流式细胞术检测人和小鼠Th细胞亚群
小鼠胸腺或脾脏T淋巴细胞亚群的流式细胞术检测方法[发明专利]
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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710321625.1(22)申请日 2017.05.09(71)申请人 成都扬克斯生物科技有限公司地址 610094 四川省成都市高新区益州大道中段722号4栋14楼1404号(72)发明人 彭西 于正强 胡东 李林蔚 (74)专利代理机构 北京科亿知识产权代理事务所(普通合伙) 11350代理人 汤东凤(51)Int.Cl.G01N 15/14(2006.01)(54)发明名称小鼠胸腺或脾脏T淋巴细胞亚群的流式细胞术检测方法(57)摘要本发明公开了一种小鼠胸腺或脾脏T淋巴细胞亚群的流式细胞术检测方法，包括以下步骤：获取试验小鼠的胸腺或脾脏组织，制备单细胞悬液；分别吸取所述胸腺或脾脏单细胞悬液，分别加入抗小鼠的CD3、CD4、CD8单克隆抗体各一头份，旋涡混匀，于4℃避光染色；染色后，用PBS液洗涤并重悬细胞，使用流式细胞仪进行检测；分析检测结果，获得小鼠胸腺或脾脏各亚群T淋巴细胞的百分比。
本发明成功建立了稳定规范的流式细胞术检测小鼠胸腺或脾脏T淋巴细胞亚群的方法，通过对样品前处理、检测和分析过程中的目标细胞选取、补偿调节及参数选择的问题进行改进，避免了试验过程中人为因素造成的误差，提高了结果判断的真实性和客观性。
权利要求书1页 说明书6页 附图3页CN 107132177 A 2017.09.05C N 107132177A1.一种小鼠胸腺或脾脏T淋巴细胞亚群的流式细胞术检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，获取试验小鼠的胸腺或脾脏组织，制备单细胞悬液；步骤2，吸取所述胸腺或脾脏单细胞悬液，分别加入两支流式上机管中一支管中加入抗小鼠的CD3、CD4、CD8单克隆抗体，旋涡混匀，于4℃避光染色，用作检测管；另一支用作阴性设置管；步骤3，染色后，用PBS液洗涤并重悬细胞，使用流式细胞仪进行检测；步骤4，分析检测结果，获得小鼠胸腺或脾脏各亚群T淋巴细胞的百分比。
流式细胞术检测细胞内细胞因子的研究进展
流式细胞术检测细胞内细胞因子的研究进展【摘要】：细胞因子具有调节细胞生长、分化成熟、功能维持、调节免疫应答、参与炎症反应、创伤愈合和肿瘤消长等多种生物学功能。
因此，细胞因子的研究成果为临床上预防、诊断、治疗疾病提供了科学基础，特别是利用细胞因子治疗肿瘤、感染、造血功能障碍、自身免疫性疾病等，具有非常广阔的应用前景[1]。
随着细胞表面标记及胞内细胞因子标记流式细胞技术的出现，使对胞内细胞因子的研究推向了一个新的阶段。
流式细胞术也成为了检测单细胞水平细胞因子表达能力的重要检测方法。
本文针对流式细胞术在胞内细胞因子检测中的研究进展作一综述。
【关键词】：流式细胞术；细胞内；细胞因子；检测技术引言：细胞因子(cytokine，CK)是由多种组织细胞(主要为免疫细胞)所合成和分泌的小分子多肽或糖蛋白，能介导细胞之间的相互作用，并在抵抗外来病原及维持机体内环境平衡中起到重要作用。
细胞因子的检测方法一般分为生物学测定法、分子生物学测定法及免疫学测定法。
而目前用于检测单个细胞特定细胞因子表达的手段则包括：多参数流式细胞术，酶联免疫斑点法ELISPOT[2]、原位杂交、免疫细胞化学、限制性稀释分析（limiting dilution analysis，LDA）和单细胞PCR等生物分析技术。
相较于其它的检测方法，流式细胞术在细胞内细胞因子的检测上具有高效、简便、适应性广等优势。
一、流式细胞术的概述流式细胞术(flow cytometry，FCM)是一种能够对单个细胞或生物微颗粒的生物学性质进行定量分析和分选的检测手段，具有快速、高精度、高准确性、多参数和高通量等优点，是目前先进的细胞定量分析技术之一。
FCM能够快速分析单个细胞或粒子的多种特性，既可以定性，也可以定量，尤其适用于大量样品检测，已在临床检验工作中得到广泛应用。
流式细胞仪（fluorescenceactivated cell sorter，FACS）的检测分析已涉及到细胞生物学、免疫学、肿瘤学、遗传学、血液学、微生物学等学科。
流式细胞术检测淋巴细胞亚群操作规程
流式细胞术检测淋巴细胞亚群操作规程一、编号：JS0604二、标题：流式细胞术检测淋巴细胞亚群操作规程三、关键词：流式细胞术淋巴细胞操作规程四、目的：规范流式细胞术检测淋巴细胞亚群的实验操作五、背景知识：T细胞亚群变化的临床意义主要表现在肿瘤、自身免疫性疾病中。
在感染性疾病中，因为CD4+ T细胞是辅助、诱导T细胞的标志，CD4+ T 细胞下降常见于某些病毒感染性疾病，如AIDS、巨细胞病毒感染、瘤型麻风。
而CD4+ T细胞长期低于正常水平，常提示患者易于被病毒等微生物侵袭。
CD8+是抑制、杀伤T细胞的标志，在传染性单核细胞增多症、巨细胞病毒感染、慢性乙型肝炎等感染性疾病中，CD8+ T细胞常升高。
CD4+／CD8+细胞比值下降，除肿瘤等疾病外，常见于AIDS、瘤型麻风、传染性单核细胞增多症、巨细胞病毒感染、血吸虫病等。
六、原理：利用不同荧光物质标记的抗CD3、CD4、CD8单克隆抗体，与待测成分作用，然后上流式细胞仪检测待测细胞。
待测细胞随流动室内的流动鞘液排列成单列，一个个迅速通过激光聚焦区，激光在对每个细胞进行照射时可同时得到前向角散射和侧向角散射2种散射光以及激发荧光标记物质发出的信号，利用这些信号，可计算出CD3+、CD4+、CD8+的相对含量，从而得出各细胞群的相对比值。
七、仪器设备和材料：肝素抗凝静脉血1ml，不同荧光素标记的抗CD3、CD4、CD8单克隆抗体，同型阴性对照荧光物，溶血剂，固定剂，流式细胞仪。
八、操作步骤1、100μ1抗凝血加20μl荧光单克隆抗体，同时做阴性对照。
2、避光室温作用20min，溶去红细胞后，固定剂固定。
3、上流式细胞仪测定，以阴性对照测出本底参数，调节荧光补偿，设定阳性参数值，软件将计算出阳性表达细胞比例。
九、注意事项1、为保证所得结果的可靠性，每次试验前应以标准荧光微球检测仪器的变异系数。
2、每次应做阴性对照、阳性对照、正常对照、质控对照，以确保将各种试剂及操作过程对结果的影响降至最低。
流式细胞术检测人和小鼠Th细胞亚群
流式细胞术检测人和小鼠Th细胞亚群早在1986年Mosmann等[1]依据小鼠分泌的细胞因子谱不同首次将Th细胞分为Th1和Th2两个功能不同的独立亚群。
Th1细胞主要分泌IL-2、、IL-12、IFN-γ和TNF- α等细胞因子，介导与细胞毒和局部炎症有关的免疫应答，参与细胞免疫及迟发型超敏反应。
Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL13等细胞因子，其主要功能为刺激B细胞增殖并产生抗体，与体液免疫相关。
由于Th1/Th2 亚群及其相互之间的平衡在免疫应答的调节中起着关键的作用，Th1/Th2 平衡的失调与多种疾病的发生发展和预后有着密切的关系。
目前已发现许多感染性疾病、自身免疫性疾病、过敏性疾病以及移植排斥反应等都与Th1/Th2 平衡有关。
因此建立稳定有效的细胞内因子检测方法对于准确说明Th1/Th2细胞的作用非常重要。
目前检测的主要方法有酶联免疫法、ELISPOT法、荧光定量法及原位杂交等方法。
流式细胞术检测细胞内因子是一种相对快速、重复性好并能准确定量的方法。
我们参照国内外的一些文献，对于人和小鼠Th1和Th2细胞的流式检测方法进行了探索，并比较了两者之间的不同。
由于未活化的淋巴细胞所分泌的细胞因子极少，用流式细胞仪很难检测出来，因此在检测前需刺激活化。
目前国内外推荐的刺激物主要为PMA （佛波酯）和离子霉素（Ionomycin）。
淋巴细胞在刺激物的作用下活化，分泌细胞因子到细胞外。
由于流式细胞仪只能对细胞表面或内部的抗原进行检测，因此必须阻止细胞因子的分泌。
抑制细胞因子分泌的试剂为Brefedlin A 或莫能霉素（Monensin）。
Th1/Th2 细胞首先是CD4+ T 淋巴细胞。
因此如何确定CD4+ T淋巴细胞非常重要，我们主要围绕该问题进行探讨。
材料与方法试剂PMA（Sigma）贮存液：PMA 溶于DMSO 浓度为0.1mg/ml -20℃保存。
工作液：贮存液1:100 稀释于RPMI 1640培养基中，此时为1µg/ml。
流式细胞术检测细胞亚群存活率的应用研究
１２ 主要仪器 ．
１３ ． 方 法
Ｂ Ａ ｓＣ ｌ ｕ 流 式 细 胞 仪 ， ｅｍｏＦ ｒ Ｄ Ｆ Ｃ ａｂｒ ｉ Ｔｈｒ ｏ—
Ｌｉ ａ ｇ Ｌａ ， ｉ ｈ ｉ Ｙａ ｇ Ｓ ｕ ａ Ｚｈ ｎ ｎ ， ｎ ｉ ＬｉＬｉ ｉ Ｄｅ ｇ Ｙ ｎ ， ｕ Ｙ ｎ ， ｉＹｉ ＬｉＭ ｎ ｕ ， ｎ ｈ ｘｉ ， ｅ ｇ Ｊｉ ｇ Ｙａ ｇ Ｔａ ， ｍｅ ， ｎ ｏ ｇ
Ｚｈ ｎ ａ ｇ Ｒｅ ｎ ａ ｇＱｉｎ ， ｎＲｏ ｇｍｅ ， ａ ｍｅ ， ａ ｇ Ｓ ｕ ｉ ＬｉＨｕ ， ｕＱｉｎ ｉ Ｌｉ Ｑｉｎ ｉ Ｚｈ ｎ ｈ ａ ， ａ Ｚｏ ａ ｇ
（ ． ｓ ａ ｃ ｎ ｅ Ｃｈ ｎ ｄ １ Ｒｅ ｅ ｒ ｈ Ｃｅ ｔ ｒ， ｅ ｇ ｕＭ ｅ ｉａ ｌｅ ｅ， ｅ ｇ ｕ ６ ０ ８ ， ｉ ａ； ｄ ｃ ｌＣｏ ｌ ｇ Ｃｈ ｎ ｄ １ ０ ３ Ｃｈ ｎ ２ Ｃ ｎ ｅ ｎ ｅ Ｃ ｅ ｇｄ ｉｉａ ｙ Ｇｅ ｅ ａ ｓ ｔ ｌ Ｃ ｅ ｇｄ １ ０ ３， ｉ ａ ． ａ ｃ ｒＣｅ ｔ ｒ， ｈ ｎ ｕ Ｍ ｌｔ ｒ ｎ ｒ ｌ Ｈｏ ｐｉａ ， ｈ ｎ ｕ ６ ０ ８ Ｃｈ ｎ ）
活 Ｔｅ ｒ ｇ细胞 设 定 为 理 论 活 Ｔｒｇ细 胞 含 量 １ ０ ， 以 此 为 基 ｅ ０ 并 础 进 行 稀 释 得 到 ９ 、 Ｏ 、 ０ 、 Ｏ 、 ｏ 、 Ｏ 、 Ｏ 、 Ｏ ８ ％ ７ ６ ５ ４ ３ ２ 、 Ｏ 、 的样 品 。然 后 ， 管 样 品 均 染 色 ＡＰ Ｏ １ ５ 每 Ｃ标 记 的 小
ｌ 材 料 与 方 法
流式细胞术检测外周血T淋巴细胞亚群的准确性评价
流式细胞术检测外周血T淋巴细胞亚群的准确性评价夏欣欣;王慧睿【摘要】目的:探讨流式细胞术检测外周血T淋巴细胞亚群的准确性.方法:选取2016年3月至2017年3月收治的恶性肿瘤患者36例为观察组,另选取同期就诊的非肿瘤患者36例为对照组,比较两组对象的外周血CD3+T细胞、CD4+T细胞及CD8+T细胞数量;利用流式细胞术对两组患者外周血T淋巴细胞亚群进行检测,判断该检测结果与临床诊断结果的符合率.结果:观察组患者的CD3+T细胞数量为(823.42±212.03)个/mm3,低于对照组的(1270.21±685.14)个/mm3(t=2.786,P=0.008);观察组患者的CD4+T细胞数量为(424.06±235.02)个/mm3,低于对照组的(750.98±367.56)个/mm3(t=2.786,P=0.008);观察组患者的CD8+T细胞数量为(860.94±633.86)个/mm3,高于对照组的(456.37±334.20)个/mm3(t=2.525,P=0.016);观察组患者的CD4+/CD8+T细胞数比值为(0.51±0.29),低于对照组的(2.11±1.32)(t=5.295,P=0.000);流式细胞术对患者外周血T淋巴细胞亚群检测结果的符合率为100.0％.结论:采用流式细胞术检测恶性肿瘤患者外周血T淋巴细胞亚群准确性较高,能够为恶性肿瘤的临床诊断和治疗提供依据.【期刊名称】《包头医学院学报》【年(卷),期】2018(034)003【总页数】2页(P5-6)【关键词】流式细胞术;恶性肿瘤;外周血T淋巴细胞亚群;检测准确性【作者】夏欣欣;王慧睿【作者单位】郑州大学附属洛阳中心医院肿瘤科,河南洛阳471000;郑州大学附属洛阳中心医院血液科【正文语种】中文恶性肿瘤的发生、发展与患者机体免疫功能的关系密切，在机体抗肿瘤免疫监视功能中，免疫系统具有非常重要的作用，而在维持人体机体免疫平衡的过程中，T细胞及其亚群所起到的作用至关重要，如T细胞亚群发生功能或数量改变时，机体的免疫功能紊乱，从而导致疾病[1-2]。
流式细胞术检测CFSE标记人T细胞亚群增殖反应_王敏
1. 1 主要试剂和仪器 CFSE 购自 Molecular Probes 公司; 植物血凝素( PHA) 购自 Sigma 公司; CD3 mAb ( OK3) 为美国宾夕法尼亚大学 Carding 博士惠赠; 结 核杆 菌低 分 子 多 肽 抗原 ( Mtb Ag ) 由 本 室 根 据 文 献[ 3, 4] 自制。RPMI 1640 培养液( GIBCO 公司) 补充 2 mmol/ L L 谷氨酰胺、50 mol/ L 二巯基乙醇( 2 ME) 、 1 mmol/ L丙酮酸钠、50 mg/ L 庆大霉 素 和 100 mL/ L 新生 小 牛血 清( NBS, 杭 州 四季 青公 司) 后 为 完 全
[ Key words] Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester; Proliferation; T cell subpopulations; Flow cytometry
检测淋巴细胞激活后的增殖反应是免疫学实验 研究中的基本技术, 传统方法有同位素( 3H TdR) 掺 入法和形态学方法, 也有用 MTT 法, 以及 BrdU 标记 法等技术。这些检测方法均不能反映不同淋巴细胞 亚群的增殖状态。1990 年, Weston 等用活细胞染料 羧基 荧光 素 乙 酰乙 酸 琥 珀酰 亚 胺 酯 ( Carboxyfluo rescein diacetate, succinimidyl ester, CFDA SE ) , 也 常 简称为 CFSE, 标记淋巴细胞研究迁移活动[ 1] 。随后 Lyons 等[ 2] 用其检测淋巴细胞的增殖反应。CFSE 是 非极性分子, 可自由扩散进入细胞, 在胞内酯酶水解 后产生具有荧光特性的 CFSE, 并与胞内蛋白的赖氨 酸等胺基发生不可逆偶联, 形成稳定的大分子荧光
流式细胞术检测T细胞亚群概要
1953年 Crosland –T轴线流过的鞘液 流速越快，载物通过的能力越强，并具有较强的 流体动力聚集作用。于是设计了一个流动室，使 待分析的细胞悬浮液都集聚在圆管轴线附近流过， 外层包围着鞘液；细胞悬浮液和鞘液都在作层液。 这就奠定了现代流式细胞术中的液流技术基础。
3，染色的细胞经照射发出荧光，同时产生光散射。这些信号分别 被呈900角方向放置的光电倍增管荧光检测器和前向角放置的光电 二极管散射光检测器接收，经过转换器转换为电子信号后，经膜/ 数转换输入计算机。 4，计算机通过相应的软件储存，计算，分析这些数字化信息，就 可以得到细胞的大小和活性，核酸含量，酶和抗原的性质等物理和 生化指标。
二）
三）流式细胞仪的工作原理
参数测量原理：流式细胞仪可以同时进行多参数测量， 信息主要来自特异性荧光信号和非荧光散射信号。 样品分选原理：流式细胞仪的分选功能是由细胞分选器 来完成的。 数据处理原理：FCM的数据显示方式包括单参数直方图 （histogram)，二维点图（dotplot），二维高等图 （contour），假三维图（pseudo 3D）和列表模式（list mode）等。
流式细胞术检测T细胞亚群
组 长： 杜建呈 田 呈（讲解） 小组成员： 李 姚
罗光珍
范成芬 钱洪珍
实 验
一
1 了解流式细胞术的基本发展过程
目
2 掌握流式细胞术的基本原理及应用
的
3 掌握分选T细胞亚群的原理与方法
4 掌握T细胞亚群分选的意义
二，流式细胞术的发展史
Moldavan1首次提出了使悬浮的单个血红细胞等 1934年 流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数， 并用光电记录装置计测的设想，在此之前，人们 还习惯于测量静止的细胞，因为要使单个细胞顺 次流过狭窄管道容易造成较大的细胞和细胞团块 的淤阻。
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流式细胞术检测人和小鼠Th细胞亚群点击次数：22 发布日期：2008-5-12 仅供参考，谢绝转载，否则责任自负早在1986年Mosmann等[1]依据小鼠分泌的细胞因子谱不同首次将Th细胞分为Th1和Th2两个功能不同的独立亚群。
Th1细胞主要分泌IL-2、、IL-12、IFN-γ和TNF- α等细胞因子，介导与细胞毒和局部炎症有关的免疫应答，参与细胞免疫及迟发型超敏反应。
Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、 IL-6、IL-10和IL13等细胞因子，其主要功能为刺激B细胞增殖并产生抗体，与体液免疫相关。
由于Th1/Th2 亚群及其相互之间的平衡在免疫应答的调节中起着关键的作用，Th1/Th2 平衡的失调与多种疾病的发生发展和预后有着密切的关系。
目前已发现许多感染性疾病、自身免疫性疾病、过敏性疾病以及移植排斥反应等都与Th1/Th2 平衡有关。
因此建立稳定有效的细胞内因子检测方法对于准确说明Th1/Th2细胞的作用非常重要。
目前检测的主要方法有酶联免疫法、ELISPOT法、荧光定量法及原位杂交等方法。
流式细胞术检测细胞内因子是一种相对快速、重复性好并能准确定量的方法。
我们参照国内外的一些文献，对于人和小鼠Th1和Th2细胞的流式检测方法进行了探索，并比较了两者之间的不同。
由于未活化的淋巴细胞所分泌的细胞因子极少，用流式细胞仪很难检测出来，因此在检测前需刺激活化。
目前国内外推荐的刺激物主要为PMA （佛波酯）和离子霉素（Ionomycin）。
淋巴细胞在刺激物的作用下活化，分泌细胞因子到细胞外。
由于流式细胞仪只能对细胞表面或内部的抗原进行检测，因此必须阻止细胞因子的分泌。
抑制细胞因子分泌的试剂为Brefedlin A 或莫能霉素（Monensin）。
Th1/Th2 细胞首先是CD4+ T淋巴细胞。
因此如何确定CD4+ T淋巴细胞非常重要，我们主要围绕该问题进行探讨。
材料与方法试剂PMA（Sigma）贮存液：PMA 溶于DMSO 浓度为0.1mg/ml -20℃ 保存。
工作液：贮存液1:100 稀释于RPMI 1640培养基中，此时为1µg/ml。
Ionomycin（Sigma）贮存液：Ionomycin 溶于DMSO 浓度为1mg/ml -20℃ 保存。
工作液：贮存液1:20 稀释于RPMI 1640 培养基中，此时为50µg/ml。
GolgiStop（内含Monensin ，BD Pharmingen）Cytofix/Cytoperm液、Perm/Wash液和FACS Lysing Solution，均购自BD Pharmingen。
抗体细胞表面标记抗体：抗人CD3-APC，CD8-PercP，CD8-CYC，CD4-CYC。
抗小鼠CD4-CYC、CD8PE。
细胞内因子抗体：抗人IL-4-PE, IFN-γ-FITC。
抗鼠IL-4-PE, IFN-γ-FITC。
以上抗体均购自BD Pharmingen。
实验方法1 外周血单个核细胞的分离：取肝素抗凝正常人或者Balb/c小鼠外周血1.5ml。
在试管内加入淋巴细胞分离液3ml。
将外周血以等体积Hanks液稀释后，轻轻加入淋巴细胞分离液上层。
2000g离心20min。
取出试管后，轻轻吸取液相交界的单个核细胞，加入Hanks液3ml，混匀后，1500g离心5min。
弃去上清，细胞加入0.5mlRPMI 1640培养基（含10% 小牛血清，50 μg/ml penicillin 和50μg/mlsteptomycin）重悬，血细胞计数仪计数，调整细胞浓度。
2 不同浓度的PMA刺激后人T淋巴细胞CD4、CD8和CD3的表达。
24孔细胞培养板中，每孔加入约5×105个细胞，加入RPMI 1640培养基至总体积1ml。
加入不同浓度的PMA（10ng、20ng和50ng终浓度）和500ng/ml Ionomycin共同刺激人外周血单个核细胞，同时加入0.7µl Golgistop，37 ℃ CO2孵箱刺激4h。
收集单个核细胞，分为三部分，分别加入CD8-CYC、CD4-CYC、CD3-APC单抗各10ul，室温避光孵育30min。
加入红细胞裂解液（FACS Lysing Solution）1ml裂解残余红细胞，2ml PBS洗涤细胞一次。
流式细胞仪（FACSCalibur，Becton Dickinson)检测细胞，Cellquest软件获取分析细胞，每个检测获取10000个细胞。
采用前向角（FSC）和侧向角（SSC）散射光散点图设门区分淋巴细胞，以直方图分别表示CD3、CD8和CD4阳性淋巴细胞。
3 不同时间PMA和离子霉素刺激后小鼠T淋巴细胞CD4和CD8的表达。
24孔细胞培养板中，每孔加入约5×105个细胞，加入RPMI 1640培养基至总体积1ml。
加入PMA和Ionomycin使终浓度分别为100ng/ml和1µg/ml，同时加入0.7µl Golgistop。
37 ℃ CO2孵箱刺激8h、12h分别收集细胞。
采用抗小鼠CD4-CYC、CD8PE抗体标记T淋巴细胞，流式细胞仪检测CD4和CD8的表达。
4 流式细胞术检测人外周血Th1和Th2细胞。
分离外周血单个核细胞，加入20ng/ml PMA和500ng/ml离子霉素刺激4h后，收集细胞。
将细胞分为两份，称为对照管和实验管，分别加入CD3-APC，CD8-PercP10µl，混匀，室温放置20min，加入红细胞裂解液1ml，混匀，室温放置10min，1000g离心5min，弃上清。
加入Cytofix/Cytoperm液200µl，4℃放置20min，使细胞固定穿孔。
加入Perm/Wash液1ml，1500g离心5min，弃上清。
实验管加入IFN-γ-FITC、IL-4 - PE各5ul，对照管加入同型对照抗体，4℃避光孵育30min。
加入Perm/Wash液500µl洗涤两次。
最后以300µl洗涤液重悬细胞。
采用FACScom软件及CD3-APC、CD8-PercP 、IFN-γ-FITC、IL-4 – PE抗体单双标记的淋巴细胞调节仪器的补偿，采用Cellquest软件获取分析细胞。
以前向角（FSC）和侧向角（SSC）散射光散点图设门区分淋巴细胞，以CD3和CD8散点图设门区分Th细胞（CD3+CD8-）。
最终以IFN-γ和IL-4的散点图表示Th1细胞和Th2细胞。
5 流式细胞术检测小鼠外周血Th1和Th2细胞。
分离外周血单个核细胞，加入100ng/ml PMA和1µg/ml 离子霉素刺激5h后，收集细胞。
将细胞分为两份，称为对照管和实验管，加入CD4－CYC 10µl，混匀，其余步骤同人的检测。
调节仪器的补偿，采用Cellquest软件获取分析细胞。
以前向角（FSC）和侧向角（SSC）散射光散点图设门区分淋巴细胞，以CD4直方图设门区分Th细胞（CD4+），以IFN-γ和IL-4的散点图表示Th1细胞和Th2细胞。
结果1 不同浓度的PMA对人外周血T淋巴细胞抗原表达的影响。
10ng、20ng和50ng的PMA刺激后4h，CD4的表达明显下降，已经不能区分出CD4阳性T淋巴细胞，而CD8和CD3的表达未受明显影响。
重复5次检测，典型的检测结果见图1。
图1 10ng、20ng、50ng PMA和500ng/ml Ionomycin共同刺激4h后人外周血T淋巴细胞CD4、CD8和CD3的表达。
图中A、B、C系列分别是10ng、20ng、50ng PMA刺激后CD4、CD8和CD3的表达。
各种浓度的PMA刺激后均不能有效的区分CD4阴性和CD4阳性细胞，而CD3和CD8的表达受影响很小，可以有效的区分阴性和阳性细胞。
2 不同时间的PMA刺激对小鼠外周血T淋巴细胞抗原表达的影响。
PMA刺激8h后CD4阳性T淋巴细胞的表达没有明显下降。
PMA刺激12h后，CD4阳性T淋巴细胞的表达明显下降。
而CD8表达在8h和12h均没有明显下降。
典型的检测结果见图2。
图2不同时间的PMA刺激对小鼠外周血T淋巴细胞抗原表达的影响。
PMA刺激8h后T淋巴细胞CD4的表达有轻度下降，但是仍能有效的区分CD4阴性和CD4阳性细胞。
PMA刺激12h后，CD4阳性的表达明显下降。
而CD8表达在8h和12h均没有明显下降。
3 正常人外周血Th1细胞和Th2细胞。
采用CD3+CD8-的T淋巴细胞为Th细胞，设门分析Th1细胞（IFN-γ+）和Th2细胞（IL-4+）的百分比。
典型检测结果见图3。
图3流式细胞仪检测人外周血Th1和Th2细胞。
A为FSC和SSC的散点图，R1区为淋巴细胞区；B为CD3和CD8的散点图，R2区为Th细胞（CD3＋CD8－），R3区为Tc细胞（CD3＋CD8＋）。
C为以“R1 and R2”设门，IL-4和IFN-γ的散点图， IFN-γ＋和IL-4＋细胞分别为Th1和Th2细胞。
D为以“R1 and R3”设门，IL-4和IFN-γ的散点图。
4 正常Balb/c小鼠外周血Th1细胞和Th2细胞。
采用CD4＋淋巴细胞为Th细胞，设门分析Th1细胞（IFN-γ+）和Th2细胞的百分比（IL-4+）。
典型检测结果见图4。
图4 小鼠外周血Th1、Th2细胞。
A为CD4直方图，R2为CD4＋细胞，B为IL-4和IFN-γ的散点图。
从Rostaing等[2]发表流式细胞术检细胞内细胞因子的方法后，陆续有人研究了流式细胞术检测细胞内因子方法的可行性及重复性等问题。
虽然活化T淋巴细胞有各种各样的方法，如：PMA、PHA、Con A、CD3、CD2和CD28等。
但是目前公认的较好的方法仍然是PMA和钙离子载体的联合刺激。
研究发现在PMA的刺激后4h，IFN-γ和IL-4的表达就达到一个较高的水平，因而适合进行流式检测。
我们的研究结果发现，人的外周血T淋巴细胞表面的CD4表达受PMA的影响非常大，在刺激后2h即明显下降，4h已经难于区分CD4阳性T淋巴细胞，因此这就难于确定Th细胞。
虽然国内部分学者认为在PMA的刺激下，CD4仍可以维持一定的表达[3,4]，但是我们的结果和国内部分[5]及国外的大多数[2,6]研究结果表明，在PMA的刺激下，CD4表达迅速下调，此时采用CD4来标记Th细胞已经不能准确的检测Th细胞，因而不能准确的反应Th1和Th2细胞的比率。
而CD3和CD8的表达受PMA等刺激因子的影响很小，因此，目前，国外推荐的方法是采用CD3和CD8设门，区分CD4阳性T淋巴细胞。
由于多色荧光标记流式检测技术的发展，笔者认为采用4色标记技术检测人Th细胞是目前最好的方法。