(15-30℃), 降低转速让蛋白质分泌到间质去•采用CBD融合(pET36/37)•采用Dsb融合(pET39/40)•采用带pelB/ompT引导肽的载体(pET12/20/22)•采用带MBP融合(pMAL载体, Biolabs)•采用带SUMO融合(pET SUMO, Invitrogen)纯化方便: 先用EDTA/蔗糖溶液处理, 然后5 mM MgSO4 洗出•His-tag (6-8 Histidine )•T7-tag (MASMTGGQQMG )•HSV-tag (QPELAPEDPED )•S-tag (KETAAKFERQHMDS )•VSV-G-tag (TTDIEMNRLGK )•HA-tag (YPYDVPDYA )•Flag-tag (DYKDDDDK ) •Myc-tag (EQKLISEEDL )各种用于抗体识别的标记为什么要加tag ?有前景的特殊用途的tag •Biotinylation-tag100多AA的结构域,在大肠杆菌中被识别为生物素化的位点. Promega的PinPoint TM Xa-1; Invitrogen的pET104-DEST.•未命名DVEAWLGAR, 被用来和streptoavidin结合(个人通讯)•未命名一些病毒外壳蛋白的片段, 破坏细胞膜的结构导致容易进入细胞融合蛋白的专一性切割•DTT: intein的↓Cys •溴化氰: Met↓•Thrombin: LVPR↓GS •Factor Xa: IEGR↓•Enterokinase: DDDDK↓•PreScission TM protease:LEVLFQ↓GP •Genenase I TM PGAAHY↓•TEV protease:ENLYFQ↓G特殊的表达用菌株•BL21(DE3)/pLysS : 自身表达T7 RNA polymerase 适用pET系列等带T7启动子的载体•M15/SG13009 : 自身表达T5 RNA polymerase 适用pQE系列等带T5启动子的载体•BL21TrxB(DE3) : thioredoxin reductase 突变•Origami(DE3): thioredoxin reductase/ glutathione reductase 双突变适合带thioredoxin reductase的融合表达载体, 帮助形成更多的二硫键•BR21CodonPlusRIL: 富含AT的真核生物基因的表达•BR21CodonPlusRP: 富含GC的真核生物基因的表达重要的原核表达质粒提供商•Novagen•Stratagene•Invitrogen•BioLabs•Qiagen•Pharmacia•Promega•Clontech•Roche•Gibco/BRLThe protein folding Problem How to get to the bottom of the funnel? And,what is at the bottom?包含体蛋白质的复性方法•透析法: 简单; 但费时, 费缓冲液, 蛋白质量少，浓度不能过高(容易产生沉淀) •快速稀释法:最常用的小规模复性方法; 但比较费时,费缓冲液, 蛋白质的浓度不能高(容易产生沉淀)•超滤透析法: 比较省缓冲液, 处理量大; 但费时, 要控制好蛋白质浓度•凝胶过滤法:快速, 可重复性高, 不会产生沉淀, 操作复杂一点•亲和层析复性法, 水相二相法, etc工作中经常碰到的问题•表达量不够高；•包含体在8M尿素中不能溶解；•重组蛋白在大肠杆菌中表达的分子量偏小；•带His-tag重组蛋白不吸附到Ni-chelating树脂上；•Ni-chelating分离纯化的效果不好；•GST融合蛋白不吸附到glutathione-Sepharose上；•包含体来源的采用透析法或稀释法复性时全部沉淀；•Ni-chelating错用DTT后发生黑色沉淀该怎么办？•贵重的亲和层析树脂经常发生结块该怎么办？•某些表达载体的表达效率在放大培养时无法提高尝试不同表达载体，特别是N端有融合蛋白的载体•是不是忘了加还原剂（DTT 或巯基乙醇）？•是不是在－20℃冻存过？•用4M盐酸胍试试•是不是酸性蛋白质？•是不是蛋白质的合成提前中止了？（富含Arg, Ile, Leu, Pro这几种氨基酸）•可以尝试用BL21 CodonPlus RIL 或RP 作宿主菌(Stratagen)；•使用C端带His-tag的融合表达载体（如pET21, Novagen）以便纯化全长的融合蛋白•His-tag被操作过程混入的重金属离子所饱和，可以通过添加0.5 mM EDTA来去除重金属离子的干扰；•His-tag被包裹在不易和树脂发生结合的位置（比较罕见）;•其他不明原因导致弱结合•样品没有很好细心去除不溶性物质•重复使用前树脂没有洗干净•蛋白质之间存在相互作用•可以提高盐浓度, 改变pH, 添加2-6 M尿素等方法来洗去杂蛋白质是不是在进行复性时用了Redox buffer尝试用Urea gradient /Gel filtration来解决尽快用0.1 N HCl冲洗用0.1 N NaOH / 0.1% SDS洗主要是溶氧量的问题, 可以通过在摇瓶中加入不同量的培养基的方式来确定最佳体积。