高通量测序技术简介共31页文档
高通量测序技术简介
高通量测序技术简介
高通量测序技术又称“下一代”测序技术，以能一次并行对几十万到几 百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。目前用于微生物群 落多样性研究的高通量测序平台主要有来自罗氏公司的 454法、Illumina公 司Solexa法和 ABI 的 SOLiD 法
罗氏454法测序原理
GS FLX系统的测序原理是基于焦磷酸测序法，依靠生物发光对DNA序列进 行检测。在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下， GSFLX系统将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号释放偶联起来。通过 检测荧光信号释放的有无和强度，就可以达到实时测定DNA序列的目的。
罗氏454法测序流程
Solexa测序法测序流程
• 1.添加接头：利用物理方法将待测 样品DNA打碎，在单链DNA碎片两端 加上接头
• 表面结合：Solexa的测序时利用微注 射系统将已经加过接头和待测片断随 机添加到玻璃Flow Cell内，每一个 Flow Cell又补分成8条Lane，每条 Lane的内表面上能与共价键的形式随 机固定单链接头序列和带接头的单链 待测DNA片断
四种荧光标记的染料应用边合成边测序（ Sequencing By Synthesis ） 的原理，在每个循环过程里，荧光标记的核苷和聚合酶被加入到单分子阵列中。 互补的核苷和核苷酸片断的第一个碱基配对，通过酶加入到引物上。多余的核苷 被移走。这样每个单链 DNA 分子通过互补碱基的配对被延伸，利用生物发光蛋 白，比如萤火虫的荧光素酶，可通过碱基加到引物后端时所释放出的焦磷酸盐来 提供检测信号。针对每种碱基的特定波长的激光激发结合上的核苷的标记，这个 标记会释放出荧光。荧光信号被 CCD 采集，CCD 快速扫描整个阵列检测特定的 结合到每个片断上的碱基。通过上述的结合，检测可以重复几十个循环，这样就 有可能决定核苷酸片断中的几十个碱基。
高通量测序技术简介
数据转换
将采集到的图像数据转换为对应的碱基序列 信息。
质量控制
对转换后的数据进行质量评估和控制，以确 保测序结果的准确性和可靠性。
数据输出
将最终测序结果以FASTQ等格式输出，供后 续生物信息学分析使用。
03
高通量测序技术平台
Illumina平台
伦理规范制定
制定高通量测序技术应用的伦理规范，确保 技术的合理、安全使用。
法规监管和政策支持
加强高通量测序技术的法规监管和政策支持， 推动技术的健康发展。
THANKS
感谢观看
Genia Technologies平台
采用基于光学干涉的测序技术，通过检测DNA分子在光学干涉仪中的干涉信号变化实 现测序，具有高精度、高灵敏度等优势。
04
高通量测序技术在基因组学研究 中的应用
全基因组重测序
定义
全基因组重测序是对已知基因组 序列的物种进行不同个体的基因 组测序，并在个体或群体水平上 进行差异性分析的方法。
该技术能够在短时间内产生大量的序 列数据，为基因组学、转录组学、宏 基因组学等领域的研究提供了有力支 持。
发展历程及现状
第一代测序技术
以Sanger测序为代表，具有读长较长、准确性高的优点， 但通量低、成本高，难以满足大规模测序需求。
第二代测序技术
以Illumina公司的HiSeq系列、Life Technologies公司的 SOLiD系列等为代表，实现了高通量、低成本的目标，广泛应
高通量测序技术简介
• 引言 • 高通量测序技术原理 • 高通量测序技术平台 • 高通量测序技术在基因组学研究中
的应用
• 高通量测序技术在临床医学中的应 用
高通量测序技术简介
高通量测序技术简介近年来，随着生物技术的发展，高通量测序技术在生物学研究、临床医学、农业科技等众多领域中发挥着越来越重要的作用。
本文将为读者简单介绍高通量测序技术的基本原理、应用及未来发展方向。
一、高通量测序技术基本原理高通量测序技术（High-Throughput Sequencing，简称HTS）是指通过同时测序数以亿计上万条DNA片段的方法，快速准确地得出基因信息。
其核心技术包括样品制备、DNA片段库构建和测序。
样品制备主要包括DNA抽提、纯化和切割等步骤。
DNA片段库构建通常分为两种方式：文库构建（Library Preparation）和逆相PCR法（Inverse PCR）构建。
其中文库构建方法包括Genomic DNA文库构建、cDNA文库构建和ChIP-seq文库构建等。
测序分为Sanger测序和第二代/第三代测序两种。
目前，Illumina、Ion Torrent、PacBio和Nanopore等公司的测序技术已开始广泛应用。
二、高通量测序技术的应用高通量测序技术在生物领域中的应用越来越广泛。
具体应用包括以下几个方面：1、基因组学：基因组学是高通量测序技术最早应用的领域之一。
通过对整个基因组进行测序，可以深入研究基因的结构、组织与表达等方面的信息，促进基因组学的发展。
2、转录组学：高通量测序技术在转录组学中的应用主要为RNA测序，可以发现RNA剪切变异、可变外显子和SNPs （Single Nucleotide Polymorphisms）等。
3、表观基因组学：表观基因组学是研究基因组DNA序列和其组杂化状况的学科。
高通量测序技术可以对DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质状态等进行充分研究。
4、单细胞测序技术：在原有的基础上，在单细胞尺度上进行分析，可以识别不同类型的单细胞和细胞异质性在不同生理状态下的基因表达差异。
5、临床医学：高通量测序技术在临床上可以进行新生儿常染色体脆性综合征、癌症个性化治疗、基因疾病等多方面的风险评估。
高通量测序技术（NGS）
高通量测序技术（NGS）学习感悟：近来，看到了《高通量测序揭秘中药如何杀死癌细胞》的文章，什么是高通量测序？教材中只有PCR技术扩增技术知识，查找了一些资料，获得了肤浅的理论知识。
一、高通量测序技术简介高通量测序技术（High-throughput sequencing）又称“下一代”测序技术，以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。
实验过程：样本准备，文库构建，测序反应，数据分析。
（1）将目标DNA剪切为小片段（2）单个小片段DNA分子结合到固相表面（3）单分子独立扩增（4）每次只复制一个碱基（A,C,T,G）并检测信号（5）高分辨率的成像系统高通量测序以其高输出量与高解析度的特性，不仅为我们提供了丰富的遗传学信息，而且使得测序的费用和时间大大缩短。
在高通量测序发展的过程中，也有很多的问题需要我们去解决：数据在临床诊断上的作用，测序数据的储存和分析，数据的安全和信息隐私等。
二、测序行业技术发展概况自FrederickSanger提出双脱氧核苷酸末端终止法以来，测序技术已经历了近40年的发展，根据核心技术的区别与进步，可以分为三代：第一代测序技术——始于19771977年，Sanger提出了双脱氧核苷酸末端终止法，同年A.M.Maxam和W.Gilber也提出了化学酶解法，两者的提出标志着第一代测序技术的诞生。
第二代测序技术（NGS）——始于20052005年，开发出全球第一台商业化的第二代DNA测序仪GS20，拉开了基因产业发展的序幕。
之后数年NGS行业内经历了激烈的竞争，逐步形成较为稳定的格局：（1）LifeTechnologies于2013年被著名科研服务供应商ThermoFisher收购，SOLiD平台逐步淡出市场，主推2011和2012年陆续发布的Ion PGM和IonProton两款测序设备。
（2）Illumina则在全面接收Solexa的研发平台之后，开发出了著名的HiSeq平台系列。
高通量测序技术及其在生物医学研究中的应用
高通量测序技术及其在生物医学研究中的应用随着生命科学的迅速发展，高通量测序技术成为生物医学研究中一项重要的技术手段。
本文将对高通量测序技术进行介绍，并探讨其在生物医学研究中的应用。
1. 高通量测序技术的概述高通量测序技术（Next-Generation Sequencing，简称NGS）是指一种通过并行测序多个DNA片段的技术。
相比传统的Sanger测序方法，高通量测序技术具有高通量、高效率、低成本等诸多优势，已经成为当前最主流的测序技术。
2. 高通量测序技术的原理与流程高通量测序技术主要包括DNA/RNA样品准备、文库构建、测序和数据分析等步骤。
首先，将DNA/RNA样品进行提取、纯化和检测，然后将DNA/RNA片段构建成文库，接着进行高通量测序，最后根据测序读数进行数据分析和解读。
3. 高通量测序技术在基因组测序中的应用高通量测序技术在基因组测序方面的应用非常广泛。
通过对整个基因组的测序，可以快速获得个体的遗传信息，并帮助发现与遗传性疾病相关的突变位点。
同时，高通量测序技术还能够检测基因组中的结构变异、复杂遗传变异等，为研究人类疾病提供了重要的信息。
4. 高通量测序技术在转录组学研究中的应用转录组学研究是对特定组织或细胞中所有RNA分子进行测序和分析的过程。
高通量测序技术的高通量性质使之成为转录组学研究的理想工具。
通过分析转录组数据，可以深入了解基因的表达模式、调控机制及与疾病的关联。
此外，高通量测序还可以帮助发现新的非编码RNA和RNA修饰等重要生物信息。
5. 高通量测序技术在表观遗传学研究中的应用高通量测序技术广泛应用于表观遗传学研究领域。
通过对DNA甲基化和组蛋白修饰等的测序，可以深入了解这些表观遗传标记在基因调控、发育和疾病中的作用机制。
高通量测序技术还可以帮助鉴定表观遗传标记的组合模式，从而更好地理解表观遗传调控网络的复杂性。
6. 高通量测序技术在单细胞测序中的应用传统的测序技术通常需要大量的细胞来获得足够的DNA或RNA。
高通量测序技术简述
高通量测序技术简述高通量测序技术，也称二代测序技术、下一代测序技术（Next-Generation Sequencing，NGS）。
人类全基因组序列草图在2021年完成后，其他几种模式生物的基因组序列也被确定，这些实验基于Sanger DNA测序技术完成，但逐渐暴露出该技术耗时较长、反应数目有限的问题。
自2021年起，454焦磷酸测序技术（Roche公司，2021年）、Solexa聚合酶测序技术（Illumina公司，2021年）和Solid 连接酶测序技术（ABI公司，2021年）逐渐发展成熟，这三个技术拥有共同的突出特点是单次运行即可产出大量的序列数据，故统称为高通量测序技术（High-throughput sequencing）。
高通量测序技术的发展，为人类探索基因组奥秘提供了重要的序列信息。
近年来，该技术在动植物等领域都得到了广泛应用，包括基因组的测序，转录组的测序及小RNA的测序等，为多组学的发展提供了更多的思路和方案。
1 二代测序技术二代测序技术常用的测序平台是Illumina/Solexa，其工作原理是边合成边测序，在测序之前需要先对样品进行桥式扩增，以便得到更高的测序深度。
后续实验流程为：以桥式扩增后得到的单链DNA作为模板，添加带有保护基团与不同荧光标记基团的四种游离碱基，故每次反应只会添加一个碱基，并且可用通过成像系统采集荧光以确定添加碱基的类别。
该次反应结束后，洗去游离碱基，并通过化学试剂移除保护基团，使荧光标记失活，以进行下一次反应测定下一位碱基。
该技术初期只能读取较短的序列（20-30bp），但随着技术不断地改进，现已可读取100bp以上，并且双端测序（Paired End，PE）也普遍应用，双端测序得到的读长是单端的两倍，测序深度也在不断地增加。
1.1 DNase-seq技术在过去的25年里，传统的Southern印迹方法已鉴定出数百个DNase I 的高敏感位点（DHS，指位于核小体之间且可以被DNase I 切割的位点），并发现它们与许多活性调控元件相关，包括启动子、增强子、沉默子、绝缘子以及其他基因组调控区域，这使得DNase I 高敏感位点的检测成为鉴定基因调控元件的理想方式。
高通量测序技术及其在农业上的应用详解演示文稿
• 1977年Sanger等发明的双脱氧核苷酸末端终止法和 Gilbert等发明的化学降解法，标志着第一代测序技术的诞生 。
• 尽管第一代测序技术已经帮助人们完成了从噬菌体基因组到 人类基因组草图等大量的测序工作，但由于其存在成本高、 速度慢等方面的不足，并不是最理想的测序方法。经过不断 的开发和测试，进入21世纪后，以Roche公司的454技术 、Illumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术 为标志的第二代测序技术诞生了。
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SOLiD 的特点与主要应用
• 读长较短，50-75bp • 精度高，可达Q40 • 通量高， 20-30G每天，1Run 可达120G • 主要应用：基因组重测序、SNP检测等
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三种平台的技术差异
平台 PCR 测序载体 测序方式
结果序列
454 磁珠乳化PCR 磁珠 焦磷酸、荧光
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1.2 为什么要发展高通量测序技术
• 快速和准确地获取生物体的遗传信息对于生命科学研究一直 具有十分重要的意义。对于每个生物体来说，基因组包含了 整个生物体的遗传信息。测序技术能够真实地反映基因组 DNA上的遗传信息，进而比较全面地揭示基因组的复杂性 和多样性，因而在生命科学研究中扮演了十分重要的角色。
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3.1 全基因组重测序
全基因组重测序是对已知基因组序列的物种进行不 同个体的基因组测序，并在此基础上对个体或群体进行差 异性分析。全基因组重测序的个体，通过序列比对，可以 找到大量的单核苷酸多态性位点( SNP) 、插入缺失位点( InDel，Insertion/Deletion) 、结 构 变 异 位 点( SV ，Structure Variation) ， 通过生物信息学手段，分析 不同个体基因组间的结构差异，同时完成注释。
高通量测序
百泰派克生物科技
高通量测序
高通量测序技术，又称为二代测序技术（Next Generation Sequencing, NGS）是
在一代测序技术上发展而来的新一代测序技术。
高通量测序技术克服了一代测序技术通量低、成本高的缺点，使同时分析几十万到几百万条序列成为现实，在大幅度提高通量的同时，保证了测序结果的准确性，降低了测序成本。
高通量测序技术的问世使得我们能快速、细致、全面、深入的分析一个物种的基因组和转录组序列，揭开这些遗传物质的神秘面纱。
随着高通量测序技术的发展，不同公司相继开发了不同的测序平台，如Roche公司的454测序平台、Illumina公司的Solex测序平台以及ABI公司的Solid平台等。
高通量测序平台在测序通量以及速度上有着显著的优势，使其成为当前基因组以及转录组测序的首选技术。
百泰派克生物科技基于Illumina高通量测序平台提供高效快速的转录组高通量测
序服务，可在单核苷酸水平上检测任何物种的整体转录水平，在分析转录本的结构和表达水平的同时，还可以发现未知的转录本和稀有的转录本，并能准确识别可变剪切位点和编码序列单核苷酸多态性（cSNP），从而提供最全面的转录组信息，欢
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Reversible Terminator Chemistry 可逆终止反应
• All 4 labelled nucleotides in 1 reaction
O HN
ON
PPP
O
cleavage site fluor
O
X
5’
HN
DNA O N
O
O
3’
block
Incorporation Detection Deblock; fluor removal
Methy-seq（1）： 肿瘤和MCF7细胞系中 BRCA!启动子区域的甲基化差异
Methy-seq（2）：
Some highlights:
Correlation between ChIP-Seq and his prior SAGE-like method (called GMAT) has r=0.906
Digital expression profiling & microRNA re-sequencing：
hESC： human embryonic stem cells EB： embryoid bodies
ChIP-seq（1）： 人一号染色体DNA-蛋白相互作用
ChIP-seq（2）：
Cycle 2-n: Add sequencing reagents and repeat
1、每轮测序反应加入四种带有荧光标记的dNTP，末端带有可 以被去除的阻断基团 2、每轮反应只能整合一个核苷酸，仪器读取相应的荧光信号 3、信号读取结束，用化学方法去除阻断基团，进行下一轮测序 反应
Base calling from the raw data T G C TAC GAT …
UBB Ubiquitin B RING1 Ring finger protein 1 DIRAS2 DIRAS family, GTP-binding RAS-like 2 PHF20 PHD finger protein 20
IGJ Immunoglobulin J polypeptide FN1 Fibronectin 1 NFIX Nuclear factor I/X (CCAAT-binding transcription factor) TOP2A Topoisomerase (DNA) II alpha 170kDa KRT8 Keratin 8 ITGB7 Integrin, beta 7 BASP1 Brain abundant, membrane attached signal protein 1 DRD1IP Dopamine receptor D1 interacting protein GFAP Glial fibrillary acidic protein APLP2 Amyloid beta (A4) precursor-like protein 2
novo sequencing 拼接带来困难
SOLiD sequencing
• 每个碱基读取两次非常高的准确性，特别是对于SNP的检测 • 灵活的系统，完善的磁珠编码系统，可以进行样品的pooling，分割测序区域 • 读取长度受连接反应的轮数限制，给de novo sequencing 拼接带来困难
emulsion
Adapter complement
Micro-reactors
Enrich
Anneal Seq primer
“Break micro-reactors” Isolate DNA containing beads
Perform emulsion PCR
Generation of millions of clonally amplified templates on each bead No cloning and colony picking
高通量测序的应用
• De novo 测序 • 基因深度测序（genome re-sequencing） • 转录组深度测序（transcriptome re-sequencing） • Digital expression profiling • ChIP-seq • Methy-seq
Transcriptome resequencing：
Sequence 利用探针的连接反应读取模板的DNA序列
1024种8碱基探针 4色荧光，4种双核苷酸，每色荧光有256个探针(4^6)
连接法测序 （一）
测序引物与adapter退火
探针连接，检测荧光 切除荧光基团
第二轮探针连接，检测荧光 切除荧光基团
malignant pleural mesotheliomas (MPMs) ：恶性胸膜间皮瘤 pulmonary adenocarcinoma (ADCA)：肺腺癌
Transcriptome characteristics
Solid line： at least one read Dashed line：at least 20 reads
Sequenced short reads (typically 25–50 bp) from ChIP-Seq experiments are first mapped onto the reference genome. The mapped reads are then used to estimate statistical parameters, which include the estimation of the average length F of sequenced DNA fragments.
每个探针进行检测的两个碱基后面有三个匹配碱基，因此一条测序引物读取的序列是不完整的
连接法测序 （二）
测序引物沿着Adapter移动5次，确保每个位点都被检测
连接法测序 （三）
0位置是Adapter的最后一个碱基，因此只检测一次， 该碱基是进行解码所必须的。
Advantage & disadvantage
SNV： Single Nucleotide Substitution Variant
Digital expression profiling（1）： 人大脑组织与UHR（Universal Human Reference）的表达差异
Tag Sequence GATCAAACCAAGGCCCAGGC GATCACTGTTAATGATTTGC GATCAGTGTCTTTTCAGCAC GATCATCATGACCAATGAAA GATCATGCTGGCTGCAAAGA GATCCAAACCCAAGTCTTGA GATCCAAGATAAAGAAGGCA GATCCCAGACTGGTTCTTGA GATCCCCAATTGACTCAGAG GATCCGGGGCTGCAGGCTTG GATCCTACAGAAGTGGAGCT GATCCTAGTAATTGCCTAGA GATCCTGCGGGAGTCTCCCG GATCCTGTGAAGGCCTGGAA GATCGAGACACGTGATGGGA GATCGAGGACAGTGCAACCA GATCTCAATGCCAATCCTCC GATCTGCACGCCGCTGACCC GATCTGTGCCCAGAGATGGG GATCTGTGGAGAATGTACAC
Prepare DNA fragments
Clonal Single Molecule Arrays 单分子克隆 Attach single molecules to surface
Amplify to form clusters
Ligate adapters
20 microns
Sequence
~1000 molecules per ~ 1 µm cluster ~1000 clusters per 100 µm square ~40 million clusters per experiment
Brain
118 162 85 73 91 48 266 217 91 10
0 46 41 0 8 0 240 51 716 132
UHR
861 163 35
0 96 0 271 1538 0 10 113 799 12 42 346 59 81 0 0 69
Symbol Gene Description
Expression difference between MPM and ADCA sample compare to a lung tissue control
Analysis of percentage of reads containing known coding region SNVs in the six tissue samples.
RPL29 Ribosomal protein L29 PRDX2 Peroxiredoxin 2 PFN2 Profilin 2 STMN4 Stathmin-like 4 COX5B Cytochrome c oxidase subunit Vb GABRA1 Gamma-aminobutyric acid (GABA) A receptor, alpha 1
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6
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TTTTTTTGT…
The identity of each base of a cluster is read off from sequential images 根据每个点每轮反应读取的荧光信号序列，转换成相 应的DNA序列
Solexa 测序 Workflow
ABI SOLiD 连接法测序
454 sequencing： Emulsion PCR (emPCR)
A
+ PCR Reagents
B
Adapter carrying library DNA