常用的五种动物细胞培养方式
第二节细胞培养方法及应用实例
配比
分包
疫苗产品
①原始种子——基因重组病毒株 当两种有亲缘关系的不同病毒感染同一宿主细
胞时，它们的遗传物质发生交换，结果产生不同于
亲代的可遗传的子代，称为基因重组。
基因重组病毒有“活病毒基因重组”、“灭活
病毒基因重组”及“死活病毒基因重组”。重组病
毒株原始种子属于死活病毒间的重组。
世卫组织提供的6支甲 型H1N1流感原始毒株
⑷包埋法 包埋就是将细胞包裹在有限空间内，制成固定化细胞。包埋后的细胞
不会扩散到周围介质中去，而底物和产物却能自由扩散。 包埋法仅只是将细胞包埋起来，不与载体发生反应，故包埋法细胞的
活性损失较小。包埋法根据其包埋的形式不同，又可将其分为格子型和微 胶囊型两种。
二、植物细胞培养方法
常见的植物组织细胞培养有愈伤组织培养、原生质体培养、花粉培养
一、动物细胞培养方法
根据动物细胞的生长特点，常见的细胞培养方法有贴壁培养、悬浮培 养及固定化培养等三种方法。
1.贴壁培养
所谓贴壁培养是指细胞贴附在 一定的固相表面（如：培养皿、培 养瓶等）进行的培养。 ⑴生长特性
贴壁依赖型细胞在培养时要贴附于培养（瓶）器皿壁上，细胞一经贴 壁就迅速铺展，然后开始有丝分裂，并很快进入对数生长期。一般数天后 就铺满培养表面，并形成致密的细胞单层。
HGPRT 骨髓瘤细胞
使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞 二者合二为一，得到杂种的骨髓 瘤细胞。这种杂种细胞继承两种
融合
(HAT)培养基
亲代细胞的特性，既具有 B淋巴 细胞合成专一抗体的特性，又有
由于挡板的存在，可有效地减小反应器内液面上的 旋涡。
2.贴壁培养反应器——中空纤维反应器
常见的贴壁培养反应器如：中空纤维反 应器、玻璃珠床反应器、陶质矩形通道蜂窝 状反应器等类型。
第3章 动物细胞工程制药(二)
2. 主要参数癿检测和控制方法
（1）温度（电阻温度计） （2）pH（复合式参比电极） （3）溶氧（极谱式或电流式覆膜电极） 为保持所需的溶氧，目前常采用的措施（P115） （4）搅拌（电磁感应癿转速计） （5）迚出液流量（泵速癿控制） （6）其他
温度传感器
pt-100温度传感器探头
DO电极
pH电极
显 微 镜 下 的 微 载 体
• 第二代微载体——多孔微载体/多孔微球 • 材粒：蛋白类（明胶、胶原）、纤维素、高分子塑料、特 种橡胶、玻璃、陶瓷…… • 优点：极大地增大了供细胞贴附的比表面积 • 缺点：培养条件不易均一，传质和传氧条件要求更高，清 洗较困难。
•
① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧ ⑨ ⑩
3.灌流式操作
• 灌注式操作是指细胞接种后迚行培养，一方面新 鲜培养基丌断加入反应器。一方面又将反应液连 续丌断地取出，但细胞留在反应器内，使细胞处 于一种丌断癿营养状态。 • 优点： ①细胞可处在较稳定的良好环境中，营养条件较 好，有害代谢浓度较低。 ②可极大地提高细胞密度，一般都可达107～108 个/ml，从而极大地提高了产品产量。 ③产品在罐内停留时间缩短，可及时收留在低温 下保存，有利于产品质量的提高。 ④培养基的比消耗率较低，加之产量质量的提高， 生产成本明显降低。
2.半连续式操作
• 半连续培养又称为反复分批式培养或换液培养。 • 是指在分批式操作癿基础上，每间隔一段时间，丌 全部取出反应系，而只取出部分培养物（或单纯条 件培养基，或连同细胞、载体），剩余部分重新补 充新癿营养成分，或另加新鲜载体，再继续培养， 这是反应器内培养液癿总体积保持丌变癿操作方式。 • 该法应用广泛，优点是操作简便，生产效率高，可 长时期迚行生产，重复收获产品，而且可使细胞密 度和产品产量一直保持在较高癿水平。
动物细胞培养技术
动物细胞培养技术动物细胞培养技术是生物学领域中的一项重要技术，它可以帮助科学家们研究动物细胞的结构、功能和生理过程。
通过培养动物细胞，科学家可以模拟生物体内的生理环境，从而更好地理解细胞的生物学特性。
本文将介绍动物细胞培养的基本原理和常用的培养技术。
一、动物细胞培养的基本原理动物细胞培养是指将动物体内的细胞取出并在体外特定的培养基中进行培养的过程。
培养基是一种模拟生物体内环境的营养液，它提供了细胞所需的必要营养物质和生长因子。
在培养基中，细胞可以获得适当的营养和生长条件，从而保持其生物学特性并进行增殖。
动物细胞培养的基本原理包括以下几点：1. 细胞来源：细胞可以来源于动物组织、器官或体液中，常用的细胞来源包括胎儿组织、胚胎组织、肿瘤组织等。
2. 细胞分离：细胞从组织中分离的方法通常包括机械分离、化学分离和酶解分离。
分离后的细胞可通过离心等方式得到单个的细胞悬液。
3. 培养基选择：根据细胞的特性和要求，选择合适的培养基。
培养基可以分为无血清培养基和含血清培养基，无血清培养基常用于细胞实验室中。
4. 细胞培养条件：通过调整培养温度、湿度、pH值、氧气含量等条件，提供合适的环境促进细胞的生长和增殖。
5. 细胞传代：当细胞达到一定密度时，需要进行细胞传代以保持其活力。
传代的方法通常是将细胞分散至新的培养容器中，以维持细胞的适宜密度。
二、常用的1. 无血清培养技术：无血清培养基是一种不含胎牛血清的培养基，通过添加人工合成的生长因子和营养物质来满足细胞的生长需求。
无血清培养技术避免了胎牛血清中含有的未知因子对实验结果的干扰，提高了实验的可重复性。
2. 原代细胞培养技术：原代细胞培养是将从动物体内直接获得的组织进行分离和培养。
这种方法可用于细胞的初次培养和研究。
但由于原代细胞在培养中只能进行有限的传代，其使用寿命较短，因此需要定期重新取材。
3. 细胞系的建立：细胞系是细胞通过传代培养，并保持了一定生物学特性和遗传稳定性的细胞群。
动物细胞培养方法
动物细胞培养方法
动物细胞培养是一种常用的实验手段，广泛应用于细胞生物学、药物研发、生物医学研究等领域。
以下是一般性的动物细胞培养方法：
1.细胞系的选择：选择合适的动物细胞系是动物细胞培养的第一步。
细胞系的选择要考虑细胞类型、来源、生长特性和用途等因素。
2.细胞培养基的准备：准备适用于所选细胞系的培养基。
培养基包括基本培养基和补充物，如生长因子、抗生素等。
不同的细胞系需要不同的培养基。
3.细胞的解冻：从冷冻保存的细胞库中取出细胞，进行解冻。
解冻过程要尽可能快速，以减少细胞对冷冻损伤的敏感性。
4.细胞传代：当细胞达到一定的密度时，需要将其传代，以维持细胞的生长状态。
传代过程包括细胞的分离、计数和重新接种。
5.细胞培养条件的控制：控制培养条件，包括温度、湿度、CO2浓度等。
通常细胞培养箱会提供稳定的培养环境。
6.细胞的观察和检测：定期观察细胞的形态、生长状态，并进行必要的细胞检测，如细胞计数、细胞周期分析等。
7.防止细胞污染：严格遵循无菌操作规程，防止培养物受到细菌、真菌、支原体等的污染。
使用无菌操作室和经过无菌处理的实验器材。
8.制备细胞冻存物：定期制备细胞冻存物，以备将来使用。
冻存物的制备需要使用适当的冻存液和合适的冷冻保存温度。
9.特殊操作：针对具体实验需求，可能需要进行细胞转染、感染、药物处理等特殊操作。
在进行动物细胞培养时，实验者需具备丰富的培养经验和相关技能，同时需按照实验室的标准操作规程进行操作，以确保实验的准确
性和可重复性。
生物制药 动物细胞工程制药
• 2、气升式生物反应器
• 与搅拌式生物反应器相比，具有剪切力小， 混合均一，氧和营养的传递好，由于没有 了机械搅拌的结构，有利于设备的密封， 降低了造价。高径比一般在10：1左右。
• 3、中空纤维式生物反应器
• 下图是由数百乃至数千根中空纤维集束组成的 反应器，纤维的材料为聚砜或丙烯共聚物，纤 维壁厚为50~100m，呈多孔性，内层为超滤 膜，内腔直径为200 m，两端用环氧树脂等 材料将纤维粘和在一起，并使内腔开口于外加 的塑料圆筒，使形成两个隔开的腔。
• 灌流式操作在某些生物反应器中是唯一可行 的操作方式，如中空纤维生物反应器、固定 床或流化床式反应器、膜式生物反应器等。 在这些反应器中，细胞已被固定，在取出部 分条件培养基和补充新鲜培养基和补充新鲜 培养基时，细胞基本上都被保留反应器中， 故采用该操作不存在困难。
• 但在微载体培养、悬浮培养和结团培养中，就存 在一个如何使条件培养基和细胞、载体分离的问 题。为了解决该问题，目前采用的方法有与旋转 轴连在一起的滤网、有专门用于悬浮细胞的中空 纤维分离器、超声波分离器和靠微载体自重沉降 分离的上细下粗的排液柱以及靠离心分离的专用 离心机等。
检测： 光学显微镜检查； 荧 光 显 微 镜 下 观 察 ： 荧 光 染 料 （ Hoechst ， Hoechst/PI, 丫啶橙/溴化乙锭）对细胞染色 细胞流式分析：检测培养过程中的细胞凋亡。
• 琼脂糖凝胶电泳：
• 凋亡的主要生化特征是激活一种Ca2+/Mg2+依赖型 的核酸内切酶，将核DNA切割成200 bp或更大的 片断。而坏死细胞不会出现DNA断裂片段
在动物细胞培养中，细胞凋亡是很普遍的现象， 在各种环境下都能发生。
大规模培养技术的操作方式
深层培养可分为：分批式、流加式、半连续式、连续式、连续式和灌注式五种。
一、分批式培养（batch culture）是细胞规模培养发展进程中较早期采用的方式，也是其它操作方式的基础。
该方式采用机械搅拌式生物反应器，将细胞扩大培养后，一次性转入生物反应器内进行培养，在培养过程中其体积不变，不添加其它成分，待细胞增长和产物形成积累到适当的时间，一次性收获细胞、产物、培养基的操作方式。
该方式的特点:●操作简单。
培养周期短，染菌和细胞突变的风险小。
反应器系统属于封闭式，培养过程中与外部环境没有物料交换，除了控制温度、pH值和通气外，不进行其他任何控制，因此操作简单，容易掌握；●直观反映细胞生长代谢的过程。
因培养期间细胞生长代谢是在一个相对固定的营养环境，不添加任何营养成分,因此可直观的反映细胞生长代谢的过程,是动物细胞工艺基础条件或"小试"研究常用的手段；●可直接放大。
由于培养过程工艺简单，对设备和控制的要求较低，设备的通用性强，反应器参数的放大原理和过程控制，比较其它培养系统较易理解和掌握，在工业化生产中分批式培养操作是传统的、常用的方法，其工业反应器(Genetech)规模可达12000L。
分批培养过程中，细胞的生长分为五个阶段：延滞期、对数生长期、减速期、平稳期和衰退期，见图1。
分批培养的周期时间多在3-5天，细胞生长动力学表现为细胞先经历对数生长期（48-72h）细胞密度达到最高值后，由于营养物质耗劫或代谢毒副产物的累积细胞生长进入衰退期进而死亡，表现出典型的生长周期。
收获产物通常是在细胞快要死亡前或已经死亡后进行。
二、流加式培养（feeding culture）1.流加式培养是在批式培养的基础上，采用机械搅拌式生物反应器系统，悬浮培养细胞或以悬浮微载体培养贴壁细胞，细胞初始接种的培养基体积一般为终体积的1/2～1/3，在培养过程中根据细胞对营养物质的不断消耗和需求，流加浓缩的营养物或培养基，从而使细胞持续生长至较高的密度，目标产品达到较高的水平，整个培养过程没有流出或回收，通常在细胞进入衰亡期或衰亡期后进行终止回收整个反应体系，分离细胞和细胞碎片，浓缩、纯化目标蛋白。
043动物细胞工程-第四章第三节 细胞的基本培养技术
4．重新加入TdR培养基(浓度同上)进行第2次阻断，作用16 h。
5．再弃掉TdR培养基，Hanks液洗2—3次后换上普通培养基。第2次 TdR释放0 h时取样则细胞处于G1/S期交界处；如2-7 h取样则为不同 阶段的S期细胞。 注意：具体TdR作用和释放的时间应参考每一种待 同步化细胞的细胞周期各时相测定的参考值，也可根据经验确定。
有的只有永生性和无异体接种致癌性，有些则相反（恶性）。
第四节 细胞系和细胞株的建立 一、细胞系和细胞株的种类 1．初代培养 初代培养又称原代培养，即直接从体内 取出的细胞、组织和器官进行的第一次的 培养物。
2．细胞系 初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞 系。如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系(finite cell line)；已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞 系或无限细胞系(infinite cell line)。
位是否准确、组织是否保持活性、材料处理是否恰当，直接
1.鸡胚组织的取材：用于病毒与疫苗的研究
受精鲜蛋--孵化箱37℃孵育9-12d--从气室处
破壳--挑取鸡胚--按需取材。
2.鼠胚组织的取材：常用材料，易于培养。
杀死小鼠---75%酒精溶液整体消毒2--3s---固
定---剪开皮肤解剖取材。
2.取鼠胚：常用 材料，易于培养。
一次进行传代之前的时期，一个特征性的必然 的生长阶段。
完成了从体内环境到体外环境的过渡和适
应过程，恢复了分裂增殖与生长发育 的能力
取材——分离细胞——接种
一、原代培养
优点：组织和细胞刚刚离体，生物学特性未发生很 大变化，仍具有二倍体遗传特性，最接近和反映体内生 长特性，很适合作药物测试、细胞分化等实验研究。 （一）．组织取材 决定实验的成败。 取材是原代培养的最初环节，取材的部
动物细胞培养
概念动物细胞培养（animal cell culture）就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。
细胞培养是指细胞在体外条件下的生长，动物细胞在单独细胞培养的过程中不再形成个体。
2简介动物细胞培养液的成分体外细胞培养所需营养物质与体内基本相同，例如，需要糖、氨基酸、无机盐、促生长因子、微量元素等。
将细胞所需的上述物质按其种类和所需数量严格配制而成的培养基，称为合成培养基。
由于动物细胞生活的内环境还有一些成分尚未研究清楚，所以需要加入动物血清以提供一个类似生物体内的环境，因此在使用合成培养基时，通常需加入血清、血浆等一些天然成分。
[1]动物细胞培养液的特点液体培养基、通常含动物血清。
动物细胞培养的条件1.无菌、无毒的环境：对培养液和所有培养用具进行无菌处理，通常还要在培养液中加入一定量的的抗生素，以防被污染。
此外应定期更换培养液，以便清除代谢产物防止细胞代谢产物累积对细胞自身产生危害。
2.营养物质：无机物（无机盐、微量元素等），有机物（糖、氨基酸、促生长因子等）3.血清和血浆(提供细胞生长必须的营养成份)4.温度和pH（36.5±0.5℃，7.2~7.4）5.气体环境（95%的空气+5%CO动物细胞培养2的混合气体）其中5%CO2气体是为保持培养液的pH稳定基本过程取动物胚胎或幼龄动物器官、组织。
将材料剪碎，并用胰蛋白酶（或用胶原蛋白酶）处理（消化），形成分散的单个细胞，将处理后的细胞移入培养基中配成一定浓度的细胞悬浮液。
悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，成为细胞贴壁。
当贴壁细胞分裂生长到互相接触时，细胞就会停止分裂增殖，出现接触抑制。
此时需要将出现接触抑制的细胞重新使用胰蛋白酶处理。
再配成一定浓度的细胞悬浮液。
另外，原代培养就是从机体取出后立即进行的细胞、组织培养。
当细胞从动植物中生长迁移出来，形成生长晕并增大以后，科学家接着进行传代培养，即将原代培养细胞分成若干份，接种到若干份培养基中，使其继续生长、增殖。
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•一、半连续式培养
1.半连续式培养又称为重复分批式培养或换液培养。
采用机械搅拌式生物反应器系
统，悬浮培养形式。
在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时间，从中取出部分培养物，再用新的培养液补足到原有体积，使反应器内的总体积不变。
这种类型的操作是将细胞接种一定体积的培养基，让其生长至一定的密度，在细胞生长至最大密度之前，用新鲜的培养基稀释培养物，每次稀释反应器培养体积的1/2~3/4，以维持细胞的指数生长状态，随着稀释率的增加培养体积逐步增加。
或者在细胞增长和产物形成过程中，每隔一定时间，定期取出部分培养物，或是条件培养基，或是连同细胞、载体一起取出，然后补加细胞或载体，或是新鲜的培养基继续进行培养的一种操作模式。
剩余的培养物可作为种子，继续培养，从而可维持反复培养，而无需反应器的清洗、消毒等一系列复杂的操作。
在半连续式操作中由于细胞适应了生物反应器的培养环境和相当高的接种量，经过几次的稀释、换液培养过程，细胞密度常常会提高。
2.半连续式特点：
·培养物的体积逐步增加；
·可进行多次收获；
·细胞可持续指数生长，并可保持产物和细胞在一较高的浓度水平，培养过程可延续到很长时间。
该操作方式的优点是操作简便，生产效率高，可长时期进行生产，反复收获产品，可使细胞密度和产品产量一直保持在较高的水平。
在动物细胞培养和药品生产中被广泛应用。
二、连续式培养
1.连续式培养是一种常见的悬浮培养模式，采用机械搅拌式生物反应器系统。
该模
式是将细胞接种与一定体积的培养基后，为了防止衰退期的出现，在细胞达最大密度之前，以一定速度向生物反应器连续添加新鲜培养基；同时，含有细胞的培养物以相同的速度连续从反应器流出，以保持培养体积的恒定。
理论上讲，该过程可无限延续下去。
2.连续培养的优点是反应器的培养状态可以达到恒定，细胞在稳定状态下生长。
稳定状态可有效的延长分批培养中的对数生长期。
在稳定状态下细胞所处的环境条件如营养物质浓度、产物浓度、pH值可保持恒定，细胞浓度以及细胞比生长速率可维持不变。
细胞很少受到培养环境变化带来的生理影响，特别是生物反应器的主要营养物质葡萄糖和谷氨酰胺，维持在一个较低的水平，从而使他们的利用效率提高，有害产物积累有所减少。
然而在高的稀释率下，虽然死细胞和细胞碎片及时清除，细胞活性高最终细胞密度得到提高；可是产物却不断在稀释，因而产物浓度并为提高；尤其是细胞和产物不断的稀释，营养物质利用率、细胞增长速率和产物生产速率低下。
3.连续式培养不足：
·由于是开放式操作，加上培养周期较长，容易造成污染；
·在长周期的连续培养中，细胞的生长特性以及分泌产物容易变异；
·对设备、仪器的控制技术要求较高。
连续式培养操作使用的反应器多数是搅拌式生物反应器，也可以是管式反应器。
4.连续式培养的特点：
·细胞维持持续指数增长；
·产物体积不断增长；
·可控制衰退期与下降期。
四、灌流式培养
1.灌流式培养是把细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，不断地将部分条件培养基取出，同时又连续不断地灌注新的培养基。
它与半连续式操作的不同之处在于取出部分条件培养基时，绝大部分细胞均保留在反应器内，而半连续培养在取培养物时同时也取出了部分细胞。
灌流式培养常使用的生物反应器主要有两种形式。
一种是用搅拌式生物反应器悬浮培养细胞，这种反应器必须具有细胞截流装置，细胞截留系统开始多采用微孔膜过滤或旋转膜系统，最近开发的有各种形式的沉降系统或透析系统。
中空纤维生物反应器是连续灌流操作常用的一
种。
它采用的中空纤维半透膜，透过小分子量的产物和底物，截流细胞和分子量较大的产物，在连续灌流过程中将绝大部分细胞截留在反应器内；近年来中空纤维生物反应器被广泛应用于产物分泌性动物细胞的生产，主要用于培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体。
另外一种形式是固定床或流化床生物反应器，固定床是在反应器中装配固定的篮筐，中间装填聚脂纤维载体，细胞可附着在载体上生长，也可固定在载体纤维之间，靠上搅拌中产生的负压，迫使培养基不断流经填料，有利于营养成分和氧的传递，这种形式的灌流速度较大，细胞在载体中高密度生长。
流化床生物反应器是通过流体的上升运动使固体颗粒维持在悬浮状态进行反应，适合于固定化细胞的培养。
2.灌流式培养的优点：
·细胞截流系统可使细胞或酶保留在反应器内，维持较高的细胞密度，一般可达
107-109/ml，从而较大的提高了产品的产量；
·连续灌流系统，使细胞稳定的处在较好的的营养环境中，有害代谢废物浓度积累较低；
·反应速率容易控制，培养周期较长，可提高生产率，目标产品回收率高；
·产品在罐内停留时间短，可及时回收到低温下保存，有利于保持产品的活性。
连续灌注培养是近年用于动物细胞培养生产分泌型重组治疗性药物和嵌合抗体及人源化抗体等基因工程抗体较为推崇的一种方式。
应用连续灌流工艺的公司有Genzyme, Genetic Institute, Bayer公司等。
这种方法最大困难是污染机率较高，长期培养中细胞分泌产品的稳定性，规模放大过程中工程问题。
五、细胞工厂培养
细胞工厂(cell factory)是一种设计精巧的细胞培养装置。
它在有限的空间内利用了最大限度的培养表面，从而节省了大量的厂房空间,并可节省贵重的培养液。
更重要的是，它可有效地保证操作的无菌性，从而避免因污染而带来的原料、劳务和时间损失。
它是对传统转瓶培养的革命。
丹麦NUNC公司生产的NUNC细胞工厂是目前应用较多的细胞工厂系统。
可用于如疫苗、单克隆抗体或生物制药等工业规模生产，特别适合于贴壁细胞，也可用于悬浮培养，在从实验室规模进行放大时不会改变细胞生长的动力学条件，可提供1，2，10和40盘的规格使放大变得简单易行，低污
染风险，节省空间，培养表面经测试保证最有利于细胞贴附和生长。
同时，与NUNC 的细胞工厂操作仪结合使用，可全面实现细胞培养的自动化，从而大大地减低劳动强度和密集度。
这套系统使用很方便，可产生类似塑料培养瓶的效果。
由组织培养级聚笨乙烯制成，使用后可随意处理。
其最大缺点是：经胰酶消化后，很难将细胞完全洗出。
(特美斯特生物)。