流式细胞术检测T细胞亚群概要
细胞亚群检测实验报告
1. 了解淋巴细胞亚群检测的基本原理和方法。
2. 掌握流式细胞术在淋巴细胞亚群检测中的应用。
3. 分析实验结果，了解淋巴细胞亚群在免疫调节中的作用。
二、实验原理淋巴细胞亚群检测是利用流式细胞术对淋巴细胞进行分类、计数和功能分析的一种技术。
通过特异性抗体标记，检测淋巴细胞表面标志物，实现对不同亚群的识别。
本实验主要检测T细胞、B细胞和NK细胞亚群。
三、实验材料1. 实验试剂：抗CD3、抗CD4、抗CD8、抗CD19、抗CD16、抗CD56单克隆抗体。
2. 实验仪器：流式细胞仪、细胞培养箱、离心机、移液器等。
3. 实验样本：新鲜血液。
四、实验步骤1. 样本采集：采集受试者新鲜血液，分离外周血单个核细胞（PBMCs）。
2. 抗体标记：将分离的PBMCs与抗CD3、抗CD4、抗CD8、抗CD19、抗CD16、抗CD56单克隆抗体混合，室温孵育30分钟。
3. 洗涤：将标记好的细胞用磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）洗涤两次。
4. 流式细胞术检测：将洗涤后的细胞上流式细胞仪，进行检测和分析。
5. 数据分析：使用流式细胞术分析软件对实验数据进行处理，计算各亚群细胞比例。
五、实验结果1. T细胞亚群：CD3+T细胞占外周血淋巴细胞的50-70%，其中CD4+T细胞占CD3+T 细胞的30-45%，CD8+T细胞占CD3+T细胞的30-45%。
2. B细胞亚群：CD19+B细胞占外周血淋巴细胞的10-20%。
3. NK细胞亚群：CD16+/CD56+细胞占外周血淋巴细胞的5-15%。
1. 实验结果表明，本实验成功检测了T细胞、B细胞和NK细胞亚群，验证了流式细胞术在淋巴细胞亚群检测中的应用价值。
2. 淋巴细胞亚群在免疫调节中发挥重要作用。
CD4+T细胞具有辅助功能，参与细胞免疫和体液免疫；CD8+T细胞具有杀伤功能，直接杀伤病毒感染细胞和肿瘤细胞；B细胞产生抗体，参与体液免疫；NK细胞具有天然杀伤功能，对病毒感染细胞和肿瘤细胞具有杀伤作用。
流式细胞术检测人和小鼠Th细胞亚群
流式细胞术检测人和小鼠Th细胞亚群早在1986年Mosmann等[1]依据小鼠分泌的细胞因子谱不同首次将Th细胞分为Th1和Th2两个功能不同的独立亚群。
Th1细胞主要分泌IL-2、、IL-12、IFN-γ和TNF- α等细胞因子，介导与细胞毒和局部炎症有关的免疫应答，参与细胞免疫及迟发型超敏反应。
Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL13等细胞因子，其主要功能为刺激B细胞增殖并产生抗体，与体液免疫相关。
由于Th1/Th2 亚群及其相互之间的平衡在免疫应答的调节中起着关键的作用，Th1/Th2 平衡的失调与多种疾病的发生发展和预后有着密切的关系。
目前已发现许多感染性疾病、自身免疫性疾病、过敏性疾病以及移植排斥反应等都与Th1/Th2 平衡有关。
因此建立稳定有效的细胞内因子检测方法对于准确说明Th1/Th2细胞的作用非常重要。
目前检测的主要方法有酶联免疫法、ELISPOT法、荧光定量法及原位杂交等方法。
流式细胞术检测细胞内因子是一种相对快速、重复性好并能准确定量的方法。
我们参照国内外的一些文献，对于人和小鼠Th1和Th2细胞的流式检测方法进行了探索，并比较了两者之间的不同。
由于未活化的淋巴细胞所分泌的细胞因子极少，用流式细胞仪很难检测出来，因此在检测前需刺激活化。
目前国内外推荐的刺激物主要为PMA （佛波酯）和离子霉素（Ionomycin）。
淋巴细胞在刺激物的作用下活化，分泌细胞因子到细胞外。
由于流式细胞仪只能对细胞表面或内部的抗原进行检测，因此必须阻止细胞因子的分泌。
抑制细胞因子分泌的试剂为Brefedlin A 或莫能霉素（Monensin）。
Th1/Th2 细胞首先是CD4+ T 淋巴细胞。
因此如何确定CD4+ T淋巴细胞非常重要，我们主要围绕该问题进行探讨。
材料与方法试剂PMA（Sigma）贮存液：PMA 溶于DMSO 浓度为0.1mg/ml -20℃保存。
工作液：贮存液1:100 稀释于RPMI 1640培养基中，此时为1µg/ml。
简述免疫细胞亚群及其流式细胞检测分子标志
一、概述免疫细胞是机体抵抗外界侵入的重要组成部分，通过识别和消灭病原体和异常细胞来维护机体内稳衡。
免疫细胞亚裙指的是免疫细胞的不同类型和功能亚裙，包括T细胞亚裙、B细胞亚裙、自然杀伤细胞、抗原呈递细胞等。
流式细胞检测是一种用于分析细胞表面和内部分子的技术手段，通过标记特定的细胞分子，可以帮助科研人员了解免疫细胞亚裙的表达情况，从而深入研究其在免疫调节和疾病发生发展中的作用。
二、T细胞亚裙及其分子标志1. 辅助T细胞（Th细胞）辅助T细胞是免疫应答的重要调节者，根据其分泌的细胞因子不同可分为Th1、Th2、Th17和Treg等亚裙。
流式细胞检测常用的分子标志包括CD4、IFN-γ、IL-4、IL-17和Foxp3等，通过检测这些标志物可以对不同类型的辅助T细胞进行定量和质量分析。
2. 细胞毒T细胞（Tc细胞）细胞毒T细胞主要起到直接杀伤感染细胞和肿瘤细胞的作用，其分子标志包括CD8、Perforin、Granzyme B等。
通过流式细胞检测可以准确检测细胞毒T细胞的活性和数量。
三、B细胞亚裙及其分子标志B细胞是体液免疫应答的主要执行细胞，根据其分泌的抗体类型和功能可分为不同的亚裙。
流式细胞检测常用的分子标志包括CD19、CD20、CD27、IgG、IgM等，通过检测这些标志物可以分析B细胞的活化、分化和功能状态。
四、自然杀伤细胞及其分子标志自然杀伤细胞是一类重要的淋巴细胞，主要起到对病毒感染和肿瘤细胞的直接杀伤作用。
流式细胞检测常用的分子标志包括CD56、NKG2D、Perforin、Granzyme等，通过检测这些标志物可以分析自然杀伤细胞的活性和数量。
五、抗原呈递细胞及其分子标志抗原呈递细胞主要包括树突状细胞、巨噬细胞和B细胞等，其在免疫应答中起到识别和捕获抗原、激活T细胞和B细胞的作用。
流式细胞检测常用的分子标志包括CD11c、CD11b、MHC-II、CD86等，通过检测这些标志物可以分析抗原呈递细胞的数量和功能状态。
t淋巴细胞亚群测定检测内容
t淋巴细胞亚群测定检测内容
淋巴细胞亚群检测主要包括以下内容：
1. T细胞亚群测定：T细胞是淋巴细胞中的一类重要的免疫细胞，根据表面标志物的不同，可以将其分为多个亚群。
常见的T细胞亚群包括CD4+ T细胞和CD8+ T细胞，它们在免疫调节和杀伤病原体方面起着重要作用。
2. B细胞细胞亚群测定：B细胞是淋巴细胞中的另一类免疫细胞，可以分泌抗体并参与体液免疫反应。
B细胞亚群测定可以确定不同类型的B细胞数量及功能状态。
3. 自然杀伤细胞（NK细胞）测定：NK细胞是淋巴细胞中的一类重要细胞，具有自然杀伤、分泌细胞因子等免疫功能。
NK细胞亚群测定可以了解NK细胞数量和杀伤活性。
4. 调节性T细胞（Treg细胞）测定：Treg细胞是T细胞中的一种特殊亚群，具有免疫抑制和免疫调节功能。
Treg细胞测定可以评估免疫调节的状态。
这些淋巴细胞亚群测定可以通过流式细胞术（Flow Cytometry）等实验方法进行。
这些检测内容可以帮助评估患者的免疫功能状态、了解免疫细胞亚群的数量及活性，对于诊断和治疗免疫相关疾病具有重要意义。
流式细胞术对食管癌、贲门癌患者T细胞亚群的分析
流式细胞术对食管癌、贲门癌患者T细胞亚群的分析【摘要】目的采用流式细胞术方法检测食管癌、贲门癌患者细胞免疫功能。
方法应用三色免疫荧光流式细胞仪测定145名食管癌和贲门癌患者及18例正常对照者外周血T细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+、NK细胞、CD4+/CD8+比值。
结合临床病理结果探讨二者之间的关系。
结果(1)食管癌、贲门癌患者外周血中CD8+T淋巴细胞比例较正常对照组明显升高（P＝）；CD3+、CD4+亚群较正常值降低，但是没有统计学差异。
NK细胞两组比较也没有显著性差异；(2)早期（0、Ⅰ期）食管癌、贲门癌病人和健康对照组之间T细胞各亚群相比没有统计学差异；中、晚期（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期）食管癌、贲门癌病人和健康对照组相比：CD4+明显降低（P ＝）；CD8+则明显升高（P＝）；CD4+/CD8+较正常有所下降，但是没有显著性差异；淋巴结阴性患者和淋巴结阳性患者比较T细胞各亚群没有明显差异。
结论外周血T细胞亚群的检测有助于提高对食管癌患者的病情，临床分期以及机体免疫状态的判断，晚期食管癌患者机体免疫状态成紊乱型改变。
【关键词】食管癌贲门癌T细胞亚群流式细胞术临床分期0引言恶性肿瘤患者往往伴有机体免疫机能低下和紊乱，免疫机能低下和紊乱对肿瘤发生发展起到一定的作用。
流式细胞术分析T细胞亚群具有快速、多参数、可定量、操作简便等优点，国外已有较多报道。
食管癌、贲门癌患者的机体免疫状态尤其是细胞免疫状态国内已有报道，但所用研究方法多为传统的免疫细胞学方法。
本研究通过三色免疫荧光流式细胞术分析145名食管癌、贲门癌患者外周血T细胞亚群，并结合临床病理分期，分析食管癌、贲门癌患者细胞免疫状态的改变及其临床意义。
1资料和方法资料和方法收集20XX年6月～20XX年8月在我科住院治疗的145名食管癌及贲门癌患者，所有病例抽血化验前均未行放、化治疗，并均经胃镜活检证实诊断。
年龄29～85岁，男性105名，女性40名，平均年龄岁。
流式细胞术检测初治活动性肺结核患者血清T淋巴细胞亚群计数分析
的阳性富集法，Ｃｙｔｔｅｌ检测法可以有效避免上皮 －间充 ［５］ ［美］莱斯利·索宾，［加］玛丽·高斯伯德罗维兹，［德］克里斯坦
质转化对上皮细胞黏附分子的影响，提高 ＣＴＣｓ的鉴定 率［１３］。
在本研究中，胃癌患者的 ＣＴＣｓ阳性率为 ６７．６９％， 与其他相关文献 报 ［７－１０，１２］ 道一致。与胃良性疾病患者 （８．００％）相比，胃癌患者的 ＣＴＣｓ阳性率（６７．６９％）显
征关系的初步研究［Ｊ］．医院与医学，２０１６，４（１）：７３－７６． ［９］ ＫｒｅｂｓＭＧ，ＳｌｏａｎｅＲ，ＰｒｉｅｓｔＬ，ｅｔａｌ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎａｎｄｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃｓｉｇｎｉｆｉ
ｃａｎｃｅｏｆｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓｉｎｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｎｏｎｓｍａｌｌ－ｃｅｌｌ－ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．ＪＣｌｉｎＯｎｃｏｌ，２０１１，２９（１２）：１５５６－１５６３．
著高于前者，表明 ＣＴＣｓ在胃癌早期诊断中具有参考意 义。另外，本研究发现，胃癌患者的 ＣＴＣｓ在不同性别、 年龄、肿瘤分期、分化程度、淋巴转移与否患者之间差异 均无统 计 学 意 义 （Ｐ ＞０．０５），但 与 ＣＥＡ、ＣＡ１９－９、 ＣＡ７２－４、脉管侵犯差异均有统计学意义（Ｐ ＜０．０５），
关系［Ｊ］．潍坊医学院学报，２０１６，３８（１）：７３－７５． ［８］ 郭迎雪，李贵新，李方超，等．胃癌患者体循环肿瘤细胞与临床特
具有积极价值。
参考文献
［１］ 狄剑士，郑桂丽，李梦岩，等．胃癌根治术后患者血循环肿瘤细胞 的检测及其意义［Ｊ］．实用医药杂志，２０１６，３３（３）：２４３－２４４．
【学前教育】小鼠t 细胞亚分群流式
小鼠t 细胞亚分群流式1️⃣ 引言：T细胞亚群的重要性在免疫学研究中，T细胞作为适应性免疫应答的核心组成部分，其亚群的精确识别与功能分析对于理解免疫机制、疾病发生发展及免疫治疗策略的制定至关重要。
小鼠作为生物医学研究的经典模型动物，其T细胞亚群的研究对于人类疾病的模拟与治疗具有不可替代的价值。
流式细胞术（Flow Cytometry）作为一种高效、多参数的细胞分析技术，已成为研究小鼠T细胞亚群不可或缺的工具。
2️⃣ 小鼠T细胞亚群概述小鼠T细胞主要分为两大类：CD4+ T细胞和CD8+ T细胞。
这两类T细胞进一步细分为多个功能亚群，如辅助性T细胞（Th1、Th2、Th17）、调节性T细胞（Treg）、细胞毒性T细胞（CTL）以及记忆T细胞等。
这些亚群在免疫应答中扮演着不同的角色，如促进炎症反应、维持免疫稳态、抑制过度免疫等。
CD4+ T细胞：主要负责辅助B细胞产生抗体，同时也可直接参与细胞免疫应答，包括Th1（介导细胞毒性免疫应答）、Th2（介导体液免疫应答）、Th17（介导炎症反应）及Treg（调节免疫应答，维持免疫稳态）等亚群。
CD8+ T细胞：主要为细胞毒性T细胞（CTL），负责识别并直接杀伤被感染的细胞或肿瘤细胞。
3️⃣ 流式细胞术在小鼠T细胞亚群分析中的应用流式细胞术通过标记特异性抗体，对细胞表面的抗原或细胞内的分子进行标记，利用激光散射和荧光检测原理，实现对细胞的多参数同时分析。
在小鼠T细胞亚群分析中，流式细胞术具有以下优势：高通量：可同时分析大量细胞样本，提高检测效率。
多参数：可同时检测多种细胞表面标记和细胞内分子，为T细胞亚群的精细划分提供依据。
敏感性高：能够检测到极低浓度的细胞亚群，有助于发现稀有亚群或早期免疫应答。
具体操作步骤包括：样本准备：采集小鼠外周血、脾脏或淋巴结等组织，通过研磨、裂解红细胞等步骤制备单细胞悬液。
抗体标记：根据研究目的选择合适的抗体组合，对细胞进行标记。
流式检测T细胞亚群 ppt课件
▪ 带通滤片 BP：允许相当窄的一段波 长范围内的光通过
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(三)信号检测与分析系统
▪ 当细胞携带荧光素标记物，通过激光照射，受激光激发，产生代表不同物 质的不同波长荧光信号。这些信号以细胞为中心向空间360度立体角发射， 产生散射光和荧光信号。
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散射光信号：
▪ 散射光分为前向角散射(forward scatter，FSC)和侧向角 散射(side scatter,SSC)，散射光不依赖任何细胞样品的制 备技术(如染色)，因此被称为细胞的物理参数或称固有 参数。
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▪ 双参数数据的显示 双参数数据的显示是用于表达来自同一细胞两个参 数与细胞数量的关系，常用的表达方法有二维点图(dot plot)、等高线 图(contour plot)、二维密度图(density plot)。在二维图中，x坐标为 某细胞一个参数的数值，而Y坐标为该细胞另一参数的数值。从双参数 图形中可以将各细胞亚群区分开，同时可获得细胞相关的重要信息。
55%
5%
25%
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精度。
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▪ 流动室内充满了鞘液，鞘液的作 用是将样品流环包，鞘液流是一 种稳定的液体流动，鞘液以匀速 运动流过流动室，在整个系统运 行中流速是不变的，样品流在鞘 液的环包下形成流体力学聚焦， 使样品流不会脱离液流的轴线方 向，并且保证每个细胞通过激光 照射区的时间相等，从而得到准 确的细胞荧光信息。
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细胞计数
计算公式：四个角大方格细胞数的总和/4 ×104 （ml）
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细胞计数要点：
1.进行细胞计数时，要求悬液中细胞数目不低于104个/ml， 如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中；
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1953年 Crosland –T轴线流过的鞘液 流速越快，载物通过的能力越强，并具有较强的 流体动力聚集作用。于是设计了一个流动室，使 待分析的细胞悬浮液都集聚在圆管轴线附近流过， 外层包围着鞘液；细胞悬浮液和鞘液都在作层液。 这就奠定了现代流式细胞术中的液流技术基础。
3，染色的细胞经照射发出荧光，同时产生光散射。这些信号分别 被呈900角方向放置的光电倍增管荧光检测器和前向角放置的光电 二极管散射光检测器接收，经过转换器转换为电子信号后，经膜/ 数转换输入计算机。 4，计算机通过相应的软件储存，计算，分析这些数字化信息，就 可以得到细胞的大小和活性，核酸含量，酶和抗原的性质等物理和 生化指标。
二）
三）流式细胞仪的工作原理
参数测量原理：流式细胞仪可以同时进行多参数测量， 信息主要来自特异性荧光信号和非荧光散射信号。 样品分选原理：流式细胞仪的分选功能是由细胞分选器 来完成的。 数据处理原理：FCM的数据显示方式包括单参数直方图 （histogram)，二维点图（dotplot），二维高等图 （contour），假三维图（pseudo 3D）和列表模式（list mode）等。
流式细胞术检测T细胞亚群
组 长： 杜建呈 田 呈（讲解） 小组成员： 李 姚
罗光珍
范成芬 钱洪珍
实 验
一
1 了解流式细胞术的基本发展过程
目
2 掌握流式细胞术的基本原理及应用
的
3 掌握分选T细胞亚群的原理与方法
4 掌握T细胞亚群分选的意义
二，流式细胞术的发展史
Moldavan1首次提出了使悬浮的单个血红细胞等 1934年 流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数， 并用光电记录装置计测的设想，在此之前，人们 还习惯于测量静止的细胞，因为要使单个细胞顺 次流过狭窄管道容易造成较大的细胞和细胞团块 的淤阻。
4，实验步骤
①
混匀抗凝全血，加100ul全血于试管中，分别加入抗人 CD4-FITC,CD8-PE单克隆荧光抗体各10ul，用振荡器混匀， 避光放置15~30min（室温200C~250C) 加入溶血素2ml溶解红细胞，与振荡器上混匀，室温避 光放置10min，1000rpm离心10min，弃上清液。
流式细胞术在细胞化学中的应用的先驱者是Van Dilla 和美国的Los Alamos小组。他们在1967年研制出流液束、 照明光轴、检测系统光轴三者相互正交的流式细胞计的基 础上，首次用荧光Feulgen反应对DNA染色显示出DNA的活 性与荧光之间存在着线性关系，并在DNA的直方图上清楚 地显示出细胞周期的各个时相。Gohde 和Dittrich接着把这 项技术推向实用，他们用流式细胞术测定细胞周期借以研 究细胞药代动力学问题。FCM用于免疫组织化学中的关键 是对细胞进行免疫荧光染色，其它和在细胞化学的应用并 没有多大差异。 流式细胞术主要包括了样品的液流技术、细胞的分选和计 数技术，以及数据的采集和分析技术等。
三，流式细胞术的基本原理及应用
一） 流式细胞术（FCM）是一种可以对细胞或亚细胞结构
进行快速测量的新型分析技术和分选技术。
1，其基本原理是将悬浮分散的单细胞悬液，经特 异荧光染料染色后，放入样品管。
2，在气体压力的作用下，悬浮在样品中的单细胞悬液形成 样品流垂直进入流式细胞仪的流动室，沿流动室的轴心向 下流动，流动室轴心至外壁的鞘液也向下流动，形成包绕 细胞悬液的鞘液流，鞘液和样品流在喷嘴附近组成一个圆 柱流束，自喷嘴的圆形孔喷出，与水平方向的激光束垂直 相交相交点称为测量区。
现代的FCM数据采集和分析技术是从组织化学发 源的，其开拓者是Kamentsky。1965年，他在组织 化学的基础上提出了两个新设想 1）细胞的组分是可以用光光度学来定量测定的， 即分光光度术可以定量地获得有关细胞组织化学 的重要信息。
2）细胞的不同组分可以同时进行多参数测量，从 而可以对细胞进行分类。换句话说，对同一细胞 可以同时获得有关不同组分的多方面的信息，用 作鉴别细胞的依据。
3实验材料：
（1）,肝素抗凝人全血 （2）,荧光标记单克隆抗体：抗人CD4-FITC,抗人CD8-PE(美国BD公司产 品） （3）,细胞洗液（含1%FCS的PBS) （4）,红细胞裂解液 （5）,细胞固定液 （25%戊二醛3.2ml， 葡萄糖2.0g加无血清细胞洗液至 100ml）。 . . （6）,FACS缓冲液 1 × PBS 950ML FCS 40ml 10%叠氮钠溶液 10ml . （7）,仪器缓冲液（FACS-flow),FACS清洁液（FACS clean)和FACS洗净液 （FACS rinse)由仪器厂家提供。 （8）,流式细胞仪。 （9）离心机，吸管，试管等。
四，T细胞亚群的检测
1，实验内容：流式细胞术检测CD4+，CD8+T细胞。
2，实验原理（1）：T淋巴细胞具有高度的异质性， 根据 其表面的标志和功能特征，可分为若干个亚 群，各亚群之间相互调节，共同发挥其免疫学功能。 因此，对淋巴细胞亚群数量的检测能反映机体的免 疫功能状态。本次实验用流式细胞术检测 CD4+,CD8+T细胞。（流式细胞术原理见前面流式细 胞术的基本原理及应用）
实验原理（2）
T淋巴细胞表面的CD分子与相应荧光素直接标记的抗人CD 分子McAb结合后，细胞表面形成带有荧光色素的抗原抗体 复合物。经激光激发后发出与荧光素相对应的特定波长的 荧光，其荧光强度与被测CD分子表达密度成正比例关系， 由此通过流式细胞仪课检测结合含有相应荧光素标记抗体 的阳性细胞百分率。
1956年，Coulter 在多年研究的基础上利用 Coulter
效应生产了Coulter 计数器。其基本原理是：使细 胞通过一个小孔，只在细胞与悬浮的介质之间存 在着导电性上的差异，便会影响小孔道的电阻特 性，从而形成电脉冲信号，测量电脉冲的强度和 个数则可获得有关细胞大小和数目方面的信息。
1967年 Holm等设计了通过汞弧光灯激发荧光染 色的细胞，再由光电检测设备计数的装置。 1973年 Steinkamp设计了一种利用激光激发双色 荧光色素标记的细胞，既能分析计数，又能进行 细胞分选的装置。这样就基本完成了现代FCM计数 技术的主要历程。