T淋巴细胞亚群检测操作程序
细胞亚群检测实验报告
1. 了解淋巴细胞亚群检测的基本原理和方法。
2. 掌握流式细胞术在淋巴细胞亚群检测中的应用。
3. 分析实验结果，了解淋巴细胞亚群在免疫调节中的作用。
二、实验原理淋巴细胞亚群检测是利用流式细胞术对淋巴细胞进行分类、计数和功能分析的一种技术。
通过特异性抗体标记，检测淋巴细胞表面标志物，实现对不同亚群的识别。
本实验主要检测T细胞、B细胞和NK细胞亚群。
三、实验材料1. 实验试剂：抗CD3、抗CD4、抗CD8、抗CD19、抗CD16、抗CD56单克隆抗体。
2. 实验仪器：流式细胞仪、细胞培养箱、离心机、移液器等。
3. 实验样本：新鲜血液。
四、实验步骤1. 样本采集：采集受试者新鲜血液，分离外周血单个核细胞（PBMCs）。
2. 抗体标记：将分离的PBMCs与抗CD3、抗CD4、抗CD8、抗CD19、抗CD16、抗CD56单克隆抗体混合，室温孵育30分钟。
3. 洗涤：将标记好的细胞用磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）洗涤两次。
4. 流式细胞术检测：将洗涤后的细胞上流式细胞仪，进行检测和分析。
5. 数据分析：使用流式细胞术分析软件对实验数据进行处理，计算各亚群细胞比例。
五、实验结果1. T细胞亚群：CD3+T细胞占外周血淋巴细胞的50-70%，其中CD4+T细胞占CD3+T 细胞的30-45%，CD8+T细胞占CD3+T细胞的30-45%。
2. B细胞亚群：CD19+B细胞占外周血淋巴细胞的10-20%。
3. NK细胞亚群：CD16+/CD56+细胞占外周血淋巴细胞的5-15%。
1. 实验结果表明，本实验成功检测了T细胞、B细胞和NK细胞亚群，验证了流式细胞术在淋巴细胞亚群检测中的应用价值。
2. 淋巴细胞亚群在免疫调节中发挥重要作用。
CD4+T细胞具有辅助功能，参与细胞免疫和体液免疫；CD8+T细胞具有杀伤功能，直接杀伤病毒感染细胞和肿瘤细胞；B细胞产生抗体，参与体液免疫；NK细胞具有天然杀伤功能，对病毒感染细胞和肿瘤细胞具有杀伤作用。
流式细胞术检测淋巴细胞亚群操作规程
流式细胞术检测淋巴细胞亚群操作规程一、编号：JS0604二、标题：流式细胞术检测淋巴细胞亚群操作规程三、关键词：流式细胞术淋巴细胞操作规程四、目的：规范流式细胞术检测淋巴细胞亚群的实验操作五、背景知识：T细胞亚群变化的临床意义主要表现在肿瘤、自身免疫性疾病中。
在感染性疾病中，因为CD4+ T细胞是辅助、诱导T细胞的标志，CD4+ T 细胞下降常见于某些病毒感染性疾病，如AIDS、巨细胞病毒感染、瘤型麻风。
而CD4+ T细胞长期低于正常水平，常提示患者易于被病毒等微生物侵袭。
CD8+是抑制、杀伤T细胞的标志，在传染性单核细胞增多症、巨细胞病毒感染、慢性乙型肝炎等感染性疾病中，CD8+ T细胞常升高。
CD4+／CD8+细胞比值下降，除肿瘤等疾病外，常见于AIDS、瘤型麻风、传染性单核细胞增多症、巨细胞病毒感染、血吸虫病等。
六、原理：利用不同荧光物质标记的抗CD3、CD4、CD8单克隆抗体，与待测成分作用，然后上流式细胞仪检测待测细胞。
待测细胞随流动室内的流动鞘液排列成单列，一个个迅速通过激光聚焦区，激光在对每个细胞进行照射时可同时得到前向角散射和侧向角散射2种散射光以及激发荧光标记物质发出的信号，利用这些信号，可计算出CD3+、CD4+、CD8+的相对含量，从而得出各细胞群的相对比值。
七、仪器设备和材料：肝素抗凝静脉血1ml，不同荧光素标记的抗CD3、CD4、CD8单克隆抗体，同型阴性对照荧光物，溶血剂，固定剂，流式细胞仪。
八、操作步骤1、100μ1抗凝血加20μl荧光单克隆抗体，同时做阴性对照。
2、避光室温作用20min，溶去红细胞后，固定剂固定。
3、上流式细胞仪测定，以阴性对照测出本底参数，调节荧光补偿，设定阳性参数值，软件将计算出阳性表达细胞比例。
九、注意事项1、为保证所得结果的可靠性，每次试验前应以标准荧光微球检测仪器的变异系数。
2、每次应做阴性对照、阳性对照、正常对照、质控对照，以确保将各种试剂及操作过程对结果的影响降至最低。
小鼠T淋巴细胞亚群（CD3,CD4,CD8）酶联免疫分析（
小鼠T淋巴细胞亚群（CD3,CD4,CD8）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定小鼠血清，血浆，组织液及相关液体样本中T淋巴细胞亚群（CD3,CD4,CD8）的含量。
实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠T淋巴细胞亚群（CD3,CD4,CD8）水平。
用纯化的小鼠T淋巴细胞亚群（CD3,CD4,CD8）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入T淋巴细胞亚群（CD3,CD4,CD8），再与HRP标记的T淋巴细胞亚群（CD3,CD4,CD8）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的T淋巴细胞亚群（CD3,CD4,CD8）呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中小鼠T淋巴细胞亚群（CD3,CD4,CD8）浓度。
试剂盒组成：样本处理及要求：1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。
3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
胸腹水、脑脊液参照实行。
4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。
通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
淋巴细胞亚群绝对计数操作流程
淋巴细胞亚群绝对计数操作流程英文回答：Lymphocyte Subset Absolute Count Protocol.Principle:Lymphocyte subset absolute count is a quantitative analysis of lymphocyte subpopulations, such as CD3+, CD4+, CD8+, and CD19+ cells, in a blood sample. This procedure is used to assess the immune system's composition and function, particularly in conditions involving immune dysregulationor infection.Materials:Blood sample.Flow cytometry analyzer.Fluorochrome-conjugated antibodies specific for lymphocyte subpopulations.Lysis buffer.Wash buffer.Absolute counting beads.Procedure:1. Sample Preparation:Collect a blood sample into a tube containing an anticoagulant.Centrifuge the blood sample at 300 x g for 10 minutes.Remove the plasma and wash the cells with PBS.Lyse the red blood cells with lysis buffer.Centrifuge the cells and resuspend them in wash buffer.2. Antibody Staining:Aliquot the cells into tubes.Add fluorochrome-conjugated antibodies specificfor each lymphocyte subpopulation.Incubate the cells at room temperature in the dark for 15-30 minutes.3. Washing:Wash the cells twice with wash buffer.Centrifuge the cells and resuspend them in wash buffer.4. Absolute Count:Add absolute counting beads to the cell suspension.Acquire a flow cytometry data file.Gate on the lymphocyte population using forwardand side scatter.Use the absolute counting beads to calculate the absolute count of each lymphocyte subpopulation.Calculation:The absolute count of each lymphocyte subpopulation is calculated using the following formula:Absolute Count = (Event Count / Number of Beads) x (Bead Concentration)。
T细胞亚群的检测 —免疫荧光法
T细胞亚群的检测—免疫荧光法【申请单】请完成申请单所要求项目×××市人民医院检验申请单姓名性别年龄门诊号住院号诊断或症状检验标本检验目的送检科室医师送检日期年月日【方法选择】表1-1 T细胞亚群的检测方法方法流式细胞术免疫荧光法AP-AAP桥联酶免疫法√本次检查选择【材料准备】1.抗CD McaB、兔抗鼠IgG荧光抗体。
2.受检者肝素（或EDTA）抗凝静脉血。
3.含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液。
4.细胞分离液。
5.细胞计数板。
6.离心机、落射荧光显微镜。
【操作方法】1.取肝素抗凝血1.5ml，与等量生理盐水混匀，轻轻叠加在3ml细胞分离液上，转速2000r/min离心，离心时间20min。
吸取单个核细胞层（PBMC），用RPMI1640培养液洗涤，1000r/min离心2次，每次10min.弃上清，加入RPMI1640培养液，配成5×106/ml细胞悬液。
2.按厂家说明稀释抗CD McaB至工作浓度，取0.1ml，加等量步骤1制好的细胞悬液，混匀后，4℃下静置45min。
离心弃上清，再用洗2次，弃上清；3.配制合适浓度兔抗鼠IgG荧光抗体，取0.1ml加入步骤2制好的沉淀细胞中混匀，4℃下静置30min，用RPMI 1640培养液洗涤，800r/min离心3min，共洗3次。
吸弃大部分上清液，混匀沉淀细胞，滴于细胞计数板后荧光显微镜下观察。
【观察结果】在落射荧光显微镜下进行观察，计数200细胞，以荧光强度≥2为阳性，计算阳性细胞百分比率。
【注意事项】1.严格按厂家说明书配置工作浓度试剂。
2.注意控制实验环境温度。
3.按顺序加入试剂，按操作规程进行操作，避免造成误差。
4.检测完毕后应仔细核对、记录、避免笔误。
5.不同的检测方法结果参考值有区别，参考区间为：CD3+细胞：（71.5±6.2）％或65-80％，CD3+CD4+细胞：45.7±5.3％，CD3+CD8+细胞：27.9±5.0％，CD4+/CD8+:1.66±0.33。
实用McAb-A-E直接法检验T淋巴细胞亚群实验操作步骤量化控制研究
实用McAb-A-E直接法检验T淋巴细胞亚群实验操作步骤量化控制研究姚伯程;庞洁;王芳;田彩平;李永辉;魏敏;毛爱红;包晓玲【期刊名称】《国际检验医学杂志》【年(卷),期】2015(036)002【摘要】目的对单克隆抗体SPA红细胞花环法(McAb-A-E)直接法试验操作步骤进行量化控制,从而对原方法进行改良.方法采用改良法与原方法对23例患者外周血中的淋巴细胞表面抗原CD3+、CD4+、CD8+进行检测,并用配对t检验对两种方法的结果进行对比.改良法的量化控制主要是用一定容积的移液器混匀替代“轻轻摇匀”,以定量细胞悬液制作一定面积涂片,规范涂片细胞计数区域.结果改良法与原方法检测的CD3+、CD4+、CD8+及CD4+与CD8+的比值(CD4+/CD8+)结果比较差异均无统计学意义(P＞0.05).结论改良后的实用McAb-A-E直接法对细胞悬液混匀方法、细胞涂片制作和细胞计数区域进行了量化控制,可将试验操作误差降到最低.【总页数】2页(P157-158)【作者】姚伯程;庞洁;王芳;田彩平;李永辉;魏敏;毛爱红;包晓玲【作者单位】甘肃省医学科学研究院分子生物学研究中心,甘肃兰州730050;甘肃省肿瘤医院检验科,甘肃兰州730050;甘肃省医学科学研究院分子生物学研究中心,甘肃兰州730050;甘肃省医学科学研究院分子生物学研究中心,甘肃兰州730050;甘肃省医学科学研究院转化医学中心,甘肃兰州730050;甘肃省肿瘤医院内镜中心,甘肃兰州730050;甘肃省医学科学研究院分子生物学研究中心,甘肃兰州730050;甘肃省肿瘤医院内科,甘肃兰州730050【正文语种】中文【相关文献】1.T淋巴细胞亚群检验血标本在18～28℃温室或4℃冰箱过夜与当日标本检验结果对比研究 [J], 姚伯程;王芳;田彩平;包晓玲;李永辉;庞洁2.实用McAb-A-E直接法检验T淋巴细胞亚群细胞计数误差研究 [J], 姚伯程3.EDTA抗凝剂在实用McAb-A-E直接法中的应用研究 [J], 郗爱华;田文斌;姚伯程4.实用McAb-A-E直接法检验T淋巴细胞亚群PBMC细胞自然形态保存研究 [J], 姚伯程;田彩平;赵晓玲;马佰菁;时海英5.实用McAb-A-E直接法在诊断血液性疾病细胞免疫功能中的应用 [J], 王红洲;姚伯程因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
淋巴细胞亚群检测操作程序
一、目的：保证流式细胞仪检测外周血中淋巴细胞亚群检验的工作质量，旨在保证淋巴细胞亚群检测的标准操作程序和控制检测结果的精确度与准确度。
二、修改程序：本标准操作程序的改动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：质量主管、授权人（科主任），方可改动。
三、适用范围：外周血中淋巴细胞亚群检测。
四、溯源：MultiTEST IMK Kit(美国BD Biosciences公司；CAT:340503)。
五、实验原理：人的淋巴细胞根据其生物功能和细胞表面抗原的表达可分为三大类：T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK自然杀伤细胞。
T淋巴细胞表达CD3；B淋巴细胞表达CD19；NK自然杀伤细胞表达CD56或CD16，并且不表达CD3。
利用各种单克隆抗体与淋巴细胞表面抗原结合，再配多色荧光染料，即可以把淋巴细胞区分为各种亚型。
进面得到各亚群的比例。
六、主要试剂：MultiTEST IMK Kit(美国BD Biosciences公司；CAT:340503)，其中包括：1、CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PreCP/CD4-APC2、CD3-FITC/CD16+56-PE/CD45-PreCP/CD19-APC3、FACSLysing Solution七、实验操作：抗凝真空采血管，抽取静脉血2ml。
1、标本采集：使用EDTA-K22、染色和固定细胞：（1）标本管编号A，取两只流式专用管A1、A2。
（2） A1管加入CD3-FITC/CD16+56-PE/CD45-PreCP/CD19-APC 20uL；A2管加入CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PreCP/CD4-APC 20Ul。
（3） A1、A2管中分别再加入全血100Ul，混均。
（4）置室温，避光孵育15min。
（5）加入FACSLysing溶血液2.0ml，置室温，避光孵育10min。
（6） 300g离心5min，弃上清液。
（7） PBS洗涤细胞两次，300g离心5min，弃上清液。
t淋巴细胞斑点试验操作流程
t淋巴细胞斑点试验操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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一、目的：
保证流式细胞仪检测外周血中T淋巴细胞亚群检验的工作质量，旨在保证正确的T淋巴细胞亚群检测标准操作程序和控制检测结果的精确度与准确度。
二、修改程序：
本标准操作程序的改动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：质量主管、授权人（科主任），方可改动。
三、适用范围：
外周血中T淋巴细胞亚群的绝对计数检测。
四、实验原理：
人的T淋巴细胞根据其生物功能和细胞表面抗原的表达可分为二大类：辅助/诱导T细胞和抑制/细胞毒T细胞。
辅助/诱导T淋巴细胞表达CD3和CD4；抑制/细胞毒T细胞表达CD3和CD8。
利用各种单克隆抗体与淋巴细胞表面抗原结合，再配多色荧光染料以及绝对计数管，即可以把T淋巴细胞区分为两种亚型，进面得到各亚群的绝对值。
六、主要试剂：
CD4-FITC／CD8-PE／CD3-APC／CD45-PC7 (美国BCs公司；CAT:IM3548)，
七、实验操作：
1、标本采集：使用EDTA-K2抗凝真空采血管，抽取静脉血2ml。
2、染色和固定细胞：
（1）标本管编号A，取一只流式专用管A1。
（2）A1管加入CD4-FITC／CD8-PE／CD3-APC／CD45-PC7 20ul。
（3）A1管中再加入全血100ul，混均。
（4）置室温，避光孵育15min。
（5）加入FACSLysing溶血液2.0ml，置室温，避光孵育10min。
（6）300g离心5min，弃上清液。
（7）PBS洗涤细胞两次，300g离心5min，弃上清液。
3、上机检测；分析结果；打印实验报告。
八、参考值：
总T细胞（CD3+）：59.4-84.6
辅助/诱导T细胞(CD3+CD4+): 28.5-60.5
抑制/细胞毒T细胞(CD3+CD8+): 11.1-38.3
Th/Ts: 0.9-3.6
九、临床意义：
T淋巴细胞可以分为辅助/诱导T细胞和抑制/细胞毒T细胞。
测定CD4和CD8可用于化疗、自身免疫病的免疫监视。
在造血干细胞移植患者中，CD4+细胞恢复晚于CD8+细胞，导致Th/Ts比例显著下降。
HIV及某些病毒感染（EB病毒、SARS病毒等）患者Th/Ts比例也下降显著。
十、质量控制：
1、先用标准微球调整仪器，正确设置电压、补偿。
2、健康人CD4+细胞加CD8+细胞总数应大约等于CD3总数；免疫病、淋
巴瘤可能有较大差异。
3、收集细胞太少（少于500个）、碎片污染太多（超过10%）、门中淋巴细
胞不纯（小于90%）可能引起实验结果不正确。
4、建议使用逻辑设门方法（CD45-SSC设门与FSC-SSC设门）减少杂质的
干干扰。