流式淋巴细胞亚群检测技术原理
淋巴细胞亚群测定
1检验目的检测机体细胞免疫功能的重要指标，且对某些疾病（如自身免疫病、免疫缺陷病、恶性肿瘤、血液病、变态反应性疾病等）的辅助诊断，分析发病机制，观察疗效及监测预后有重要意义。
2 检验方法和原理2.1 方法：流式细胞术2.2 原理：在含有准确数量荧光计数微球的试管(如BD TruCount)中，加入一定体积的抗凝血液和六色荧光素标记的单克隆抗体进行免疫荧光染色，按溶血／免洗方法进行流式细胞仪检测，以CD45／SSC设定淋巴细胞门，应用FACS Canto软件自动进行多重逻辑设门和统计分析数据，可以准确计数血液中淋巴细胞亚群的绝对数量。
3 原始样本种类3.1 样本类型：KEDTA抗凝静脉血样本。
2EDTA或肝素抗3.2 样本容器：盛放样本的容器为洁净的一次性真空采血管（K2凝）。
3.3 样本保存：抽取样本后置于加有抗凝剂（一般选择EDTA或肝素）的试管中，室温（20-25℃）保存，尽量于采血后48小时内处理样本；标记后的样本最好在24小时内完成上机检测。
4设备和试剂4.1 设备名称：BD FACS Canto II流式细胞仪型号：Canto II厂家：美国BD公司4.2 试剂4.2.1 主要试剂本实验采用BD公司的试剂。
4.2.1.1 BD MultiTEST 6-color TBNK Reagent货号：337166规格：1ml厂家：美国BD公司储存条件：2-8℃避光保存，在试剂盒标识的有效期前使用。
只有相同批号的各种成分才能相互混用。
4.2.1.2 绝对计数管（TruCOUNT Tubes）货号：340334规格：25tubes/盒厂家：美国BD公司储存条件：2-25℃避光保存，在试剂盒标识的有效期前使用。
TruCOUNT Tubes 从冰箱拿出后需平衡至室温，方可打开包装袋。
每次用前，需要检查包装袋内的干燥剂，如果由蓝色变成粉色，则TruCOUNT Tubes不能继续使用。
4.2.1.3 溶血素Lysing Solution（10X Concentrate）货号：349202规格：100mL厂家：美国BD公司储存条件：2-8℃避光保存，在试剂盒标识的有效期前使用。
流式细胞术检测淋巴细胞亚群操作规程
流式细胞术检测淋巴细胞亚群操作规程一、编号：JS0604二、标题：流式细胞术检测淋巴细胞亚群操作规程三、关键词：流式细胞术淋巴细胞操作规程四、目的：规范流式细胞术检测淋巴细胞亚群的实验操作五、背景知识：T细胞亚群变化的临床意义主要表现在肿瘤、自身免疫性疾病中。
在感染性疾病中，因为CD4+ T细胞是辅助、诱导T细胞的标志，CD4+ T 细胞下降常见于某些病毒感染性疾病，如AIDS、巨细胞病毒感染、瘤型麻风。
而CD4+ T细胞长期低于正常水平，常提示患者易于被病毒等微生物侵袭。
CD8+是抑制、杀伤T细胞的标志，在传染性单核细胞增多症、巨细胞病毒感染、慢性乙型肝炎等感染性疾病中，CD8+ T细胞常升高。
CD4+／CD8+细胞比值下降，除肿瘤等疾病外，常见于AIDS、瘤型麻风、传染性单核细胞增多症、巨细胞病毒感染、血吸虫病等。
六、原理：利用不同荧光物质标记的抗CD3、CD4、CD8单克隆抗体，与待测成分作用，然后上流式细胞仪检测待测细胞。
待测细胞随流动室内的流动鞘液排列成单列，一个个迅速通过激光聚焦区，激光在对每个细胞进行照射时可同时得到前向角散射和侧向角散射2种散射光以及激发荧光标记物质发出的信号，利用这些信号，可计算出CD3+、CD4+、CD8+的相对含量，从而得出各细胞群的相对比值。
七、仪器设备和材料：肝素抗凝静脉血1ml，不同荧光素标记的抗CD3、CD4、CD8单克隆抗体，同型阴性对照荧光物，溶血剂，固定剂，流式细胞仪。
八、操作步骤1、100μ1抗凝血加20μl荧光单克隆抗体，同时做阴性对照。
2、避光室温作用20min，溶去红细胞后，固定剂固定。
3、上流式细胞仪测定，以阴性对照测出本底参数，调节荧光补偿，设定阳性参数值，软件将计算出阳性表达细胞比例。
九、注意事项1、为保证所得结果的可靠性，每次试验前应以标准荧光微球检测仪器的变异系数。
2、每次应做阴性对照、阳性对照、正常对照、质控对照，以确保将各种试剂及操作过程对结果的影响降至最低。
淋巴细胞亚群检测报告怎样看懂？
淋巴细胞亚群检测报告怎样看懂？淋巴细胞是一种包括T细胞、B细胞和自然杀伤细胞等多个亚群的白细胞，它们各自具备不同的免疫作用，协同工作来维护机体免疫平衡和抵御外部侵害。
淋巴细胞亚群检测可以帮助医生了解不同亚群的数量和比例，从而判断免疫系统是否受到影响，同时也能够为一些免疫相关疾病的诊断提供重要参考依据。
在本文中，我们将详细介绍淋巴细胞亚群检测报告中的各项指标含义及其正常值范围，希望能够帮助您更好地理解和解读检测结果。
1.淋巴细胞亚群是如何检测淋巴细胞亚群的检测通常采用流式细胞术、荧光素标记技术等方法。
流式细胞术是一种通过测量单个细胞的光学和物理特性来分析淋巴细胞亚群的数量和比例的技术。
通过将淋巴细胞标记上荧光素等物质，然后把标记的淋巴细胞注入流式细胞术仪中，利用激光束照射、散射、荧光及电导等特性检测并分析细胞的类型、数量、活性等参数，从而识别出各类淋巴细胞亚群。
而荧光素标记技术则是一种在淋巴细胞前处理过程中进行标记的技术，该技术可将淋巴细胞分类并标记在表面（例如用荧光标记）后，再使用流式细胞仪来测量并分析淋巴细胞亚群的数量、活性以及分布情况等。
这些检测方法都是无创的、准确度较高、操作简便、结果可靠，已经成为临床上常用的检测手段之一。
1.淋巴细胞亚群检测的临床意义2.1 评估机体免疫功能淋巴细胞是机体免疫系统中最重要的细胞类型之一，在免疫应答中发挥着重要作用。
淋巴细胞亚群检测可以对机体免疫功能进行全面评估，了解机体是否有免疫功能障碍或免疫力下降等问题。
2.2 辅助诊断病情淋巴细胞亚群检测可以帮助医生判断感染性疾病的类型及病情轻重，如通过测定CD4+ T细胞数目，可以确定HIV感染者的病情进展及治疗效果；通过测定CD8+ T细胞数目，可以推测病毒性肝炎等疾病的病情程度。
2.3 指导免疫治疗方案针对某些自身免疫性疾病例如系统性红斑狼疮、类风湿关节炎等，淋巴细胞亚群检测可以帮助医生选择合适的免疫调节治疗方案。
流式检测淋巴细胞亚群在临床中的应用
平均值
CD3+ CD4+ CD8+ CD4+/8+ CD56+ CD127+ CD19+
化疗(n=48) 67.60 27.40 28.20 0.82 13.20 7.40 5.80
放疗(n=81) 65.30 22.30 34.10 0.73 5.90 8.10 6.90
手术(n=82) 65.20 34.00 29.00 1.20 9.10 6.30 7.70
p值
0.311 0.007 0.035 0.032 0.045 0.031 0.165
* t检验：P<0.05 显著性差异
手术、化疗和放疗对肺癌患者淋巴细胞亚群的影响
平均值
CD3+ CD4+ CD8+ CD4+/8+ CD56+ CD127+ CD19+
手术 (n=152) 67.57 34.39 31.09 1.25 16.08 6.42 8.64
化疗(n=244) 67.67 33.78 32.07 1.30 16.27 7.48 7.93
放疗(n=164) 65.64 28.59 32.99 1.13 17.98 5.85 6.58
p值
0.093 0.001 0.021 0.011 0.045 0.029 0.430
* t检验：P<0.05 显著性差异
2、流式专业讲座：流式相关免疫学、流式相关血 液学、流式相关其他实验。
3、临床流式疑难病例解答：临床在职流式专家为 您解决临床检测中遇到的疑难病例问题，帮您更好 的做出诊断。
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淋巴细胞亚群检测及临床应用
一、概述
二、淋巴细胞亚群检测
1、检测原理
• 把全血加入到试剂中时，荧光标记的抗体会和白细胞表面抗原特异性结合，在采集 时，细胞通过激光束使激光散射。被染色的细胞就会发出荧光。这些被仪器检测到 的散射光和荧光信号提供了关于细胞大小、内部复杂度和相关荧光强度等信息。 BD Multitest检测试剂采用了荧光触发技术，能够直接对淋巴细胞群进行荧光设门， 以减少门中的未裂解细胞或有核红细胞带来的污染。
射光照射。于室温下(20-25℃)进行此程序操作 • 盖上管盖并轻轻混匀振荡进行混匀。室温(20-25℃)环境下避光孵育15min上
机检测。
二、淋巴细胞亚群检测
3、操作步骤-品牌B（六色淋巴细胞亚群试剂）
• 取一支 Trucounttube。用反向加样法加入50μl充分混匀的抗凝全血。注意血 不要碰到试管底部的微球( Beads)。
液时，将按钮按至第二个刻度点。释放按钮时，过量样本将被吸入吸头中。 将按钮按至第一个刻度点排出精确体积的样本，将过量样本留在吸头中。
二、淋巴细胞亚群检测
3、操作步骤-品牌B（四色淋巴细胞亚群试剂）
• 盖上管盖并轻轻混匀振荡进行混匀。在室温(20~25℃)环境下避光孵育 • 向各管中添加450μl 1× Multitest溶血素，注意：小心保护样本管，免受直
不能使用。室温保存的抗凝全血，可稳定48h;染色固定后的样本在2~8℃条 件下可稳定24h。 • 患者准备：无须特殊准备，检查对象生活饮食处于日常状态，空腹为宜， 静脉采血。
二、淋巴细胞亚群检测
3、操作步骤-品牌A
流式淋巴细胞亚群检测技术原理
T4细胞 CD3+CD4+CD8-
T8细胞 CD3+CD8+CD4-
B细胞 CD3-CD19+
NK细胞 CD3-CD（16+56）+
流式淋巴细胞亚群检测技术原理
总T细胞增高
提示体内的T细胞免疫功能增强 见于临床某些自身免疫性疾病（如SLE）、重症肌无力、
慢性活动性肝炎、甲状腺功能亢进、淋巴细胞性甲状腺炎、 器官移植排斥反应、T细胞性白血病等
流式淋巴细胞亚群检测技术原理
检测原理
免疫荧光染色主要有两种方法。间接标记的方法难以进 行多色标记，而且操作复杂，所以一般首选直接荧光染 色
荧光抗体
第一抗体
荧光二抗
Байду номын сангаас
直接标记
间接标记
流式淋巴细胞亚群检测技术原理
常用荧光素
<499nm 蓝色荧光（Blue） 500-549nm，绿色荧光（Green） 550-584nm，黄色荧光（Yellow） 585-615nm，橙色荧光（Orange） 616-700nm，红色荧光（Red） ≥700nm，远红外荧光（Far-Red）
流式淋巴细胞亚群检测技术原理
T4/T8细胞比值增高
是T4淋巴细胞增高或T8淋巴细胞减少所致 见于某些自身免疫性疾病，如SLE、多发性硬化、器官移
植排斥反应、自身免疫性溶血性贫血等
流式淋巴细胞亚群检测技术原理
T4/T8细胞比值降低
是T4细胞减少或T8细胞增高所致 见于艾滋病、再生障碍性贫血、某些白血病、传染性单核
低的一个范围内。 需要经常性监测受者的免疫功能，T4/T8细胞比值是非常
好的一个监测指标 当受者T4/T8细胞比值出现小于0.2的情况时，必须立即停
流式细胞仪原理及操作步骤
流式细胞仪原理及操作步骤流式细胞仪（FCM）是八十年代集单克隆抗体、荧光化学、激光、计算机等高技术发展起来的一种先进仪器，已广泛应用于免疫学、生物化学、生物学、肿瘤学以及血液学等方面的研究和临床常规工作。
其中检测人白细胞表面标志可对白血病、淋巴瘤作用迅速正确的诊断，对淋巴细胞群和亚群进行精确分类，还能分离纯化某一群或亚群细胞。
活细胞免疫荧光技术是用于FCM检测的标本准备，染色后也能在荧光显微镜下进行观察，在某些实验条件下，活细胞免疫荧光染色后的特异性和敏感性要优于滴片固定的常规间接免疫荧光的结果。
（一）原理一活细胞表面保留有较完整的抗原或受体，先用特异性鼠源性单克隆抗体与细胞表面相应抗原结合，再用荧光标记的第二抗体结合，根据所测定的荧光强度和阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。
（二）操作步骤制备活性高的细胞悬液（培养细胞系、外周血单个核细胞、胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法）用10% FCS RPMI1640调整细胞浓度为5X 106〜IX 107/ ml取40卩1细胞悬液加入预先有特异性McAb（5〜50卩I）的小玻璃管或塑料离心管，再加50卩I 1 : 20（用DPBS（或兔抗鼠）荧光标记物，充分振摇J 4 C 30mi n用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右1000rpmx 5mi nJ]加适量固定液（如为FCM制备标本，一般加入1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，视细胞浓度加入100〜500 ^1固定液）FCM检测或制片后荧光显微镜下观察（标本在试管中可保存5〜7天）（三）试剂和器材1. 各种特异性单克隆抗体。
2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。
3. 10% FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液（见附录）。
4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。
I （四）注意事项1. 整个操作在4C下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN3,上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。
淋巴细胞亚群流式细胞学检查
淋巴细胞亚群流式细胞学检查
淋巴细胞亚群流式细胞学检查是一种检测淋巴细胞亚群的方法。
淋巴细胞是免疫系统的重要组成部分，包括T细胞、B细胞和自然杀伤细胞等亚群。
这些亚群在免疫应答中发挥着不同的作用。
流式细胞学是一种可靠的检测淋巴细胞亚群的方法。
在流式细胞学中，通过利用细胞表面分子的不同表达，将淋巴细胞分成不同的亚群。
利用荧光标记的抗体，可以快速、准确地检测出特定亚群的淋巴细胞。
淋巴细胞亚群流式细胞学检查可以用于评估免疫功能、诊断免疫相关疾病、监测疾病治疗效果等方面。
常见的淋巴细胞亚群包括CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、B细胞、NK细胞等。
其中，CD4+ T细胞是免疫系统的主要调节细胞，其数量和功能状态对于正常免疫系统的维持至关重要。
总之，淋巴细胞亚群流式细胞学检查是一种重要的免疫学检查方法，可以为临床诊断和治疗提供可靠的参考依据。
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精选文本
11
检测目的
功能
数量
1
相互协作 共同参与
比例
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12
T、B细胞相互作用
精选文本
13
精选文本
14
主要检测项目
T4细胞 总T细胞
T8细胞
淋巴细胞
B细胞 NK细胞
精选文本
15
淋巴细胞的免疫标志
总T淋巴细胞 CD3+
T4细胞 CD3+CD4+CD8-
T8细胞 CD3+CD8+CD4-
B细胞 CD3-CD19+
性细胞免疫缺陷、艾滋病、多发性骨髓瘤、传染性单核细 胞增多症，以及过劳等造成机体免疫功能处于相对较低的 其他一些情况
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18
T 细胞的三个功能性亚群
效应分子
亚群 TCR 配体 作用靶目标
表面表达
分泌性应答类型源自CD4+ 抗原肽+ Th1 II 类分子
CD4+ 抗原肽+ Th2 II 类分子
胞内感染的 CD40L IFN-, GM-CSF, TNF- 细胞免疫 巨噬细胞 FasL IL-3, TNF-, IL-2
抗原特异性 CD40L IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, 体液免疫
B 细胞
GM-CSF, TGF-
CD8+ 抗原肽+ 感染病毒的 FasL 穿孔素, 粒酶，IFN-, -细胞免疫
CTL I 类分子 靶细胞
TNF-, TNF-
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19
精选文本
20
T4细胞增高
提示体内存在细菌等病原微生物感染，主要见于临床各种 细菌性感染性疾病。
CD45-FITC CD4-RD1 CD8-ECD CD3-PC5
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10
联合CD45的四色方案
第二种是用CD45/CD3/CD19/CD16和（或）CD56做第二管的 标记，用于检测T3细胞、B细胞和NK细胞
CD45-FITC CD56-RD1 CD19-ECD CD3-PC5
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5
检测原理
免疫荧光染色主要有两种方法。间接标记的方法难以进 行多色标记，而且操作复杂，所以一般首选直接荧光染 色
荧光抗体
第一抗体
荧光二抗
直接标记
间接标记
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6
常用荧光素
<499nm 蓝色荧光（Blue） 500-549nm，绿色荧光（Green） 550-584nm，黄色荧光（Yellow） 585-615nm，橙色荧光（Orange） 616-700nm，红色荧光（Red） ≥700nm，远红外荧光（Far-Red）
淋巴细胞亚群检测
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1
目录
1 淋巴细胞的分类 2 淋巴细胞亚群检测方法 3 淋巴细胞亚群检测原理 4 淋巴细胞亚群的免疫功能 5 淋巴细胞亚群的临床意义
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2
淋巴细胞的分类
细胞免疫 T淋巴细胞
体液免疫 B淋巴细胞
淋巴细胞占外周血白细胞总数的20%-40%
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固有免疫 NK细胞
3
检测方法
器官移植发生排斥反应 支气管哮喘 SLE活动期 某些免疫增强药物的有效结果 注意:昼夜变化（傍晚的峰值可为上午的两倍）
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T4细胞降低
提示体内存在病毒等病原微生物，主要见于临床各种病毒 感染性疾病，以HIV感染时减少最为明显
T4细胞减少也可见于γ免疫球蛋白缺乏症、胸腺发育不良 、严重联合免疫缺陷病、严重创伤、大手术等
采用流式细胞术（FCM） 是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个
细胞(或生物学颗粒)的理化特性进行多参数定量分析和分 选的技术
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4
FCM
检测对象：单细胞悬液或生物颗粒； 检测参数：多参数； 检测特点：单细胞水平分析； 检测速度：高速，最高达上万个细胞/秒； 检测结果：精度高、准确性好； 可对目标细胞进行分选；
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T4/T8细胞比值临床意义
器官移植受者免疫功能监测 个体化免疫治疗疗效判断 受者需要的是一种恰当的免疫抑制，将免疫功能控制在较
低的一个范围内。 需要经常性监测受者的免疫功能，T4/T8细胞比值是非常
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22
T8细胞
主要功能：特异性直接杀伤靶细胞 两条途径：一是分泌穿孔素、颗粒酶及淋巴毒素
等直接杀伤靶细胞 二是通过Fas/FasL途径诱导细胞凋亡。
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23
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24
杀伤特点： 连续性杀伤 特异性杀伤 MHC限制性
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25
T8细胞增高
提示体内存在病毒或胞内寄生菌等病原微生物感染 主要见于HIV、HBV、CMV、EB等病毒感染 也可见于结核杆菌感染等
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26
T8细胞降低
移植排斥反应 可见于γ免疫球蛋白缺乏症 胸腺发育不良 严重联合免疫缺陷病 糖尿病等
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27
T4/T8细胞比值增高
是T4淋巴细胞增高或T8淋巴细胞减少所致 见于某些自身免疫性疾病，如SLE、多发性硬化、器官移
植排斥反应、自身免疫性溶血性贫血等
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28
T4/T8细胞比值降低
NK细胞 CD3-CD（16+56）+
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16
总T细胞增高
提示体内的T细胞免疫功能增强 见于临床某些自身免疫性疾病（如SLE）、重症肌无力、
慢性活动性肝炎、甲状腺功能亢进、淋巴细胞性甲状腺炎、 器官移植排斥反应、T细胞性白血病等
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17
总T细胞降低
提示体内的T细胞免疫功能减弱 见于某些白血病、应用免疫抑制剂药、放疗过程中、先天
是T4细胞减少或T8细胞增高所致 见于艾滋病、再生障碍性贫血、某些白血病、传染性单核
细胞增多症、免疫缺陷综合征、某些病毒感染、恶性肿瘤 、结核病等 一般来说，导致T4/T8比值倒置，以全身性、侵袭和破坏 机体免疫系统的感染引起的倒置变化幅度最大 临床抗感染治疗有效时，可以观察T4/T8细胞比值的逐步 恢复
精选文本
7
常用荧光素
荧光素分子 FITC PE PerCP APC PE-Cy5 PE-Cy7
激发光波长 （nm）
488 488 490 633 488 488
发射光波长 （nm）
525 575 675 660 670 755
中文名 异硫氰酸荧光素 藻红蛋白 多甲藻叶绿素蛋白 别藻青蛋白 藻红蛋白-花青素5 藻红蛋白-花青素7
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8
免疫荧光染色
FCM可检测下列细胞成分：
表面标记物
胞浆标记物 核内标记物
核内抗原
可溶性成分
黏附因子
表面受体
精选文本
分泌到胞外的 细胞因子
细胞因子 核酸含量
胞内抗原
9
联合CD45的四色方案
第一种是用CD45/CD3/CD4/CD8做四色标记，主要可以检测 T3细胞、T4细胞、T8细胞这三种不同的亚群