克罗诺氏菌检测-甘辛
婴幼儿配方粉中克罗诺杆菌检测方法研究进展
婴幼儿配方粉中克罗诺杆菌检测方法研究进展作者：王倩宁刘艳梅王弋博王廷璞来源：《赤峰学院学报·自然科学版》2020年第02期摘要：近克罗诺杆菌（Cronobacter spp.）是一种新发现的食源性致病菌，能引起婴幼儿脑膜炎、败血症和坏死性结肠炎，致死率高.因此，建立准确、快速、有效的检测方法已成为克罗诺杆菌研究的首要任务.阐述了克罗诺杆菌的分类和检测研究进展，将传统生化检测、分子层面和免疫层面检测方法进行汇总对比，为进一步优化克罗诺杆菌的检测体系提供参考.关键词：克罗诺杆菌;检测方法;研究进展中图分类号：TS207.4; 文献标识码：A; 文章编号：1673-260X（2020）02-0036-07食品安全是一個重大的全球性公共卫生问题，由致病菌引起的食源性疾病是当前最主要的食品安全问题.克罗诺杆菌（Cronobacter spp.）是新发现的一种食源性致病菌，分布广泛，在婴幼儿乳制品、鲜蔬菜、谷类、调味料及肉制品等多种食品中均被检出过[1]，该菌是一种条件性致病菌，致死率高达40-80%[2]，主要症状为婴幼儿脑膜炎、菌血症和小肠结肠炎等[3]，克罗诺杆菌被国际食品微生物标准化委员会列为“严重危害特定人群，危害生命或慢性实质性后遗症或长期影响”的一种致病菌[4].目前还尚未确定克罗诺杆菌的宿主和传播途径，分析全球范围内报道的婴幼儿感染事件，表明婴幼儿配方粉是该菌的主要感染源[5].因此，建立快速有效的检测方法已成为克罗诺杆菌研究的主要内容之一.目前，国内外克罗诺杆菌的检测方法主要有常规生化检测方法、分子生物学检测法和免疫学为基础的检测方法.此文旨在从分类和检测方法两个方向来阐述克罗诺杆菌的研究进展，为研究克罗诺杆菌的有效检测方法提供更全面的参考.1 克罗诺杆菌分类克罗诺杆菌是一种寄生在人和动物肠道内，周身鞭毛、无芽孢的兼性厌氧型革兰氏阴性菌.初名黄色阴沟肠杆菌，直到1980年，Farmer等[6]人对肠杆菌进行DNA杂交试验，发现原黄色阴沟肠杆菌菌株之间DNA互补程度高达83-89%，与阴沟肠杆菌一致性仅为31-49%，结合生化反应、色素产物及抗生素敏感性等分析，Farmer等将其定义为肠杆菌属的一个新种，并建议更名为阪崎肠杆菌（Enterobacter sakazakii）.随着分子生物学技术的发展，Iverson等[7-8]根据16S rRNA基因序列特征、DNA杂交、核糖体分型以及扩增片段长度多态性荧光标记，对阪崎肠杆菌进行系统学分析，提议将该菌划分为一个新属——克罗诺杆菌属（Cronobacter gen. nov）.该属由1个新组合Cronobacter sakazakii;4个新种及l个基因种（Cronobacter genomospecies 1）组成.2012年Joseph等[9]对5株克罗诺杆菌的表型分型、7个管家基因的多位点序列进行分析和16S rRNA基因测序，发现了两个新种，尤尼沃斯克罗诺杆菌（Cronobacter universalis）和康帝蒙提克罗诺杆菌（Cronobacter condimenti），其中尤尼沃斯克罗诺杆菌代替之前的基因种.目前，克罗诺杆菌属包括7个种（见表1），和3个都柏林亚种（Cronobacter dublinensissubsp. Dublinensis），乳粉亚种（Cronobacter dublinensissubsp. Lactaridi）和洛桑亚种（Cronobacter dublinensissubsp. Lausannens）.2 克罗诺杆菌的检测方法2.1 传统生理生化检测方法克罗诺杆菌的传统分离检测方法，首先进行富集培养，再进行选择性培养，经分离纯化后得到目标菌株，此方法依据菌株形态学特点和生化鉴定结果进行检测.目前克罗诺杆菌主要的生理生化检测方法有3种：美国食品药品监督管理局（food and drug administration，FDA）方法、阪崎肠杆菌显色培养基（druggan-forsythe-iversen，DFI）方法和中国国家标准方法GB 4789.40-2016.国际上首个官方检测方法是美国FDA在2002年制定的“婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的分离和计数”（此前名为阪崎肠杆菌）[10].检测时，在无菌条件下每个奶粉样品分别称取100g、10g和1g各3份，以1∶10稀释倍数进行稀释，取10mL混合液接种到90mL无菌肠杆菌增殖（enterobacteria enrichment broth，EE）肉汤中，37℃孵育过夜;后取适量增菌液划线于结晶紫中性红胆盐葡萄糖培养基（violet red bile glucose agre，VRBGA）上，37℃过夜培养.挑取5个典型或疑似菌落划线接种于大豆酪蛋白培养基（tryptose soya agar，TSA）上，25℃培养48-72h.用API 20E试剂条对TSA上的黄色菌落进行生化鉴定[11].该法需要7d左右的检测时间，且有些克罗诺杆菌与某些肠杆菌科菌株的菌落形态和颜色在VRBGA培养基上差异小，挑取难度较高，存在误检和漏检的风险.再者，有些克罗诺杆菌在TSA培养基上培养后菌体产生的黄色色素深浅不一，不易判定，也增加了误检和漏检的风险.Guillaume-Genti等[12]将FDA方法中的EE肉汤更换为10mg/L改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素（modified lauryl sulfate tryptose vancomycin medium，mLST-Vm）.随后的生理生化检测研究中在该法的基础上将选择性培养基VRBGA改进为阪崎肠杆菌显色培养基DFI，DFI培养基中加入了发色集团5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-葡萄糖苷（Xa-Glc），提高了检测的特异性.国际标准微生物委员会以此方法为检测婴幼儿配方粉的技术规范，即ISO/TS 22964-2006“乳和乳制品中阪崎肠杆菌的检测”[13].该方法用mLST-Vm和添加了显色剂Xa-Glc的DFI 琼脂代替FDA方法中的EE肉汤和VRBGA，提高了阪崎肠杆菌的检出率[14-15].中华人民共和国国家标准GB 4789.40-2016“克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检验”中，以mLST-Vm和阪崎肠杆菌显色培养基作为选择性增菌和选择性分离的培养基进行检测.2.2 分子生物学检测法常用的分子生物学检测方法有普通聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）法、实时定量PCR法和环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）等.分子生物学检测方法解决了传统方法实验操作繁琐、检测时间长等问题.2.2.1 普通PCR2003年Keyser等[16]以阪崎肠杆菌16S rRNA -23S rRNA区域序列（ITS）为分子靶点，首次建立了阪崎腸杆菌的快速PCR检测方法.随后Lehner等[17]发现Keyser制定的PCR检测方法特异性不高，出现阴沟肠杆菌假阳性和莫金斯克罗诺杆菌假阴性的结果.针对这个问题，Lehner等研究克罗诺杆菌16S rRNA序列并建立进化树，形成了特异性强、高灵敏度的PCR检测系统，灵敏度高达10pg.为了建立最适的阪崎肠杆菌PCR检测方法.Nair等[18]通过克隆阪崎肠杆菌的外膜蛋白A （ompA）基因，建立了单重PCR快速检测法，检测结果显示该方法对克罗诺杆菌的检测具有良好的特异性.楼秀芹等[19]针对克罗诺杆菌ompA基因、16s rDNA和ITS序列进行多重PCR 检测，其结果与国家标准方法检测的结果相一致.Stoop等[20]首次提出针对克罗诺杆菌属特异性很强的rpoB基因序列设计引物进行检测.Huang等[21]通过克隆DNA促旋酶B亚基基因，构建了仅能区别阪崎克罗诺杆菌和都柏林克罗诺杆菌的PCR检测法.曲春波等[22]2013年首次利用编码DNA促旋酶B亚基基因（拓扑异构酶型Ⅱ）的gyrB看家基因，设计了特异性引物，灵敏度达到1.41 pg/PCR，建立了克罗诺杆菌PCR快速检测方法.可见普通PCR检测靶点包括16s rDN、ITS序列、ompA基因、rpoB基因和DNA促旋酶B亚基基因等.2.2.2 实时定量PCR实时定量PCR（又称荧光定量PCR），是一种核酸定量技术.在普通PCR检测基础上加入了荧光探针，把核酸扩增、杂交、光谱分析和实时检测技术结合在一起，依据荧光检测信号的强弱来鉴定PCR产物，提高了检测的灵敏度[23].2005年Seo和Brackett[24]首次针对阪崎肠杆菌dnaG基因5'端和rpsU基因3'末端设计引物和Taq Man探针，构建实时定量PCR检测方法.采用该体系鉴别克罗诺杆菌、肠杆菌和非肠杆菌科细菌，结果显示此方法特异性强、准确度高，检测灵敏度可达到0.6cfu/g.且检测过程中省去平板接种和生化鉴定的时间，检测效率远高于传统方法，作为FDA筛选和确认婴儿配方奶粉中克罗诺杆菌的官方方法之一.2012年Soler等[25]利用palF基因序列设计引物对多株克罗诺杆菌进行实时定量PCR检测，准确度达到100%，特异性强，未发现非克罗诺杆菌的菌株，且样品的检测限可达到1 cfu/10g，灵敏度高.Wang等[26]2012年利用MMS操纵子基因序列对67株菌株（包括4株克罗诺杆菌）进行实时定量PCR检测，检出率为100%，灵敏度高，且不受高浓度沙门氏菌侵染的影响.采用此方法和ISO方法同时对92份食品样品进行罗诺杆菌检测，其阳性检出率高于ISO方法.Dong等[27]和Hu等[28]分别针对ompA基因和cgcA基因设计探针引物，建立了比普通PCR灵敏度更高，特异性更强的检测方法.近年来，也有许多关于多重荧光定量PCR用于鉴定克罗诺杆菌的报到.Li等[29]以16S rRNA和fusA基因进行引物设计，建立出能够精确鉴别阪崎克罗诺杆菌和丙二酸盐阳性克罗诺杆菌的双重荧光定量PCR方法，检出限为102 cfu/mL.2016年Kaclíková和Oravcová利用dnaG基因建立了快速、准确地从婴幼儿配方奶粉产品中检测耐热性克罗诺杆菌的荧光定量PCR方法[30].2.2.3 环介导恒温扩增技术2000年Notomit等[31]建立了一种能在等温条件下，短时间内进行核酸扩增的环介导恒温扩增法.该技术能特异、高敏、高效地扩增目标基因，结果易判断.贺楠等[32]基于克罗诺杆菌16S rRNA基因设计LAMP引物，最低检测限为0.3pg/DNA，灵敏度是普通PCR的1000倍.Liu等[33]和徐晓可等[34]探究了LAMP法和PCR法在克罗诺杆菌快速检测中的差异性，研究结果一致表明LAMP法检测的特异性和灵敏性明显优于PCR法.马寅众等[35]对克罗诺杆菌16S rRNA基因及外膜蛋白A（ompA）基因设计LAMP引物进行LAMP法检测，ompA引物最低检出限仅为16S rRNA引物的1/10.即以外膜蛋白A （ompA）基因设计LAMP引物灵敏度更高.李静等[36]在原有单引物环介导恒温扩增技术的基础上，以阪崎克罗诺杆菌ompA基因序列为靶序列，加入荧光染料，通过对荧光信号的分析，建立了一种操作简单、耗时短、可实时监控的实时荧光单引物等温扩增检测阪崎克罗诺杆菌的方法.李丽丽等[37]针对克罗诺杆菌16S rRNA设计3组LAMP引物，建立的克罗诺杆菌恒温实时荧光检测法和传统国标检测结果一致，时效性高.2.2.4 免疫学为基础的检测方法免疫测定法（immunoassay，IA）是一种利用抗原和抗体特异性、可逆性为基础的诊断方法，对细菌的鉴别研究，已有多半个世纪[38].现已建立的克罗诺杆菌免疫学检测方法还不多.2.2.4.1 免疫磁珠法（immunomagnetic separatio，MS）免疫磁珠法是表面被抗体包被，进行抗原抗体特异性反应.在强大的外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的细菌被滞留在磁场中，而其他没有该种表面抗原的细菌不能与免疫磁珠相结合，从而达到分离的目的.这一技术目前已经广泛运用于细胞分离、微生物检测、蛋白质组学等方面也多有应用.朱英莲等[39]利用免疫磁性壳聚糖微球检测克罗诺杆菌，将氨基化修饰后的磁珠与克罗诺杆菌抗体进行偶联，捕获并富集细菌.结果显示该方法10.0min即可完成对克罗诺杆菌抗体的偶联，捕获率达94.7%，检测结果与传统培养法一致.说明免疫磁珠法是一种靶向特异性强、快速富集、分离克罗诺杆菌的有效方法.Chen等[40]建立了一种免疫磁珠分离联合荧光定量聚合酶链反应（immunomagnetic separation polymerase chain reaction，IMS-PCR）快速检测克罗诺杆菌的方法，该法以免疫磁珠富集细菌，同时基于细菌外膜蛋白A（ompA）基因设计特异性引物，进行PCR检测，经过8h 富集后，检出限从5.2×102cfu/mL降低至5.2×101cfu/mL.结果显示IMS-PCR方法非常灵敏、快速、可靠.支援等[41]使用量子点荧光标记和免疫磁性分离联合应用的检测方法，检测时间仅为2h，灵敏度高，特异性好，可应用于食品中的克罗杆菌检测.2.2.4.2 脂质体免疫检测法（liposome immunoassay，LIA）脂质体（Liposome）是脂类在水相介质中亲水头部插入水中，疏水尾部伸向空气，自发形成的内部中空外层是双层磷脂分子的球形小体[42]，直径约为25～1000nm.由于脂质体表面能结合单克隆抗体或基因抗体，内部水相可嵌合大量显色剂，使得所形成的免疫脂质体具有较高的灵敏度[43].Song等[44]基于荧光脂质体结合免疫兔获得抗穆汀斯克罗诺杆菌Ig G，制备荧光标记免疫脂质体，捕获穆汀斯克罗诺杆菌，裂解后，在激发波长为550nm和发射波长585nm下测定荧光信号，结果显示此方法灵敏度为6.3×104cfu/mL，相比传统检测方法具有快速、高效、低成本的优点.2016年Shukla等[45-46]人建立的阪崎克罗诺杆菌脂质体免疫检测法灵敏度高于间接非竞争酶联免疫吸附，且与克罗诺杆菌其他菌属，以及其他非克罗诺杆菌无交叉反应.2.2.4.3 酶联免疫吸附测定法（enzyme linked immuno sorbent assay，ELISA）酶联免疫吸附法同样以抗体和抗原的特异性结合为基础，和其他免疫方法区别在于其以酶或者辅酶标记抗原或者抗体，将抗原抗体的特异性与酶促反应的敏感性相结合，提高检测的灵敏性[47-48].采用ELISA技术，食品未经分离提取，即可进行定性和定量分析，显著提高了检出效率.目前，ELISA常用的方法有直接法、间接法、双抗体夹心法和竞争法等，该技术由于灵敏度高、特异性强、携带方便、易于商品化和经济实惠，在食品分析检测方面前景广阔.宋春美等[49]和周鹤峰等[50]，建立双抗夹心法检测克罗诺杆菌，分别在6h和2h内得到检测结果，检出限均约在104cfu/mL，对其他食品中常见致病菌的检测均呈阴性，无交叉反应灵敏度高.Park等[51]2012建立了一种可在24h内针对穆汀斯克罗诺杆菌的双抗夹心ELISA检测法，该法最低检出限为6.3×104cfu/mL，检测灵敏度高，与克罗诺杆菌其他菌属及其它常见致病菌间无交叉反应.Song等[52]利用间接非竞争性ELISA法建立了一种可同时检测7种克罗诺杆菌的快速检测方法，婴幼儿奶粉中含克罗诺杆菌细胞数在10个以下的样品，利用该方法可在36h内得到检测结果，显示出极高的灵敏性和特异性.2.2.4.4 电化学免疫传感器（Electrochemical; Immunosensor）电化学免疫传感器是将电化学传感与免疫分析技术相结合而构建的一类新型生物传感器，应用于痕量免疫原性物质的分析研究，因其特异性高、快速、稳定性强、造价低且操作程序简易，在食品安全领域已有较多的研究和初步应用[53].张晓等[54]依次将生物染料硫堇、辣根过氧化物酶标记的克罗诺阪崎肠杆菌抗体固定在用多壁碳纳米管/十二烷基苯磺酸钠修饰的四通道丝网印刷电极上，制成电化学免疫传感器.该方法检测阪崎克罗诺杆菌的线性范围为102-108cfu/mL，检出限为5.7×101cfu/mL，灵敏度很高，同时表现出较好的特异性和重现性（RSD=6.3%）.Shukla等[55]2018年使用氧化石墨烯纳米金离子复合物建立免疫传感器用于快速检测阪崎克罗诺杆菌.每个样品的分析时间只需要15min，无须任何富集或预富集，线性范围为2.0×102-2.0×107cfu/mL，检出限为2.0×101cfu/mL.与其他类型的克罗诺杆菌相比，此方法对阪崎克罗诺杆菌具有良好的选择性、再现性和反應性.表明其在阪崎克罗诺杆菌临床诊断中的具有潜在应用价值.3 展望克罗诺杆菌能引起新生儿致命伤害，而受到世界多国的高度关注，因此建立相关的有效检测方法极为重要.目前已逐步建立了克罗诺杆菌的传统生理生化检测、分子层面和免疫等层面的检测方法，其中传统生理生化检测不需要特殊的设备和技能，是食品安全国家标准选用的方法，也是各个质检部门的首选方法，缺点是耗时、费力;为适应食源性致病菌的快速检测，分子检测和免疫检测方法应运而生，分子检测方法灵敏度高、时效性好，且引物的扩增是在完全封闭状态下进行，避免了产物的污染，但分子层面的检测依赖基因的特异性，寻找特异性显著、可靠的基因片段，是以后的发展方向;抗体层面的检测基于抗原和抗体特异性结合，靶向特异性强、灵敏度高、简单、快速，成为近些年的研究热点.综上所述，建立特异性好、敏感度高、简单经济、重现性高的克罗诺杆菌检测方法有待于进一步的研究.随着克罗诺杆菌属菌株基因数据库的完善，免疫传感器的性能的改善以及免疫检测手段的改进，分子层面、抗体层面及电化学相结合的检测方法将成为克罗诺杆菌检测的发展趋势.參考文献：〔1〕Iversen C， Forsythe S. 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Electrochemical coupled immunosensing platform based on graphene oxide/gold nanocomposite for sensitive detection of Cronobacter sakazakii in powdered infant formula[J]. Biosensors & Bioelectronics， 2018， 109：139-149.。
库克氏菌鉴定方法及临床感染分析
库克氏菌鉴定方法及临床感染分析作者：郭玉荣等来源：《现代养生·下半月版》 2016年第1期郭玉荣1 杨锐21 甘肃省民乐县人民医院甘肃省民乐县 7345002 甘肃省甘州区人民医院甘肃省甘州区734000【摘要】库克氏菌(Kocuria) 是需氧生长的革兰氏阳性球菌，广泛分布于自然界的空气、水、土壤中，是人体的皮肤及呼吸道黏膜表面的正常菌群。
通常情况下不致病，当机体免疫力低下时引起各种机会感染，如脑膜炎、心内膜炎、菌血症、败血症、脓肿、关节炎、呼吸道感染等症。
近些年来库克氏菌引起的感染报道日渐增多，已是人体重要的机会致病菌，应引起临床和微生物室的重视。
【关键词】库克氏菌；鉴定；临床感染1 库克氏菌的分类自然环境和临床常见的库克氏菌是玫瑰库克菌(K.roesus)、变异库克菌(K.varians)、克氏库克菌(K.kristinas)。
《伯杰系统细菌学手册》将这3 个菌规属于细菌域，放线菌门，放线菌纲，放线菌亚纲，放线菌目，微球菌亚目，微球菌科(Micrococcaceae)，微球菌属(Micrococcus)，也称玫瑰微球菌、变异微球菌、克氏微球菌。
1995 年根据16S rRNA 序列同源性和化学分析[1]，重新分类将其划归库克菌属，和微球菌属同属微球菌科。
2 库克氏菌的生物学特性2.1 培养特性库克氏菌专性需氧，营养要求不高，生长速度慢于葡萄球菌，在血琼脂平板或营养琼脂平板35℃孵育24h，形成略小于葡萄球菌的圆形、突起、表面光滑、边缘整齐、不透明、白色、黄色、橙色或桔红色菌落，可出现α 溶血，延长孵育时间菌落色素加深，在液体培养基呈浑浊生长。
菌落有粘性，不易混悬于盐水中。
2.1 形态染色库克氏菌直径为1~1.8μm，略大于葡萄球菌，多成对、四联、成簇排列，因生长繁殖时呈两个垂直平面分裂，故成四个联在一起呈方块状，立体感强；无鞭毛、无芽胞，在脓液及体液等原始标本中可形成荚膜，体外培养即消失。
细菌鉴定册
真菌酵母样真菌生化编码TH-15C·鉴定系统细菌名称Candida albicansl.白色念珠菌1·Cr.1aurentii 罗伦隐球菌ea.albieans2 白色念珠菌2 Cr.neofomans 新型隐球菌Ca..boidinii .鲍狄尼念珠菌Cr.terreUs 地生隐球菌&.cife.rrii 西弗念珠菌Cr.uniguttulatus 指甲隐球菌Ca.colliculosa 软念珠菌Geot6chum capitatum 头状地霉Ca.dubliniensis 督贝里念珠菌Ge.penicillamm 帚状地霉Ca.famata 法码念珠菌Hansenula polymorpha 多形汉逊酵母Ca.glabrata 光滑念珠菌,Kloeckera spp .克勒克氏酵母种类Ca.guilliermondii 季也蒙念珠菌(高里氏)Pichia ohmeri 噢么毕赤酵母Ca.kefyr 高加索乳念珠菌Prototheca wickerhamii 威克原壁酵母Ca.krusei/inconspicua克柔氏/平常念珠菌Rhglutinis 粘红红色酵母Ca.1usitaniae 葡萄牙念珠菌Rh.mucilaginosal 胶粘红酵母1Ca.ma_g oliae 木篮念珠菌Rh.mucilaginosa2 胶粘红酵母2Ca.norvegensis 挪威念珠菌Rh.minuta 小红酵母.Ca.parapsilosis 近平滑念珠菌(副秃发) Saccharomyces cerevisiael酿酒酵母1Ca.pellicuk~a 产膜念珠菌- Sa.cerevisiae2 酿酒酵母2Ca.rugosa 皱落念珠菌(皱褶) Sporobolomyces salmonicolor赭色掷孢酵母Ca.sphaeficai 球形念珠菌1 Trichospron.asahii 阿萨丝孢酵母Ca.sphaerica2 球形念珠菌2 Tr.inkin 因凯丝孢酵母Ca.tropi~alis 热带念珠菌Tr.mucoides 似粘丝孢酵母Ca.utilis (效用念珠菌)Ca.zeylanoides 桶形念珠菌(廷沫) .Cr.albidus 白色隐球菌Cr.humicolus 土生隐球菌酵母样真菌生化编码鉴定系列TH-15C使用说明一、检验程序:(一)形态致病性酵母样真菌系一群呈酵母样菌落的单细胞芽生真菌。
七种杀菌剂对番茄早疫病病原菌室内毒力测定
七种杀菌剂对番茄早疫病病原菌室内毒力测定方案，为番茄早疫病的防治提供科学依据，制定出切实可行的防治措施。
1 材料与方法1.1材料1.1.1供试菌株番茄早疫病病原菌株采集于豫北地区番茄种植大棚中的病果，经组织分离、纯化获得病原菌［10］。
1.1.2试验药剂50%异菌脲（病可丹）可湿性粉剂为山东鑫星农药有限公司生产，50%氯溴异氰尿酸（比秀）可湿性粉剂为以色列海法作用保护有限公司生产，80%丙森锌（好锌泰）水分散粒剂为陕西美邦农药有限公司生产，10%苯醚甲环唑（病可丹）水分散粒剂为山东鑫星农药有限公司生产，50%醚菌酯（信赖）可湿性粉剂为陕西美邦农药有限公司生产，32.8%烷基腈氧基醌（凯银）水分散粒剂、35%腐霉利悬浮剂为宜宾川安高科农药有限责任公司生产。
1.2方法1.2.1杀菌剂单剂毒力测定将7种杀菌剂单剂与PDA培养基充分混匀，配制成0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、5.00mg/L系列浓度的平板。
采用菌丝生长速率法测定，用5mm打孔器在培养6d后的番茄早疫病菌平板上打孔，用镊子取菌丝面向下接种在含药PDA培养基上，每皿1个菌碟，28℃倒置培养，以去离子水作为对照组，每个处理设3次重复，于接种后第3天检查菌丝生长情况并用十字交叉法测量菌落生长直径，通过菌丝生长抑制率值和各药剂浓度对数值间的线性回归性进行分析，求出各菌株EC50并计算相对抑菌率。
抑菌率计算方法为每个菌落使用十字交叉法测量2次，取其平均数作为菌落的大小。
计算7种杀菌剂对菌丝生长的抑制百分率，公式如下：菌落增长直径=菌落测量直径-菌盘直径抑菌率=（对照菌落增长直径-含药培养基上菌落增长直径）/对照增长菌落直径x100%[11]以浓度对数为横坐标（x）,相对抑制率几率值为纵坐标（丫），求出各药剂对供试菌株的毒力回归曲线方程y=a+bx、相关系数r与有效抑制浓度（EC50）。
根据EC50分析比较不同杀菌剂对供试病菌菌丝生长的影响[12]。
LAMP在阪崎克罗诺杆菌检测中研究进展
LAMP在阪崎克罗诺杆菌检测中的研究进展王彦人1，焦敬波1，张钧森1，康青1，李萍1，杜欣军1*(1.省部共建食品营养与安全国家重点实验室，天津科技大学食品科学与工程学院，天津，300457)摘要：阪崎克罗诺杆菌（Cronobacter sakazakii）是一类食源性致病菌，可引起新生儿脑膜炎、败血症等疾病。
环介导等温扩增（Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP）技术是一类新型的恒温核酸扩增技术，具有灵敏度高、耗时短、特异性强、对设备需求低等特点，可与多种检测方法结合应用于食源性致病微生物的检测。
本文旨在阐明LAMP的基本原理并归纳结合不同检测方法的LAMP技术在阪崎克罗诺杆菌快速检测中的研究进展。
关键词：阪崎克罗诺杆菌；环介导等温扩增；快速检测中图分类号：TS201.6Process of Loop-Mediated Isothermal Amplification for Detection inCronobacter sakazakiiWANG Yanren1，JIAO Jingbo1，ZHANG Junsen1，KANG Qing1，LI Ping1，DU Xinjun1*(1. State Key Laboratory of Food Nutrition and Safety, College of Food Science and Engineering, TianjinUniversity of Science and Technology, Tianjin 300457, China)Abastract:Cronobacter sakazakii is a kind of foodborne conditional pathogenic bacteria, which can cause neonatal meningitis, septicemia and other diseases. Loop-mediated isothermal amplification technique (LAMP) is a new type of isothermal nucleic acid amplification technique with high sensitivity, rapidity and low equipment requirements. It can be combined with a variety of detection methods for practical application and has been widely used in the detection of foodborne microorganisms. This paper aims to elucidate the phylogenetic taxonomy of C. sakazakii, the basic principles of LAMP, and to summarize the progress of LAMP technology combined with different detection methods in the detection of C. sakazakii.Keywords: Cronobacter sakazakii, loop-mediated isothermal amplification (LAMP), rapid detection阪崎克罗诺杆菌为克罗诺杆菌属（Cronobacter，主要种型如表1所示）中最为典型的一类食源性致病菌种，易感染全年龄段人群0，致死率高达40~80%0。
2022_年东营市食品风险微生物检测结果分析
2022年东营市食品风险微生物检测结果分析耿 营，孙宗永*，李欣欣，刘甘霖，王会清，王念杰（东营市疾病预防控制中心，山东东营 257000）摘 要：目的：调查山东省东营市2022年食品风险微生物污染现状。
方法：在东营市各县区超市、零售店、农贸市场、网购、批发市场、餐馆、集体食堂、快餐店、小吃店和街头摊点等场所进行随机抽样，对所抽样的食品进行微生物检测，包括沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌、蜡样芽孢杆菌、铜绿假单胞菌和克罗诺杆菌。
结果：2022年共采集12类食品，270份样本，总检出率为9.3%。
其中，沙门菌3株、单核细胞增生李斯特氏菌3株、副溶血性弧菌3株、蜡样芽孢杆菌8株、铜绿假单胞菌2株和克罗诺杆菌6株。
生禽肉、即食生制动物性水产品（海产品和淡水产品）、即食烘焙麦片、饮用水、外卖配送餐和学生午餐中的致病菌检出率分别为20.0%、15.0%、15.9%、10.0%、18.8%和13.3%。
结论：东营市食品存在不同程度的污染，生禽肉、即食生制动物性水产品（海产品和淡水产品）、即食烘焙麦片、直饮水、外卖配送餐和学生午餐具有较高的检出率，主要为沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌、蜡样芽孢杆菌、铜绿假单胞菌和克罗诺杆菌等病原体的污染。
为了保证东营市食品安全，应当加强食品监管，保证食品的安全性。
关键词：食品风险；微生物；东营市Analysis of Microbiological Testing Results for Food Risks inDongying in 2022GENG Ying, SUN Zongyong*, LI Xinxin, LIU Ganlin, WANG Huiqing, WANG Nianjie(Dongying Centre for Disease Control and Prevention, Dongying 257000, China) Abstract: Objective: To investigate the current status of microbial contamination of food risks in Dongying in 2022. Method: Random samples were taken from supermarkets, retail shops, farmers’ markets, online shopping, wholesale markets, restaurants, collective canteens, fast food restaurants, snack bars, and street stalls in all counties of Dongying , and microbiological tests were conducted on the sampled foods. These included Salmonella, Listeria monocytogenes, Vibrio parahaemolyticus, Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa, and Cronobacter. Result: A total of 270 samples were collected from 12 food groups in 2022, with a total detection rate of 9.3%. Among them, three strains of Salmonella, three strains of Listeria monocytogenes, three strains of Vibrio parahaemolyticus, eight strains of Bacillus cereus, two strains of Pseudomonas aeruginosa and six strains of Cronobacter were detected. The detection rates were 20.0%, 15.0%, 15.9%, 10.0%, 18.8% and 13.3% in raw poultry meat, ready-to-eat raw animal aquatic products (seafood and freshwater products), ready-to-eat baked cereals, drinking water, takeaway meals and school lunches, respectively. Conclusion: Raw poultry meat, ready-to-eat raw animal aquatic products (seafood and freshwater products), ready-to-eat baked cereals, drinking water, takeaway and delivery meals, and student lunches had high detection rates, with the main contaminants being Salmonella, Listeria monocytogenes, Vibrio parahaemolyticus, Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa, and Cronobacter. In order to ensure food safety in Dongying city, food supervision should be strengthened to ensure food safety.Keywords: food risk; microorganisms; Dongying city作者简介：耿营（1987—），女，山东东营人，本科，主管技师。
PCR技术结合试纸条法快速检测乳粉中的克鲁诺杆菌
婴幼儿配方粉中克罗诺杆菌属菌株检测方法研究进展
婴幼儿配方粉中克罗诺杆菌属菌株检测方法研究进展陈万义;任婧;刘振民;郭本恒【期刊名称】《乳业科学与技术》【年(卷),期】2015(000)002【摘要】2008年，阪崎肠杆菌（Enterobacter sakazakii）被重新命名并被划分成一个新的属即克罗诺杆菌属（Cronobacter spp.），是人和动物肠道内寄生的一种革兰氏阴性无芽孢杆菌，也是一种重要的食源性条件致病菌。
2012年，克罗诺杆菌属被进一步重新分类并包括7个种。
该属菌株能引起严重的新生儿脑膜炎、坏死性小肠结肠炎和菌血症，严重的可引起神经系统后遗症和死亡。
目前，国内外的多篇报道证明婴儿配方粉是其主要的传染源和传播媒介。
因此，准确和快速鉴定克罗诺杆菌属菌株是预防和控制该病原菌的重要举措。
本综述简要介绍了截止目前克罗诺杆菌属菌株的主要检测方法，期望能为我国检测机构提供一定的借鉴和帮助。
【总页数】6页(P23-28)【作者】陈万义;任婧;刘振民;郭本恒【作者单位】光明乳业股份有限公司光明乳业研究院，乳业生物技术国家重点实验室，上海 200436;光明乳业股份有限公司光明乳业研究院，乳业生物技术国家重点实验室，上海 200436;光明乳业股份有限公司光明乳业研究院，乳业生物技术国家重点实验室，上海 200436;光明乳业股份有限公司光明乳业研究院，乳业生物技术国家重点实验室，上海 200436【正文语种】中文【中图分类】Q93【相关文献】1.阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属）分子检测方法研究进展 [J], 王翔;祝长青;徐幸莲;周光宏2.婴儿配方粉中克罗诺杆菌属菌株的分子溯源技术 [J], 陈万义;刘振民;任婧3.多位点序列分析方法在克罗诺杆菌属菌株溯源分析上的应用 [J], 闫瑞; 杨捷琳; 陈翠玲; 钮冰; 徐之雯; 蒋原4.江西省婴儿配方羊乳粉生产加工过程肠杆菌科和克罗诺杆菌属污染情况调查 [J], 揭琴丰; 李露敏; 邱伟华; 周厚德5.婴幼儿配方粉中克罗诺杆菌检测方法研究进展 [J], 王倩宁; 刘艳梅; 王弋博; 王廷璞因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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成年人感染克罗诺杆菌病例
1982年Gimenez报道1名76岁老人感染克罗诺杆菌引起尿脓血症
1985年Pribyl从1名糖尿病患者足部溃疡部分分离出克罗诺杆菌 1991年Hawkins报道了1例克罗诺杆菌引起的成人菌血症
2001年Lai报道了马萨诸塞州立大学医学中心1995年~1996年4例成人 感染克罗诺杆菌，其中3名死亡
克罗诺杆菌属的易感人群
新生儿（低出生体重等免疫力低下） 早产儿 老年人 免疫功能低下的成年人
新生儿感染克罗诺杆菌病例
1961年Franklin首次报道了2例新生儿感染克罗诺杆菌导致脑膜炎并死亡 1965年丹麦报道了1例新生儿感染克罗诺杆菌引发脑膜炎 1979年Monroe报道了1例新生儿感染克罗诺杆菌引发菌血症 1981年美国印第安纳州1名婴儿感染克罗诺杆菌引发脑膜炎 1983年Muytjens报道了8例婴儿感染克罗诺杆菌引发脑膜炎，6例死亡 1984年Arseni报道了12例早产儿感染克罗诺杆菌引发菌血症,4例死亡 1985年Naqvi报道了1例婴儿感染克罗诺杆菌 1990年Clark报道了2起不相关的院内暴发的新生儿克罗诺氏菌感染事件 1994年法国爆发克罗诺杆菌感染，17例新生儿中8例无临床症状、7例坏死性结肠炎、1例脑膜炎、 1例败血症，共3例死亡 2001年4月美国田纳西州发生克罗诺氏菌感染事件 2001年比利时一家医院报道1例新生儿感染克罗诺杆菌引发坏死性小肠结肠炎 2002年耶路撒冷一家医院发生了1例克罗诺杆菌感染事件 2004年法国发生婴幼儿感染克罗诺杆菌，9例病例中2例死亡 2006年美国新生儿感染克罗诺杆菌的比率为8.7/100 000 2010年日本报道了1例克罗诺杆菌导致的新生儿死亡 WHO统计1961-2008年共有120例0-3岁感染克罗诺杆菌的病例，目前国内克罗诺杆菌临床感染病例罕 见报道，与我们监测覆盖不够全面有很大关系。
食品中克罗诺杆菌属（ Cronobacter, 原阪崎肠杆菌）检测
国家食品安全风险评估中心 甘 辛
命名演变
产黄色素阴沟肠杆菌
Yellow-pigmented E. cloacae
1980
阪崎肠杆菌 Enterobacter sakazakii
2007
克罗诺杆菌属 Cronobacter spp.
分类变化
2002年Dennison从1名64岁的外周血管病患者的伤口分离了克罗诺 杆菌 2002年Ongradi报道了1名26岁女性感染克罗诺杆菌
临床表现
新生儿： 脑膜炎、坏死性小肠结肠炎和菌血症 死亡率高达40%—80% 长期的并发症包括迟发型神经发育、脑积水和永久性 的神经损伤等 成年人： 脑卒中、骨髓炎、腹泻、急性胆囊炎、伤口感染以及 脓样伴随有导尿管留臵和尿路感染患者出现脓毒症、 结膜炎和吸入性肺炎
克罗诺杆菌ens检测了35个国家的141种婴儿配方粉，其中13个国家的 20种抽检样品中分离到克罗诺杆菌，占全部样品的14.2%。 2001年4月美国田纳西州发生克罗诺氏菌感染来自于婴幼儿配方粉。 2004年Iversen等调查了82个婴幼儿配方乳粉和404个其他的食品中存在 克罗诺氏菌、沙门氏菌和其他肠杆菌的情况，结果发现在婴幼儿配方乳 粉、干婴儿食品、奶粉、干酪和其他产品中，克罗诺杆菌检出率分别为 2.4%、10.2%、4.1%、和3.2% 2002年香港食物环境卫生署从德国美乐宝HN25奶油粉检出克罗诺杆菌 2002年美国FDA从费蒙特工厂生产的婴幼儿配方粉中检出克罗诺杆菌
从TSA平板上挑取菌落接种生化鉴定培养基（国标采用生化培养 基），保证无杂菌生长后可以将菌落制备为0.5-0.62个麦氏浓度的 菌悬液后滴加，也可以直接穿刺接种，设臵阳性对照。
API 20E和VITEK 2 GN鉴定卡： 目前这两种生化条已在国内外得到广泛应用，在BAM 中也收录作为克罗诺杆菌属鉴定的方法。
＋
－ ＋ ＋ ＋ － ＋ －
(＋)
(－ ) － v v － － (＋ )
＋
－ － ＋ － － ＋ －
注：＋ ：90-100％；(＋) ：75-89%； V ：25-74％；(－)：10 -24％；－ ：0-9％
分布及致病性
我国对婴幼儿食品中该菌的规定
乳品安全标准（报批稿） 婴儿配方食品 特殊医学用途配方食品 0-6个月龄
阪崎克罗诺杆菌（C.sakazakii） 丙二酸盐克罗诺杆菌（C.malonaticus） 苏黎世克罗诺杆菌（C.turicensis） 莫金斯克罗诺杆菌（C.muytjensii） 克罗诺杆菌基因种1（C.genomospecies 1） 都柏林克罗诺杆菌（C.dublinensis） 都柏林亚种（C.dublinensis subsp.dublinensis） 洛桑亚种（ C.dublinensis usannensis） 奶粉亚种（ C.dublinensis ctaridi）
四、快检方法
PCR法和荧光PCR法： 1、从液体增菌肉汤中提取DNA：目前美国USFDA BAM 2012年版方法和SN/T 1632.2-2013以及SN/T 1632.32013都是将增菌肉汤离心后直接提取DNA。该方法的 优点是可以快速提示克罗诺杆菌属阳性的样品，但 缺点因为PCR法无法区别死菌和活菌，因此可能出现 PCR结果阳性但无法分离出菌落的情况。
国内外检测方法
1、GB 4789.40-2010 食品卫生微生物学检验 阪崎肠杆菌检验
2、SN/T 1632-2013 中华人民共和国进出口商品检验行业标准 出口奶粉 中阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属）检验方法 —SN/T 1632.1-2013 分离与计数 —SN/T 1632.1-2013 PCR方法 —SN/T 1632.1-2013 荧光PCR方法 3、ISO/TS 22964 Milk and milk products—Detection of Enterobacter sakazakii 2006 4、USFDA Bacteriological Analytical Manual, Chapter 29:Cronobacter
选择性增菌
一、样品取样
将袋装奶粉用75%酒精棉球涂抹消毒袋口，无菌操作开
封取样，如使用剪刀和勺子需要提前高压灭菌。称取 100g，加入提前预热至45℃的BPW 900mL，振荡或拍 打使奶粉充分溶解和混匀。
左图：未混合
右图：混合后
二、前增菌和选择性增菌
1、将混匀后的样品36℃±1℃培养18h±2h。 2、将培养后的样品充分混匀，取1mL至10mL mLST-Vm肉汤中，混匀，44℃±0.5℃培养 24h±2h。
我国克罗诺杆菌污染情况
2004年，安徽阜阳发生劣质奶粉引发 “大头娃娃”事件，从87份阜阳劣质奶 粉样品中检测到11例克罗诺杆菌阳性产 品，污染率为12.6%。 2010-2011年各地疾控中心的食源性致病 菌监测报告中克罗诺杆菌属的检出情 况为，广西梧州市监测的175份食品中 检出率为5.26%，江苏宿迁市的891份样 品中检出率为2.6%，甘肃定西市对321 份市售食品监测中检出率为0.31%，湖 南长沙市监测的286份食品中检出率为 6.3%。 2013年董晓晖等对300份奶粉和50份非 奶粉食品中克罗诺杆菌属进行定量检 测，检出率达到6.6%，23个污染样品中 有4个样品的菌量大于100 MPN/100g。
克罗诺杆 菌属 －
阴沟 肠杆菌 －
产气 肠杆菌 ＋
成团 肠杆菌 －
日勾维 肠杆菌 ＋
精氨酸双水解酶
鸟氨酸脱羧酶 KCN生长 发酵:
＋
＋ ＋
＋
＋ ＋
－
＋ ＋
－
－ v
－
＋ ＋
蔗糖
卫矛醇 核糖醇 棉子糖 D-山梨醇 χ-甲基-葡萄糖甙 D-阿拉伯糖醇 黄色素
＋
－ － ＋ － ＋ － ＋
＋
(－ ) (－ ) ＋ ＋ (＋ ) (－ ) －
GB4789.40-2010
第一法：阪崎肠杆菌的检验 第二法：阪崎肠杆菌的计数
第一法 阪崎肠杆菌的检验
检验程序
检样 100 g/mL+稀释液 900 mL 36℃±1℃，18 h±2h
1mL + mLST-Vm 10mL 44℃±0.5℃，24 h±2h
DFI琼脂 36℃±1℃，24 h±2h 挑取蓝绿色菌落 TSA 25℃±1℃，48 h±4h 挑取黄色菌落 生化鉴定 报 告 生 化 鉴 定 选择性分离 前 增 菌
阪崎克罗诺杆菌（C.sakazakii） 丙二酸盐克罗诺杆菌（C.malonaticus） 苏黎世克罗诺杆菌（C.turicensis） 莫金斯克罗诺杆菌（C.muytjensii）
尤尼沃斯克罗诺杆菌（C. universalis）
都柏林克罗诺杆菌（C.dublinensis） 都柏林亚种（C.dublinensis subsp.dublinensis） 洛桑亚种（ C.dublinensis usannensis）
API 20E反应编码 3345 373 3305 173 3305 363 3305 373
API 20E结果评价 Excellent identification Excellent identification Very good identification Good identification
2002年国际食品微生物标准委员会（(International Commission of Microbiological Specializations on Food， ICMSF）将阪崎肠杆菌列为“严重危害特定人群生命、 引起长期慢性实质性后遗症的一种致病菌”。 2004年世界粮农组织和WHO经过风险性评估将阪崎肠 杆菌和沙门氏菌共同列为婴幼儿配方粉A类致病菌。
1mL 100g 900mL 10mL
三、分离和鉴定
1、混匀mLST-Vm肉汤培养物，各取增菌液1环， 分别划线接种于两个DFI平板，36℃±1℃培养 24h±2h。 2、从DFI培养基上挑取1个~5个蓝绿色可疑菌落， 划线接种于TSA平板。25 ℃±1℃培养48h±4h。