重组蛋白纯化概述
重组蛋白[Recombinant Protein]纯化的基本策略
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重组蛋白[Recombinant Protein]纯化的基本策略一、融合表达蛋白的纯化：融合表达蛋白可以在原目标分子之外带有GST肽段或（His）6肽段，从而使得可以分别用Glutathione Sepharose凝胶或Chelating Sepharos e凝胶进行亲和色谱分子，一步可以达到~90%的纯度，经过特异蛋白酶切后，再进行离子交换及高分辨凝胶过滤一般便可以达到所需的纯度（95~99%）。
二、包含体表达蛋白的纯化：在E.coli系统表达重组蛋白，表达量高时，常形成包含体，包含体易于与细胞其他组分分离，但需要注意的是蛋白复性的步骤。
一般采用盐酸胍溶解包含体蛋白后，用稀释的办法进行复性，也可以利用凝胶过滤色谱进行复性（已有多种凝胶可以促进蛋白质的复性的报道）。
以下以rhGM-CSF（重组人粒细胞 -巨噬细胞集落刺激因子）的下游纯化工艺为例：E.coli细胞，超声破碎，离心收集包含体，用7mol/L盐酸胍溶解包含体蛋白，作1：70稀释使蛋白复性，加硫酸铵至一定浓度后，上样于 P henyl-Sepharose 6 FF（high sub）色谱柱，活性组分再上Q-Sepharo se FF进行离子交换，最后上Superdex 75 prep grade凝胶进行凝胶过滤色谱，最终获得了纯度较高的rhGM-CSF，同时，DNA及内毒素去除率均很高。
如下表所示：步骤体积（ml）蛋白（mg）内毒素（EU/ml）DNA（pg/ml）起始（复性样品）4344 490 421 180HIC疏水柱 880 220 243 0.46AIEX阴离子交换 620 88 251 0.14GF凝胶过滤 1045 62 9 0.08三、周质表达的蛋白的纯化：可用渗透压休克方法，使周质释放，然后利用扩张床技术将含有菌体的悬液直接上柱（STREAmlINE系列凝胶），菌体穿过而表达的蛋白上柱。
重组蛋白质的表达与纯化
重组蛋白质的表达与纯化重组蛋白质是指通过基因工程技术将目标蛋白的基因导入到宿主细胞中，使其在宿主中表达并纯化得到的蛋白质。
这项技术应用广泛，被广泛用于生物制药、医学研究以及工业生产等领域。
下面将详细介绍重组蛋白质的表达与纯化过程。
一、重组蛋白质表达过程1. 选择表达宿主重组蛋白质表达宿主的选择十分重要。
常用的表达宿主包括大肠杆菌（E. coli）、酵母（yeast）、哺乳动物细胞等。
不同的表达宿主具有不同的特点和适用范围。
例如，大肠杆菌是最常用的表达宿主之一，具有高表达水平、易操作、成本低等特点。
2.构建表达载体表达载体是将目标基因导入宿主细胞的载体。
常用的表达载体有质粒、病毒载体等。
质粒是最常用的表达载体，它可轻松被细菌胞内扩增，并在细胞内产生大量目标蛋白。
3.转染和表达将构建好的表达载体导入到宿主细胞中，实现转染。
转染有多种方法，如电穿孔法、化学法、微粒子轰击法等。
转染后，宿主细胞会开始表达目标基因，合成目标蛋白。
4.优化表达条件为了提高重组蛋白质的产量和纯度，需要对表达条件进行优化。
常见的优化方法包括调节培养基成分、改变培养条件、优化诱导剂浓度等。
二、重组蛋白质的纯化过程1.细胞破碎与分离表达宿主中产生的重组蛋白质往往与其他细胞组分混合在一起，需要通过细胞破碎与分离来获取目标蛋白。
细胞破碎方法包括机械法、超声法、高压法等。
分离方法包括离心、电泳、柱层析等。
2.柱层析柱层析是常用的蛋白质纯化方法之一，它基于蛋白质在柱中不同吸附剂上的亲和力差异来实现分离纯化。
常用的柱层析方法有离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤层析等。
3.其他纯化方法除了柱层析外，还有许多其他的纯化方法可供选择。
例如，凝胶电泳、过滤、冷冻干燥等。
这些方法通常用于进一步提纯和去除杂质，以获得纯度更高的重组蛋白质。
三、重组蛋白质应用与挑战重组蛋白质的应用广泛，涉及到生物制药、医学研究、农业等领域。
例如，通过重组蛋白质技术，可以生产用于治疗疾病的药物，如人胰岛素、白介素等。
重组蛋白纯化的计算
重组蛋白纯化的计算
一、重组蛋白纯化的计算
1.重组蛋白纯化的筛选
重组蛋白纯化的第一步是要筛选出适合用于纯化的样品，这一步一般从筛选质量优良的重组蛋白源开始。
一般情况下，标准的重组蛋白纯化包括：源蛋白、模板、载体和艾伯特反应器检测、阳性试剂盒检测、浓缩和洗涤等步骤。
筛选出优质的重组蛋白样品，可以保证重组蛋白纯化的效率和质量。
2.重组蛋白纯化的规划
经过筛选，可以得到符合要求的重组蛋白，接下来就是要开始计算重组蛋白纯化的参数，即对重组蛋白纯化技术进行规划，制定纯化步骤的方案。
在该步骤中，首先需要将重组蛋白纯化分为两类：一类是细胞体系，另一类是细胞外系统。
细胞体系可以采用相对简单的精细纯化步骤，可以清除胞浆的污染物，如腺病毒。
细胞外系统一般采用比较复杂的步骤，必须克服微生物污染、抗原结构不清晰和非特异性结合等问题。
3.重组蛋白纯化的操作
重组蛋白纯化的操作分为两个步骤，第一步是灵活选择、安装和操作相关仪器和技术，第二步是重组蛋白纯化的操作步骤。
仪器和技术一般有机械和化学仪器，根据重组蛋白纯化的具体步骤，可以根据具体任务自行选择仪器进行操作。
而重组蛋白纯化的操作步骤，一般涉及到蛋白浓缩、洗涤、活性测定、检测和确定收率等操作。
4.重组蛋白纯化总结
重组蛋白纯化是一个系统的方法，必须按照步骤精确纯化，以保证重组蛋白质量。
重组蛋白的纯化要从源蛋白筛选开始，通过对重组蛋白纯化的参数和操作方法的规划，可以更好地提高重组蛋白的质量和收率，从而达到节省时间和资源的目的。
重组蛋白的概述
重组蛋白的概述1.概述分离纯化组成了基因工程的下游处理（downstream processing）阶段，这一过程又和上游过程紧密相联系，上游过程的诸方面影响到下游的分离纯化，所以在进行目标蛋白质表达纯化时要统一考虑和整体设计，并充分考虑上游因素对下游的影响，如是否带有亲和标签，是否进行分泌表达。
目前应用最广泛的表达系统有三大类，分别是大肠杆菌表达系统、酵母表达系统和CHO细胞表达系统，不同的表达系统和培养方法显著影响下游的处理过程，目标蛋白表达是否形成包涵体，目标蛋白表达的定位（胞内、细胞内膜、周质空间和胞外），蛋白表达的量都依赖于所选择的表达系统。
选择将所表达的蛋白分泌到细胞外或周质空间可以避免破碎细胞的步骤，并且由于蛋白质种类少，目标蛋白容易纯化；而在细胞质内表达蛋白，可能是可溶性表达，可能形成包涵体，可溶性的蛋白往往需要复杂的纯化步骤，而包涵体易于分离，纯度较高，但回收具有生物活性的蛋白却变的相当困难，需要对聚集的蛋白进行变复性，通常活性蛋白的得率比较低，表1列出了不同策略对表达、纯化的影响，对于其中的有些缺点可以通过一定的方法进行克服和避免，如利用DNA重组技术给外源蛋白加上一个亲和纯化的标签，有助于可溶性外源蛋白的选择性纯化，并能保护目标蛋白不被降解（96）。
表 1 重组蛋白不同表达策略的优点和缺点表达策略优点缺点分泌表达至细胞外增强正确二硫键的形成降低蛋白酶对表达蛋白的降解可获得确定的N末端显著减少杂蛋白水平，简化纯化不需要细胞破碎表达水平低多数蛋白不能进行分泌表达表达蛋白需要进行浓缩细胞周质空间表达增强正确二硫键的形成可获得确定的N末端显著减少杂蛋白水平，简化纯化好些蛋白不能分泌进入周质空间没有大规模选择性的释放周质空间蛋白的技术周质蛋白酶可引起重组蛋白酶解胞内包涵体表达包涵体易于分离保护蛋白质不被降解蛋白质不具有活性对宿主细胞生长没有大的影响，通常可获得高的表达水平需要体外的折叠和溶解，得率较低具有不确定N末端胞内可溶性蛋白表达不需要体外溶解和折叠一般具有正确的结构和功能高水平的表达常难以得到需要复杂的纯化可发生蛋白质的酶解具有不确定的N末端在细胞的提取物中，除了目标蛋白外，还含有其它各种性质的蛋白、核酸、多糖等。
重组蛋白实验报告
一、实验目的本实验旨在通过基因工程手段，构建表达重组蛋白的载体，并在宿主细胞中进行表达，随后对表达的重组蛋白进行纯化，以获得高纯度的目标蛋白。
二、实验材料1. 实验试剂：- pET-28a载体- 目的基因片段- restriction enzymes (EcoRI, BamHI)- T4 DNA连接酶- DNA聚合酶- 限制性内切酶缓冲液- DNA分子量标准- 质粒提取试剂盒- 诱导剂 (IPTG)- 细胞培养试剂（DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶等）- 纯化柱（Ni柱）2. 实验仪器：- PCR仪- 紫外分光光度计- 凝胶电泳仪- Western Blot系统- 离心机- 流式细胞仪三、实验方法1. 基因克隆：- 使用PCR技术扩增目的基因片段，并使用EcoRI和BamHI进行酶切。
- 将酶切后的目的基因片段与pET-28a载体连接，并转化大肠杆菌感受态细胞。
- 对转化后的细胞进行PCR检测，筛选出含有目的基因的阳性克隆。
2. 重组蛋白表达：- 将阳性克隆接种于含抗生素的培养基中，培养至对数生长期。
- 加入IPTG诱导剂，调节IPTG浓度至0.1 mM，诱导表达重组蛋白。
- 收集细胞裂解物，进行SDS-PAGE电泳分析重组蛋白的表达情况。
3. 重组蛋白纯化：- 使用Ni柱对细胞裂解物进行亲和纯化。
- 通过梯度洗脱，收集含有重组蛋白的洗脱液。
- 使用Western Blot检测纯化蛋白的纯度。
4. 重组蛋白活性检测：- 使用流式细胞仪检测重组蛋白的活性，以验证其功能。
四、实验结果1. 基因克隆：- 成功构建了含有目的基因的重组质粒，经PCR和酶切验证无误。
2. 重组蛋白表达：- 在IPTG诱导下，成功表达出重组蛋白，SDS-PAGE电泳结果显示目的蛋白条带清晰。
3. 重组蛋白纯化：- 使用Ni柱纯化后，重组蛋白的纯度达到90%以上。
4. 重组蛋白活性检测：- 通过流式细胞仪检测，重组蛋白具有良好的活性。
重组蛋白质的分离纯化 (1)
重组蛋白质的分离纯化摘要：90年代以来基因重组技术得到很大的发展，基因工程产品的分离纯化的成本约占其全部成本的60%～80%，因此重组蛋白的分离纯化技术越来越重要。
本文主要介绍了沉淀、液液萃取、层析等常用分离重组蛋白方法的原理及应用，旨在为开展蛋白质的制备及其应用研究提供理论依据。
关键词：重组蛋白质；分离；纯化；沉淀；液液萃取；层析；包涵体随着基因重组技术的发展，出现了很多基因工程产品，而作为基因工程技术的下游工程中的基因重组蛋白的分离纯化技术越来越显示其重要性。
据有人统计,基因工程产品的分离纯化成本约占到其全部成本的60%～80%[1]。
由此可见产品的分离纯化是获得目的产物的关键一步，也是比较困难的一步，它标志着生物产业的高低。
纯化重组蛋白质和普通蛋白质的不同就在于要选择合适的表达系统，因为表达系统决定了细胞培养过程中产物的性质以及可能产生的杂蛋白，而纯化重组蛋白质的主要目的是去除杂蛋白质，通常对一种重组蛋白质的纯化会采用多个系统[2]。
但是重组蛋白有几种不同的表达形式，如细胞外的分泌表达；细胞内可溶性表达以及包涵体形式的存在，因此对于重组蛋白的纯化要依据其表达形式的不同，采取不同的纯化工艺。
与传统方式相似，重组蛋白的分离纯化也是利用其物理和化学性质的差异，即以分子的大小、形状、溶解度、等电点、亲疏水性以及与其它分子的亲和性等性质建立起来的。
目前主要的纯化方法有浓缩沉淀法，层析和电泳技术。
重组蛋白质在分离纯化的过程中，必须维持一定的浓度和生物活性形式，以及防止被降解。
因此从生物体中有效分离纯化重组蛋白质一直是个难题。
90 年代以来,国内外许多科学工作者在蛋白质分离纯化技术和工艺上进行了大量的研制和开发,将原有的纯化技术水平提高到一个新的高度。
本文将简单介绍一些传统的分离纯化方法，并介绍近10 年来重组蛋白分离纯化中的新进展和一些新出现的技术。
1 沉淀分离技术1.1 盐析法其原理是蛋白质在高浓度盐溶液中，随着盐浓度的逐渐增加，由于蛋白质水化膜被破坏、溶解度下降而从溶液中沉淀出来。
重组胶原蛋白纯化内容介绍
重组胶原蛋白纯化内容介绍
重组胶原蛋白的纯化主要包括以下步骤：
1. 发酵：通过基因工程技术将编码所需胶原蛋白的基因克隆进入适当的宿主细胞中，在培养基中进行发酵。
2. 细胞破碎：发酵完成后，对细胞进行破碎，使细胞壁破裂，释放出细胞内的胶原蛋白。
3. 初步分离：将破碎后的细胞和培养基中的其他成分进行初步分离，常用的方法有离心、过滤等。
4. 纯化：采用各种纯化技术，如凝胶过滤、离子交换、亲和色谱等，将胶原蛋白与其他杂质进行分离。
5. 浓缩：对纯化后的胶原蛋白进行浓缩，使其浓度更高。
6. 干燥：采用真空干燥或冷冻干燥等方法，将胶原蛋白从液态变为固态，便于保存和运输。
在纯化过程中，需要注意保持胶原蛋白的生物活性和天然结构，避免对其造成破坏。
同时，还需要对胶原蛋白进行质量检测，确保其纯度和稳定性符合要求。
重组蛋白质的表达纯化和结构鉴定
重组蛋白质的表达纯化和结构鉴定在生物医学领域中，重组蛋白质凭借其广泛的应用前景成为了研究热点。
然而，要想获得高纯度的重组蛋白质，并对其结构进行准确的鉴定，需要经历一系列复杂而细致的实验步骤。
本文将从表达、纯化和结构鉴定三个方面介绍重组蛋白质的研究过程。
一、表达重组蛋白质的表达是研究重组蛋白质最初的关键步骤之一。
通常采用大肠杆菌（Escherichia coli）作为表达宿主。
首先，需要将目标基因克隆至表达载体中，确保其与启动子、转录因子等相互配合，并携带一定的标签，如His 标签、GST 标签等。
接着，将修饰好的表达载体转化至大肠杆菌中，采用选择性培养基筛选出目标菌株。
最后，将筛选得到的菌株进行大规模培养，促使目标基因在细胞内表达。
二、纯化获得表达目标蛋白的菌株后，需要将蛋白从细胞中纯化出来。
首先，采用超声波或高压颠破细胞壁，释放出蛋白质。
接着，通过离心等手段将蛋白质与其他细胞组分分离。
此时，可以利用目标蛋白质特异性的亲和层析柱，如镍柱、葡聚糖柱等，吸附目标蛋白质，并通过逆向洗脱等方法，得到高纯度的目标蛋白质。
三、结构鉴定获得纯度较高的重组蛋白质后，需要对其结构进行进一步的鉴定。
常用的结构鉴定方法包括X射线晶体学、核磁共振（NMR）、电子显微镜等。
X射线晶体学是目前应用最广泛的方法，通过将蛋白质结晶并进行X射线衍射实验，得到蛋白质的高分辨率结构。
NMR则通过测量蛋白质中核自旋的相对位置和相互作用关系，获取蛋白质的三维结构信息。
电子显微镜是一种能够获得蛋白质高分辨率结构的技术，主要应用于研究大分子复合物和纤维形态的蛋白质。
除了上述常用技术外，近年来还涌现出一些新的结构鉴定方法，如质谱联用技术、光学显微镜成像、负染电镜等。
这些方法的出现，为蛋白质结构鉴定提供了更多的选择和便利。
由于篇幅所限，本文仅对重组蛋白质的表达、纯化和结构鉴定进行了简要介绍。
事实上，研究重组蛋白质的过程还包括目标基因的设计与合成、蛋白质的功能分析等环节。
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重组蛋白纯化概述蛋白的分离纯化是生物工程下游阶段一个比较重要的部分，尤其在基因工程重组蛋白的分离纯化中，上游过程的许多因素会直接影响到下游蛋白的分离，充分利用上游对下游的影响，对蛋白的纯化做一个全面的考虑和整体的设计。
是否带有亲和标签，His标签，GST标签等，不同的亲和标签选择不同的纯化方案；可能是可溶性表达，可能形成包涵体，可溶性的蛋白往往需要复杂的纯化步骤，而包涵体易于分离，纯度较高，但回收具有生物活性的蛋白却变的相当困难，需要对聚集的蛋白进行变复性，通常活性蛋白的得率比较低；是否对宿主细胞具有毒性，从而选择抗毒性的表达系统；怎样选择表达系统，是大肠杆菌表达系统，酵母表达系统还是CHO细胞表达系统，不同的表达系统和培养方法显著影响下游的处理过程，目标蛋白表达的定位（胞内、细胞内膜、周质空间和胞外），蛋白表达的量都依赖于所选择的表达系统；蛋白的化学性质，是否容易被蛋白酶降解，是否会和一些金属离子，化学成分发生反应；蛋白的物理性质，是否对温度敏感等。
从蛋白基因的获取，蛋白基因的克隆，蛋白的表达，做好一个整体的规划，将对纯化工作的方便快捷高效带来关键的影响。
基因工程构建的纯化标记有很多，通过改变 cDNA在被表达的蛋白的氨基端或羧基端加入少许几个额外氨基酸，这个加入的标记可用来作为一个有效的纯化依据。
GST融合载体，蛋白A融合载体，含组氨酸标记（Histidine-tagged）等，不同亲和标签的蛋白有不同的纯化方案。
一．含组氨酸标记（Histidine-tagged）重组蛋白的纯化（一）选择亲和标签时需要考虑的因素亲和标签与目标蛋白之间的作用是相互的，需要综合的考虑，既要考虑到对目标蛋白结构功能的影响，又要考虑到对标签与其配体亲和作用的影响，以及实际的用途。
（1）亲和标签是否会影响到目标蛋白的结构和功能，大多数情况首选短的多肽标签，这是因为短的肽标签对目标蛋白的结构影响最小，而大的亲和标签可能限制重组蛋白的折叠，影响蛋白质的生物学功能。
（2）亲和标签对蛋白质稳定性的影响，亲和标签的加入是否会影响到目标蛋白的真确折叠，是促进目标蛋白的可溶性，还是容易形成包涵体，会不会造成氨基酸C和N段地破坏，使目的蛋白表达不完全。
（3）亲和标签所融合的位置，亲和标签可以加在N端，可以加在C端，也进行串联。
多数情况下蛋白质的N端区域对蛋白质的功能不是太重要，所以在N端进行融合标签的融合常常能保留蛋白质的生物学功能。
由于N端DNA序列对蛋白质的转录翻译影响较大，所以标签加在N端对蛋白质的表达水平影响更大，优化标签的mRNA结构可使表达水平提高。
可能有些蛋白纯化后需要去除亲和标签C端融合在去除融合标签后在目标蛋白的C端会有几个氨基酸残留，而小心的选择剪切特异性的氨基酸序列就可以在去除N端亲和标签后得到天然的目标蛋白。
（4）亲和洗脱的条件，有些条件比较温和，而有些条件较为剧烈，选择的亲和表达系统应该不使目标蛋白变性。
（二）含组氨酸蛋白纯化的依据蛋白质表面的组氨酸与多种过渡金属离子如Cu2+，Zn2+，Ni2+，Co2+，Fe3+形成配位相互作用，从而能够吸附富含这类氨基酸的蛋白质，从而达到分离纯化的目的。
因此，固定有这些金属离子的琼脂糖凝胶就能够选择性地纯化这类含有多个组氨酸的蛋白以及多肽和核苷酸。
半胱氨酸和色氨酸与固定金属离子结合力要远小于组氨酸残基，对纯化影响不大。
螯合物的稳定性受单个组氨酸和半胱氨酸解离常数所控制，从而亦受流动相的pH和温度的影响，控制条件可以使不同蛋白质相互分离。
蛋白样品的预处理1．诱导方式:诱导方式的选择上，为了得到真确折叠的目的蛋白，表达菌种的生长情况，菌种是否健壮，是否是单克隆菌种，菌体的浓度是否适合诱导，生长状态不好的表达菌，一方面会造成目的蛋白的错误折叠，造成蛋白大小，形态等发生改变，另一方面会因为IPTG的加入，导致菌体的死亡或者降解。
低温度诱导有助于蛋白二硫键的正确折叠，但对于高温表达的蛋白不适合低温状态，温度过高容易导致包涵体的形成。
诱导剂：基因的诱导表达基于乳糖操纵子调节机制，没有乳糖存在的时候，阻碍物基因产生阻碍蛋白，阻碍蛋白和操纵子结合，抑制基因的表达；当有乳糖存在的时候，B-半乳糖苷酶和乳糖作用产生异半乳糖，异半乳糖和阻碍蛋白结合，解除抑制，激活基因，开始表达蛋白。
诱导的浓度的高低对目的蛋白的表达也会有产生影响。
BL21（DE3）, Rosetta(DE3)等大肠杆菌表达系统这些菌株都敲除了蛋白酶，并溶源了噬菌体DE3。
DE3是的一种衍生λ噬菌体，带有噬菌体21抗性区和lacI基因，lac UV5启动子，以及 T7 RNA聚合酶基因。
这一区段被插入int 基因，因此阻止了DE3在没有辅助噬菌体时整合到染色体上或从染色体切出。
一旦形成DE3溶原状态，就只有受IPTG诱导的lac UV5启动子指导T7 RNA聚合酶基因转录，在溶原培养体系中加入IPTG诱导T7 RNA聚合酶生产，继而质粒上的目的DNA 开始转录。
3.抽提方式：进行破壁之前应该选择合适的缓冲组分，合适的pH 要结合酸碱溶液的滴定调节，尽量低的离子强度，加入一些稳定成分稳定成分，EDTA螯合重金属离子，Triton X-100，NP40等表面活性剂，保护非极性表面等。
4.确定蛋白质样品的形态，浓度黏度体积。
有时候得到粗蛋白的时候，会观是否符合目的蛋白的一些性质，确保得到是目标蛋白。
粗蛋白的形态有没有明显的差异，浓度是否符合纯化的要求，是否有较多的干扰物质，核酸色素强结合成分。
5.优化表达条件（1）重组蛋白不表达或者表达量低。
如果重组蛋白不表达（包含体和可溶蛋白都没有）通过改变诱导剂浓度，诱导温度，时间等都不表达的时候，然后尝试更换菌株、质粒载体。
降低诱导后培养温度。
重组蛋白表达得越慢，其折叠效果就越好，大肠杆菌在4℃时依然可以表达重组蛋白，而将培养温度降低至25-30℃就能显著改善蛋白折叠。
此方法不适用于温度诱导的重组蛋白表达；减少诱导剂。
诱导剂浓度可以降低至1/10；选用Lac渗透酶缺陷型菌株，如Tuner、Rosetta等，也有很好的效果。
这类菌株能够使进入每个细胞的诱导剂浓度相同。
重组蛋白在所有细胞中的表达水平相当时，减少诱导剂的效果更好。
（2）检查密码子构成，使其适应宿主菌的密码子偏好。
稀有密码子，尤其是位于重组蛋白N端的和大量集中的稀有密码子，会降低mRNA稳定性，显著降低翻译速度，引起翻译提前中止、翻译移码和突变。
将这些稀有密码子（尤其是N 端！）突变为宿主偏好的密码子，能够显著提高表达水平。
改善蛋白稳定性。
能够引起蛋白降解的因素很多，从蛋白自身性质到宿主性质不一而足，如果重组蛋白在表达时就被降解，表达量和稳定性就会受到很大影响。
在大肠杆菌中表达重组蛋白，需要牢记N端法则：当N端第二个残基是Leu、Arg、Lys、Phe、Tyr和Trp时，重组蛋白半衰期只有2分钟，而小侧链的氨基酸残基，如Ala，则可以提高蛋白稳定性。
因此在设计载体时，要特别注意第二个密码子，避免上述残基的出现。
处理高毒性蛋白：毒性极高的重组蛋白，其本底表达就会杀死原核宿主，质粒容易丢失，使其在大肠杆菌中很难得到高表达。
采用可表达T7溶菌酶的宿主。
T7溶菌酶是T7RNA聚合酶的抑制剂，采用含有T7溶菌酶质粒的宿主，如pLysS，可以降低重组蛋白在大肠杆菌快速生长期的本底表达量，在受到IPTG诱导时也能较好的表达蛋白。
（3）包涵体表达：包涵体蛋白折叠混乱、二硫键配对混乱、没有生物活性、变复性条件需要长时间摸索等，即使包涵体蛋白成功复性，其均一性和活性依然备受质疑。
但是包涵体表达也有其优势：能够很轻松的获得超高的表达量，不可溶的重组蛋白不会被宿主内的蛋白酶降解，重组蛋白的毒性被大大抑制，杂蛋白含量低（~10%），容易纯化等。
由于这些优点以及蛋白质复性条件的不断发展，表达包涵体蛋白逐渐为人们所接受，成为重组蛋白表达的一个常用方案。
与可溶蛋白相反，提高培养温度、延长培养时间、在较高的菌密度下诱导都有利于包涵体的形成；在破菌和变性溶解时加入还原剂能够打开错配的二硫键；在复性液中加入二硫键异构酶、脯氨酸异构酶、分子伴侣和蛋白的辅助因子可以帮助重组蛋白折叠；精氨酸和高分子量PEG能减轻蛋白分子的聚集；尝试多种物理手段，如透析、快速稀释和柱上复性等，有时对复性有奇效。
包涵体的表达相对简单，但其复性过程仍是依赖经验的，没有通用的方法可以套用。
（三）层析条件的选择1.离子交换剂的选择已知等电点的物质, 在高于其等电点的pH用阴离子交换剂, 在低于其等电点的pH用阳离子交换剂。
同时要考虑到该物质的稳定性及溶解度, 选择适当的pH 范围。
图1 蛋白质净电荷与pH的关系参照电泳的结果。
在中性或偏碱性条件下进行电泳, 向阳极移动较快的物质, 在同样条件下可被阴离子交换剂吸附, 向阴极移动或向阳极移动较慢的可被阳离子交换剂吸附。
2.缓冲液的选择（1）选用的pH 决定于被分离物质的等电点, 以及稳定性和溶解度。
选用的缓冲液离子, 其pK 值要接近于所要用的pH 值, 这样有较高的级冲能力, 可避免因缓冲离于与吸附剂相互作用而产生pH 改变。
（2）缓冲液离子应不影响被分离物的活性或干扰其测定。
应不影响被测物的溶解度, 或会加入一些必要的保护剂稳定目的蛋白，防止变性或者沉淀。
（3）对于阳离子交换剂应使用阴离子型级冲液(如磷酸、醋酸等); 用阴离子交换剂时应使用阳离子型级冲液(如Tr is 、胺盐、吡啶等), 以避免缓冲液离子被吸附而发生pH 改变。
（四）操作步骤1.离子交换剂的处理（1）不同的离子交换剂需要不同的处理，亲和层析填料，需要一整套的化学工艺，使其结合上一些亲和配基，例如用于纯化带His标签的Ni2+-sephrose 4B 就是将琼脂搪用环氧抓丙烷交联并加以适当处理而制成的，具有配基简单、吸附量大、分离条件温和、通用强等特点。
（2）阴离子交换剂和阳离子交换剂的处理：采用碱一酸一碱的顺序洗。
将干纤维素粉洒在0.5M NaOH 溶液中(每克千纤维素粉约15 毫升碱液)使自然沉降, 浸泡约30分钟, 用耐酸漏斗抽滤。
如碱液呈黄色, 可重复洗至无色。
用水充分洗净(用pH试纸试呈中性)。
再用0.5 M HCl 洗, 再水洗, 再用N aOH 洗, 最后充分用水洗。
碱洗时难过薄, 可加NaCl至0.5M。
如仍难过滤, 可用10 倍水稀释, 使其沉降, 倾去上清液。
(3)调节到所需p H 用上述条件的起始缓冲液充分洗涤使达到所要的p H 和盐浓度。
2.装柱根据蛋白表达量的多少，装入适当的填料，用起始缓冲液充分平衡，用时候为了纯粹的收集蛋白，装柱没有太多的要求，当然应根据不同的实验目的采用的方法不一样，相对于需要蛋白紫外吸收图谱的，需要分辨率较好的或者是过分子筛的，装柱应该注意，装柱时的注意事项如下:(l)交换剂悬浮液的浓度要适当, 细拉子可以浓一些, 加抽滤滤饼体积一半的缓冲液即可。