方法--流式细胞术检测细胞
流式细胞术
流式细胞术流式细胞术是一种生物学技术，用于对悬浮于流体中的微小颗粒进行计数和分选。
这种技术可以用来对流过光学或电子检测器的一个个细胞进行连续的多种参数分析。
流式细胞术（Flow CytoMetry，FCM）是对悬液中的单细胞或其他生物粒子,通过检测标记的荧光信号，实现高速、逐一的细胞定量分析和分选的技术。
基本信息中文名称:流式细胞术外文名称:Flow Cytometry, FCM优点:速度快、精度高、准确性好等作用快速测定细胞或细胞器生物学性质特点:1.测量速度快；2.可进行多参数测量最高速度:每秒钟3万个细胞4.既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。
工作原理将待测细胞染色后制成单细胞悬液。
用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。
流式细胞仪通常以激光作为发光源。
经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。
这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。
光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。
这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模/数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。
计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理，将分析结果显示在计算机屏幕上，也可以打印出来，还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。
检测数据的显示视测量参数的不同由多种形式可供选择。
单参数数据以直方图的形式表达，其X轴为测量强度，Y轴为细胞数目。
一般来说，流式细胞仪坐标轴的分辨率有512或1024通道数，这视其模数转换器的分辨率而定。
流式细胞术测定细胞周期
流式细胞术测定细胞周期一、实验原理碘化丙锭（PI）可以与细胞内DNA和RNA结合,采用RNA抑制剂将RNA 消化后,通过流式细胞术检测到的与DNA 结合的PI的荧光强度直接反映了细胞内DNA 含量的多少。
由于细胞周期各时相的DNA 含量不同,通常正常细胞的G1/G0期具有二倍体细胞的DNA含量(2N),而G2/M期具有四倍体细胞的DNA 含量(4N),而S期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。
因此,通过流式细胞术PI染色法对细胞内DNA含量进行检测时,可以将细胞周期各时相区分为G1/G0期,S期和G2/M 期,并可通过Multicycle软件计算各时相的百分率。
值得注意的是, PI不能通过细胞膜完整的细胞(如活细胞和早期凋亡细胞) ,在标本制备时,必须先用乙醇或其他破膜剂增强细胞膜的通透性,才能使PI进入细胞内与细胞内的核酸结合。
乙醇通常为终浓度为70%的冷乙醇。
二、实验准备1、试剂胰酶、PBS、纯乙醇（4℃）、RNase A、Triton X-1002、主要器材300目尼龙过滤网三、实验步骤1、每个样品细胞数不得少于100万。
2、胰酶消化，收集细胞（贴壁细胞）或1000rpm离心5分钟直接收集细胞（悬浮细胞）。
3、4℃ PBS洗一次，将细胞重悬于0.3ml 4℃ PBS，加入0.7ml 4℃的纯乙醇，将枪头伸入液面下，轻轻打入乙醇，轻柔混匀两次，4℃固定过夜。
4、1000rpm离心5分钟，去上清，加入染色缓冲液PI染色缓冲液：50 μg/ml PI0.1 mg/ml RNase A0.05% Triton X-100总体积1ml/样品，37℃孵育40分钟。
5、1000rpm 离心5分钟，小心去除上清，加入1ml PBS，轻柔混匀，300目过滤，上机检测。
检测细胞凋亡的三种流式方法
检测细胞凋亡的三种流式方法细胞凋亡（apoptosis）是细胞自主性死亡的过程，是正常细胞发育和组织调控的重要途径。
为了研究细胞凋亡的机制和调控，科学家们发展出了许多方法来检测和定量细胞凋亡的发生。
其中流式细胞术（flow cytometry）是最常用的方法之一，根据不同的细胞特征和所需信息，可以有多种方法用于检测细胞凋亡。
下面将介绍三种常用的流式细胞术方法。
1. 荧光标记的Annexin V/PI双染法：Annexin V是一种细胞外结合蛋白，具有高度特异性结合细胞凋亡的特点。
当细胞凋亡发生时，磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞内翻转至细胞外，而Annexin V能够结合在PS上。
Propidium Iodide（PI）能够穿过损伤的细胞膜，结合到细胞核内的DNA分子上。
通过将Annexin V标记为绿色荧光染料，将PI标记为红色荧光染料，通过流式细胞术定量测量荧光信号的强度，可以区分出未凋亡细胞（Annexin V和PI双阴性），早期凋亡细胞（Annexin V阳性，PI阴性），晚期凋亡和坏死细胞（Annexin V和PI双阳性）等不同状态的细胞。
2.荧光标记的DNA碎片染色法：3. 荧光标记的Caspase活性检测法：Caspases是细胞凋亡过程中的关键酶，它们在给定的信号下被激活并参与调节细胞凋亡的执行阶段。
通过使用荧光标记的Caspase底物，如FLICA系列（Fluorochrome Inhibitor of Caspases）、CaspGLOW系列（Caspase-Glo Kits），可以测量细胞中Caspase的活性。
这些底物在被Caspase酶剪切后会释放出荧光信号，通过流式细胞技术可以测量荧光信号的强度。
由于Caspase活性与细胞凋亡过程密切相关，因此可以利用这些荧光标记底物来定量测量细胞凋亡的发生。
总结起来，流式细胞术是一种非常有效的方法用于检测细胞凋亡的发生。
Annexin V/PI双染法可以定量测量不同状态的细胞，DNA碎片染色法可以测量细胞凋亡的程度，荧光标记的Caspase活性检测法可以测量细胞中Caspase的活性。
《细胞实验》13 流式细胞仪检测细胞凋亡操作流程
流式检测细胞凋亡Annexin V 检测细胞凋亡 (2)实验原理 (2)实验用品 (2)操作步骤 (3)Annexin V Blocking (5)凋亡细胞的DNA 断裂片段分析 (7)实验原理 (7)实验用品 (8)操作步骤 (9)BrdU Flow Kits 检测细胞增殖 (12)实验原理 (12)BrdU Flow Kits 试剂盒 (12)结果分析 (17)流式仪器设置指南 (18)线粒体膜电位变化检测细胞凋亡 (22)实验原理 (22)实验用品 (22)样本制备 (23)结果分析 (24)注意事项 (24)Active Caspase-3 检测细胞凋亡 (26)实验原理 (26)实验步骤 (27)结果分析 (28)Annexin V 检测细胞凋亡实验原理Annexin V 是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。
它是一种磷脂结合蛋白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。
在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸(PS) 由质膜内侧翻向外侧。
Annexin V 与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。
由于在发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变，因此，与DNA 碎片检测比较，使用Annexin V 可以更早地检测到凋亡细胞。
因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻，所以Annexin V 常与鉴定细胞死活的核酸染料(如PI 或7-AAD)合并使用，来区分凋亡细胞(Annexin V+/核酸染料-)与死亡细胞(Annexin V+/核酸染料+)。
实验用品1. 一次性12×75mm Falcon试管。
2. PBS缓冲液：含0.1%NaN ，过滤后2-8°C保存。
33. 微量加样器和加样头。
4. Annexin V Binding Buffer缓冲液（Cat. No. 66121E）：浓度为10×，使用时，用稀释为1×浓度的应用液。
流式细胞术实验方法
流式细胞术实验方法PI 染色操作步骤1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。
2、加入PBS 1ml离心洗涤1次，弃上清。
3、加入2ml预冷的70%酒精，4℃固定30min，或是-20℃固定过夜。
4、离心，弃上清液。
5、用1×PBS 1ml洗涤1次，离心。
6、加入RNase A (工作浓度20ug/ml)于500ul 1×PBS中，37℃孵育30min，离心。
7、用1×PBS 1ml洗涤1次，离心。
8、加入PI(工作浓度50ug/ml) 于500ul 1×PBS中，室温避光孵育30min。
9、混匀，过300目筛网，置流式管中， 4℃冰箱保存，待测。
GFP PI染色操作步骤1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。
2、加入PBS 1ml离心洗涤1次，弃上清。
3、加入2ml预冷PFA，PFA的浓度根据细胞的特点进行调节，4℃固定30min。
以下步骤同PI 染色操作步骤的（4-9）细胞表面直接免疫荧光染色操作步骤1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。
2、以冷PBA 1ml，离心洗涤，弃上清液。
3、加入用PBA稀释的荧光素标记的抗体200ul。
用微量移液器轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育30min-1h。
4、离心弃上清液。
5、加入冷PBS1ml,离心洗涤2次，以除去未结合的多余抗体成分。
6、向细胞中加入冷PBS 500ul,吹打混匀，置流式管中，4℃避光保存，待测。
细胞表面间接免疫荧光染色操作步骤1-2、同细胞表面直接免疫荧光染色操作步骤3、用PBA稀释的第一抗体200ul，对照管加入对应于一抗的正常实验动物IgG，轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育1、5-2h。
离心，弃上清。
4、 BS1ml离心洗涤1次，以去除多余的未结合的特异性抗体。
流式细胞术检测原理
流式细胞术检测原理
流式细胞术（Flow cytometry）是一种基于细胞染色技术和流体动力学原理的分析仪器，主要用于分离、分析和检测细胞、微生物等样品中的细胞数量、大小、形态和生理状态等多项指标。
其检测原理是将样品中的细胞单独定位在精密的光学系统中，使用非常短的激光脉冲从而观察分析细胞。
在流式细胞术中，样品先进行预处理，以使细胞单独存在、不会聚集在一起或堵塞孔口。
细胞溶液被引入流式细胞术仪器的液体流管中，快速流动，并在途中被一个激光束所照射。
激光光束穿过流动的细胞，使得其中的染料激发并发出荧光，荧光信号被称为荧光强度。
检测系统会收集荧光信号，并将其转换为电信号，接着将诸如细胞大小、荧光强度和复杂度等信息转换为数字数据。
最终，所有这些数据都被存储在计算机中，可与之前的数据进行比较分析，从而获得关于细胞的详细数据信息。
流式细胞术检测原理能够检测出许多细胞特征，可以广泛用于细胞生物学、免疫学、癌症学等领域。
在医学、疾病诊断和治疗上有着广泛的应用价值。
细胞凋亡流式细胞术检测
该法简单、快速，但不适于常规多功能流式细胞仪 (不具备紫外光源)的检测。 主要有Caspases-3流式细胞检测试剂盒，Caspases-
2/ Caspases-4/Caspases-6/Caspases-7/Caspases-9等抗
体
2.6 DNA 碎片分析：Apo-BrdU
核酸内切酶活化使核小体内DNA断裂为50~300kb片段，裂解为200bp
通透性和对称性均会改变。
解决方法： 形态学特征是区分凋亡和坏死的“金标准”。
3.3 样本制备过程中凋亡细胞的选择性丢失：
贴壁培养细胞的分离
凋亡早期，细胞即脱离培养瓶表面并悬浮在培养液中。因此去除培养液， 然后加胰酶或EDTA消化的方法不可避免的会失去很多凋亡细胞。 ---将培养液和消化下来的细胞合在一起 胰酶消化本身就倾向于破坏细胞膜已破损的晚期凋亡和坏死细胞，导致 丢失。
2 细胞凋亡的流式检测方法
利用流式仪测定细胞光散射可对凋亡细胞进行分析 凋亡早期细胞因体积减小，胞浆及染色质固缩，FSC变 小，SSC增大 凋亡晚期细胞FSC、SSC均变小 坏死细胞则因细胞膜通透性改变，细胞肿胀， FSC 、 SSC 变大，胞膜破裂，胞内含物释出后 FSC 、 SSC 均变 小。
此法简单、可靠，由于凋亡时 细胞膜的改变大大早于DNA 的 改变，因此Annexin V/PI(或7-
AAD )双染色是检测早期凋亡
细胞的敏感方法。 由于该法必须用活细胞，因此 检测时间受到限制，且对凋亡 晚期细胞和坏死细胞无法准确 区分。
2.3 细胞内钙离子测定
Fluo-3-Am为新型的高度特异性Ca2+荧光指示剂，进入细胞后
2.1 PI单染检测
与细胞周期相同，利用PI染色，通过检测DNA含量来 同时判定细胞周期和凋亡。 凋亡过程中，细胞内核酸酶释放，细胞DNA发生有序
流式细胞术
临床型（台式机）
BD LSR
FACS Vantage DiVa
特点：
多数字化
适用用各类细胞分选
4路分选
科研型（大型机）
FACSAria
特点： 分辨率高 选配多种波长和 类型激光器 可把感兴趣细胞 分选到特定培养孔 或板上（4路和24 孔板） 适用于高速分选 和多色分析
第 二 部 分 流式细胞术在不同领域的应用
细 胞 周 期 分 析
• 在细胞周期内,DNA含量随细胞内时相发生周期性
• • •
• •
•
变化。 正常情况下,大多数细胞处于休止期(Go), G1期细胞虽有DNA合成，但DNA含量仍为2N， 为二倍体细胞,; 处于活跃的DNA合成期(S期)的细胞DNA• 含量为 2N-4N; 正经历细胞分裂(G2/M期)的细胞含有最大量的 DNA(4N)。 细胞经固定后用• PI (碘化丙啶) 等荧光染料染色 即可上机测定。 但标本需先经RNA酶处理以排除RNA干扰。
488 nm laser
FALS Sensor Fluorescence detector
Charged Plates
-
+
Single cells sorted into test tubes
信号检测--散色光
它反应细胞的物理特性,根据前侧向散射 光，可以把不同类型的细胞群加以区分
FSC（小角散射)光它 反应细胞的相对大小 和截面积的大小 SSC (90度角散射光) 代表细胞的颗粒度和 精细结构的变化
2.光散射特性：凋亡细胞形态上的改变影响它们的光散
射特性。 在流式细胞仪上，前散射光（ FSC ）与细胞的大小 有关， 侧散射光（SSC）反映的是光在细胞内的折射作用， 与细胞内的颗粒多少有关。 在细胞凋亡时，细胞固缩，体积变小，故前散射光降 低，这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一。 此外细胞凋亡时由于染色体降解，核破裂形成，细胞内 颗粒往往增多，故凋亡细胞侧散射光常增加。
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2.2.2.5 流式细胞术检测细胞周期
2.2.2.5.1 实验原理
用流式细胞仪检测细胞周期，通常用碘化丙啶（propidium iodide，PI）染细胞核。
PI在一定波长的光下发出荧光，其强度与DNA含量成正比。
通过流式细胞仪分析各时期的细胞百分数，可检测细胞的增殖、凋亡。
2.2.2.5.2流式细胞仪检测A549细胞周期步骤
收集对数生长期细胞，计数，以(1~5)×105/孔接种于6孔板，置37℃，5％CO2条件下培养过夜，使细胞贴壁。
次日更换培养液，各孔分别加入含有0、80、400、2000、10000 mg/L不同浓度茶氨酸的细胞培养液2 mL/孔，继续常规培养；每24 h同法换液一次。
每个浓度设3个重复。
48 h后，中止培养，胰酶消化后，收集细胞于流式管1000 r/min离心5min，弃上，冷PBS洗涤细胞3次，离心去上清；
一边震荡一边向细胞沉淀中加入70%预冷乙醇混匀，4℃固定18 h以上；离心，弃去乙醇上清，加入预冷的PBS洗沉淀1次，离心去上清；
加入RNA酶（50 mg/L）10 μL/孔和PI（50 mg/L）300 μL/孔，震荡混匀。
室温、避光反应30 min；
流式细胞仪进行DNA检测，用Modifit软件分析各时相细胞周期的比例。
2.2.2.6流式细胞仪检测A549细胞凋亡
2.2.2.6.1实验原理
在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。
AnnexinV 是一种分子量为35～36 kD的Ca2＋依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。
因此AnnexinV被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。
碘化丙啶（PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。
因此将AnnexinV与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。
2.2.2.6.2 结果判断
凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI 有抗染性，坏死细胞则不能。
细胞膜有损伤的细胞的DNA 可被PI着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。
因此，在细胞凋亡的早期PI 不会着染而没有红色荧光信号。
正常活细胞与此相似。
在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象
限显示活细胞，为（FITC-/PI-）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为（FITC+/PI+）；而右下象限为凋亡细胞，显现（FITC+/PI-）。
2.2.2.6.3流式实验步骤
收集对数生长期A549细胞，计数，以(1～5)×105个/孔接种于6孔板，置37℃，5％CO2条件下培养过夜，使细胞贴壁；次日更换培养液，各孔分别加入含有不同浓度茶氨酸的细胞培养液2 mL/孔，继续常规培养；每24 h同法换液一次；
在药物处理48 h后，以不含EDTA的胰酶消化并收集细胞于流式管1000 r/min离心5 min，弃上清。
冷PBS洗涤细胞3次，离心弃上清；
按照Annexin-V-FITC细胞凋亡检测试剂盒的说明，向细胞中加入Binding buffer 150 μL/管和Annexin-V 5 μL/管，振荡混匀。
室温、避光反应15 min；
再次加入Binding buffer 100 μL/管和PI染料5 μL/管，振荡混匀；
用流式细胞仪检测细胞凋亡。