流式淋巴细胞亚群检测技术原理
淋巴细胞亚群测定
1检验目的检测机体细胞免疫功能的重要指标，且对某些疾病（如自身免疫病、免疫缺陷病、恶性肿瘤、血液病、变态反应性疾病等）的辅助诊断，分析发病机制，观察疗效及监测预后有重要意义。
2 检验方法和原理2.1 方法：流式细胞术2.2 原理：在含有准确数量荧光计数微球的试管(如BD TruCount)中，加入一定体积的抗凝血液和六色荧光素标记的单克隆抗体进行免疫荧光染色，按溶血／免洗方法进行流式细胞仪检测，以CD45／SSC设定淋巴细胞门，应用FACS Canto软件自动进行多重逻辑设门和统计分析数据，可以准确计数血液中淋巴细胞亚群的绝对数量。
3 原始样本种类3.1 样本类型：KEDTA抗凝静脉血样本。
2EDTA或肝素抗3.2 样本容器：盛放样本的容器为洁净的一次性真空采血管（K2凝）。
3.3 样本保存：抽取样本后置于加有抗凝剂（一般选择EDTA或肝素）的试管中，室温（20-25℃）保存，尽量于采血后48小时内处理样本；标记后的样本最好在24小时内完成上机检测。
4设备和试剂4.1 设备名称：BD FACS Canto II流式细胞仪型号：Canto II厂家：美国BD公司4.2 试剂4.2.1 主要试剂本实验采用BD公司的试剂。
4.2.1.1 BD MultiTEST 6-color TBNK Reagent货号：337166规格：1ml厂家：美国BD公司储存条件：2-8℃避光保存，在试剂盒标识的有效期前使用。
只有相同批号的各种成分才能相互混用。
4.2.1.2 绝对计数管（TruCOUNT Tubes）货号：340334规格：25tubes/盒厂家：美国BD公司储存条件：2-25℃避光保存，在试剂盒标识的有效期前使用。
TruCOUNT Tubes 从冰箱拿出后需平衡至室温，方可打开包装袋。
每次用前，需要检查包装袋内的干燥剂，如果由蓝色变成粉色，则TruCOUNT Tubes不能继续使用。
4.2.1.3 溶血素Lysing Solution（10X Concentrate）货号：349202规格：100mL厂家：美国BD公司储存条件：2-8℃避光保存，在试剂盒标识的有效期前使用。
流式细胞术检测淋巴细胞亚群操作规程
流式细胞术检测淋巴细胞亚群操作规程一、编号：JS0604二、标题：流式细胞术检测淋巴细胞亚群操作规程三、关键词：流式细胞术淋巴细胞操作规程四、目的：规范流式细胞术检测淋巴细胞亚群的实验操作五、背景知识：T细胞亚群变化的临床意义主要表现在肿瘤、自身免疫性疾病中。
在感染性疾病中，因为CD4+ T细胞是辅助、诱导T细胞的标志，CD4+ T 细胞下降常见于某些病毒感染性疾病，如AIDS、巨细胞病毒感染、瘤型麻风。
而CD4+ T细胞长期低于正常水平，常提示患者易于被病毒等微生物侵袭。
CD8+是抑制、杀伤T细胞的标志，在传染性单核细胞增多症、巨细胞病毒感染、慢性乙型肝炎等感染性疾病中，CD8+ T细胞常升高。
CD4+／CD8+细胞比值下降，除肿瘤等疾病外，常见于AIDS、瘤型麻风、传染性单核细胞增多症、巨细胞病毒感染、血吸虫病等。
六、原理：利用不同荧光物质标记的抗CD3、CD4、CD8单克隆抗体，与待测成分作用，然后上流式细胞仪检测待测细胞。
待测细胞随流动室内的流动鞘液排列成单列，一个个迅速通过激光聚焦区，激光在对每个细胞进行照射时可同时得到前向角散射和侧向角散射2种散射光以及激发荧光标记物质发出的信号，利用这些信号，可计算出CD3+、CD4+、CD8+的相对含量，从而得出各细胞群的相对比值。
七、仪器设备和材料：肝素抗凝静脉血1ml，不同荧光素标记的抗CD3、CD4、CD8单克隆抗体，同型阴性对照荧光物，溶血剂，固定剂，流式细胞仪。
八、操作步骤1、100μ1抗凝血加20μl荧光单克隆抗体，同时做阴性对照。
2、避光室温作用20min，溶去红细胞后，固定剂固定。
3、上流式细胞仪测定，以阴性对照测出本底参数，调节荧光补偿，设定阳性参数值，软件将计算出阳性表达细胞比例。
九、注意事项1、为保证所得结果的可靠性，每次试验前应以标准荧光微球检测仪器的变异系数。
2、每次应做阴性对照、阳性对照、正常对照、质控对照，以确保将各种试剂及操作过程对结果的影响降至最低。
FCM(流式细胞术检测)原理及临床应用
流式细胞术(flow cytometry FCM)是利用流式细 胞仪对单个生物颗粒(红细胞、白细胞、各类组织细 胞、血小板、微生物等)以及人工合成微球的物理和 生物学特性进行多参数定量分析，并能对特定细胞 群体加以分选的分析技术。
FCM的工作原理
流式细胞仪组成：
1.液流系统 2.光学系统 3.数据处理系统
双标记或多标记分析：目前使用的流式细胞仪 能用一个激光束激发检测三色甚至四色荧光信 号。检测时需注意荧光补偿。
常用免疫荧光染料组合
荧光染料 FITC+PE
激发波长 （nm）
488
发射波长（nm） 525、575
颜色 绿色、橙色
FITC+PeCy5
488
525、675
绿色、红色
FITC+ECD
488
实体瘤以多倍体居多；
G0 期：DNA 合成静止期 G1 期：DNA 合成前期 S 期： DNA 合成期 G2 期：DNA 合成后期 M 期： 细胞分裂期
DNA 倍体 2N 2N
2N-4N 4N 4N
DNA非2倍体出现是鉴别良性与恶性肿瘤的特异性指 标:
良性肿瘤和正常组织良性增生不出现DNA非2倍体细 胞而恶性肿瘤常可出现异倍体细胞；
过去认为 FCM测定残存白血病细胞不可靠， 因为现用的 McAb不能鉴别正常血细胞与白血 病细胞。虽然至今尚未发现白血病细胞特异抗 原，但近来有人提出根据白血病细胞的以下特 征， FCM检测的敏感度可明显提高
白血病细胞的某些抗原表达量明显高于相应 的正常血细胞
如小儿ALL，其CDl0+细胞的荧光强度可 高达3-4个对数值，而其 CD45则为弱阳性或 阴性。
525、625
淋巴细胞亚群检测报告怎样看懂？
淋巴细胞亚群检测报告怎样看懂？淋巴细胞是一种包括T细胞、B细胞和自然杀伤细胞等多个亚群的白细胞，它们各自具备不同的免疫作用，协同工作来维护机体免疫平衡和抵御外部侵害。
淋巴细胞亚群检测可以帮助医生了解不同亚群的数量和比例，从而判断免疫系统是否受到影响，同时也能够为一些免疫相关疾病的诊断提供重要参考依据。
在本文中，我们将详细介绍淋巴细胞亚群检测报告中的各项指标含义及其正常值范围，希望能够帮助您更好地理解和解读检测结果。
1.淋巴细胞亚群是如何检测淋巴细胞亚群的检测通常采用流式细胞术、荧光素标记技术等方法。
流式细胞术是一种通过测量单个细胞的光学和物理特性来分析淋巴细胞亚群的数量和比例的技术。
通过将淋巴细胞标记上荧光素等物质，然后把标记的淋巴细胞注入流式细胞术仪中，利用激光束照射、散射、荧光及电导等特性检测并分析细胞的类型、数量、活性等参数，从而识别出各类淋巴细胞亚群。
而荧光素标记技术则是一种在淋巴细胞前处理过程中进行标记的技术，该技术可将淋巴细胞分类并标记在表面（例如用荧光标记）后，再使用流式细胞仪来测量并分析淋巴细胞亚群的数量、活性以及分布情况等。
这些检测方法都是无创的、准确度较高、操作简便、结果可靠，已经成为临床上常用的检测手段之一。
1.淋巴细胞亚群检测的临床意义2.1 评估机体免疫功能淋巴细胞是机体免疫系统中最重要的细胞类型之一，在免疫应答中发挥着重要作用。
淋巴细胞亚群检测可以对机体免疫功能进行全面评估，了解机体是否有免疫功能障碍或免疫力下降等问题。
2.2 辅助诊断病情淋巴细胞亚群检测可以帮助医生判断感染性疾病的类型及病情轻重，如通过测定CD4+ T细胞数目，可以确定HIV感染者的病情进展及治疗效果；通过测定CD8+ T细胞数目，可以推测病毒性肝炎等疾病的病情程度。
2.3 指导免疫治疗方案针对某些自身免疫性疾病例如系统性红斑狼疮、类风湿关节炎等，淋巴细胞亚群检测可以帮助医生选择合适的免疫调节治疗方案。
流式检测淋巴细胞亚群在临床中的应用
平均值
CD3+ CD4+ CD8+ CD4+/8+ CD56+ CD127+ CD19+
化疗(n=48) 67.60 27.40 28.20 0.82 13.20 7.40 5.80
放疗(n=81) 65.30 22.30 34.10 0.73 5.90 8.10 6.90
手术(n=82) 65.20 34.00 29.00 1.20 9.10 6.30 7.70
p值
0.311 0.007 0.035 0.032 0.045 0.031 0.165
* t检验：P<0.05 显著性差异
手术、化疗和放疗对肺癌患者淋巴细胞亚群的影响
平均值
CD3+ CD4+ CD8+ CD4+/8+ CD56+ CD127+ CD19+
手术 (n=152) 67.57 34.39 31.09 1.25 16.08 6.42 8.64
化疗(n=244) 67.67 33.78 32.07 1.30 16.27 7.48 7.93
放疗(n=164) 65.64 28.59 32.99 1.13 17.98 5.85 6.58
p值
0.093 0.001 0.021 0.011 0.045 0.029 0.430
* t检验：P<0.05 显著性差异
2、流式专业讲座：流式相关免疫学、流式相关血 液学、流式相关其他实验。
3、临床流式疑难病例解答：临床在职流式专家为 您解决临床检测中遇到的疑难病例问题，帮您更好 的做出诊断。
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淋巴细胞亚群检测及临床应用
一、概述
二、淋巴细胞亚群检测
1、检测原理
• 把全血加入到试剂中时，荧光标记的抗体会和白细胞表面抗原特异性结合，在采集 时，细胞通过激光束使激光散射。被染色的细胞就会发出荧光。这些被仪器检测到 的散射光和荧光信号提供了关于细胞大小、内部复杂度和相关荧光强度等信息。 BD Multitest检测试剂采用了荧光触发技术，能够直接对淋巴细胞群进行荧光设门， 以减少门中的未裂解细胞或有核红细胞带来的污染。
射光照射。于室温下(20-25℃)进行此程序操作 • 盖上管盖并轻轻混匀振荡进行混匀。室温(20-25℃)环境下避光孵育15min上
机检测。
二、淋巴细胞亚群检测
3、操作步骤-品牌B（六色淋巴细胞亚群试剂）
• 取一支 Trucounttube。用反向加样法加入50μl充分混匀的抗凝全血。注意血 不要碰到试管底部的微球( Beads)。
液时，将按钮按至第二个刻度点。释放按钮时，过量样本将被吸入吸头中。 将按钮按至第一个刻度点排出精确体积的样本，将过量样本留在吸头中。
二、淋巴细胞亚群检测
3、操作步骤-品牌B（四色淋巴细胞亚群试剂）
• 盖上管盖并轻轻混匀振荡进行混匀。在室温(20~25℃)环境下避光孵育 • 向各管中添加450μl 1× Multitest溶血素，注意：小心保护样本管，免受直
不能使用。室温保存的抗凝全血，可稳定48h;染色固定后的样本在2~8℃条 件下可稳定24h。 • 患者准备：无须特殊准备，检查对象生活饮食处于日常状态，空腹为宜， 静脉采血。
二、淋巴细胞亚群检测
3、操作步骤-品牌A
流式淋巴细胞亚群检测技术原理
荧光染料标记法
荧光染料的选择
根据抗原特异性选择相应的荧光染料，如异硫氰酸荧光素 （FITC）、藻红蛋白（PE）等。
标记过程
将荧光染料与特异性抗体结合，形成荧光标记的抗体，再 与待检测的淋巴细胞样本反应，使抗原抗体结合，形成荧 光标记的淋巴细胞亚群。
检测结果
通过流式细胞仪检测荧光信号，实现对淋巴细胞亚群的定 性和定量分析。
数据分析
使用专业软件对原始数据进行分析，包括细胞亚群的识别、计数和比 例计算等。根据实验结果，可以对患者的免疫状态进行评估和诊断。
05 流式淋巴细胞亚群检测技 术应用领域
免疫学领域应用
免疫细胞分型
利用流式细胞术对淋巴细胞进行分型，研究不 同亚群的免疫学特性。
免疫细胞功能研究
通过检测淋巴细胞亚群的表面标志物和胞内因 子，研究其在免疫反应中的功能。
喷嘴和流动室
喷嘴是连接样品管和流动室的通道， 它的直径通常很小，以便形成高速流 动的细胞悬液。流动室是检测细胞的 场所，它通常是一个透明的石英玻璃 管，内部充满鞘液。当细胞悬液通过 喷嘴进入流动室时，它们会被鞘液包 裹并排列成单行，以便后续的光学检 测。
信号检测与处理
信号检测
在流式细胞术中，信号检测通常包括前向散射光、侧向散射光和荧光信号的检测。前向散射光与细胞的大小和折 射率有关，侧向散射光与细胞的内部结构和颗粒度有关，而荧光信号则与细胞内特定成分的含量和性质有关。这 些信号可以通过光电倍增管等光电转换器件转换为电信号进行后续处理。
数据处理软件介绍及操作指南
01
FlowJo软件
功能强大的流式数据分析软件，支持多种格式数据导入和导出，提供丰
富的数据处理和分析工具。
02
Cytobank平台
流式细胞术检测T细胞亚群概要
1953年 Crosland –T轴线流过的鞘液 流速越快，载物通过的能力越强，并具有较强的 流体动力聚集作用。于是设计了一个流动室，使 待分析的细胞悬浮液都集聚在圆管轴线附近流过， 外层包围着鞘液；细胞悬浮液和鞘液都在作层液。 这就奠定了现代流式细胞术中的液流技术基础。
3，染色的细胞经照射发出荧光，同时产生光散射。这些信号分别 被呈900角方向放置的光电倍增管荧光检测器和前向角放置的光电 二极管散射光检测器接收，经过转换器转换为电子信号后，经膜/ 数转换输入计算机。 4，计算机通过相应的软件储存，计算，分析这些数字化信息，就 可以得到细胞的大小和活性，核酸含量，酶和抗原的性质等物理和 生化指标。
二）
三）流式细胞仪的工作原理
参数测量原理：流式细胞仪可以同时进行多参数测量， 信息主要来自特异性荧光信号和非荧光散射信号。 样品分选原理：流式细胞仪的分选功能是由细胞分选器 来完成的。 数据处理原理：FCM的数据显示方式包括单参数直方图 （histogram)，二维点图（dotplot），二维高等图 （contour），假三维图（pseudo 3D）和列表模式（list mode）等。
流式细胞术检测T细胞亚群
组 长： 杜建呈 田 呈（讲解） 小组成员： 李 姚
罗光珍
范成芬 钱洪珍
实 验
一
1 了解流式细胞术的基本发展过程
目
2 掌握流式细胞术的基本原理及应用
的
3 掌握分选T细胞亚群的原理与方法
4 掌握T细胞亚群分选的意义
二，流式细胞术的发展史
Moldavan1首次提出了使悬浮的单个血红细胞等 1934年 流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数， 并用光电记录装置计测的设想，在此之前，人们 还习惯于测量静止的细胞，因为要使单个细胞顺 次流过狭窄管道容易造成较大的细胞和细胞团块 的淤阻。
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T4细胞 CD3+CD4+CD8-
T8细胞 CD3+CD8+CD4-
B细胞 CD3-CD19+
NK细胞 CD3-CD（16+56）+
流式淋巴细胞亚群检测技术原理
总T细胞增高
提示体内的T细胞免疫功能增强 见于临床某些自身免疫性疾病（如SLE）、重症肌无力、
慢性活动性肝炎、甲状腺功能亢进、淋巴细胞性甲状腺炎、 器官移植排斥反应、T细胞性白血病等
流式淋巴细胞亚群检测技术原理
检测原理
免疫荧光染色主要有两种方法。间接标记的方法难以进 行多色标记，而且操作复杂，所以一般首选直接荧光染 色
荧光抗体
第一抗体
荧光二抗
Байду номын сангаас
直接标记
间接标记
流式淋巴细胞亚群检测技术原理
常用荧光素
<499nm 蓝色荧光（Blue） 500-549nm，绿色荧光（Green） 550-584nm，黄色荧光（Yellow） 585-615nm，橙色荧光（Orange） 616-700nm，红色荧光（Red） ≥700nm，远红外荧光（Far-Red）
流式淋巴细胞亚群检测技术原理
T4/T8细胞比值增高
是T4淋巴细胞增高或T8淋巴细胞减少所致 见于某些自身免疫性疾病，如SLE、多发性硬化、器官移
植排斥反应、自身免疫性溶血性贫血等
流式淋巴细胞亚群检测技术原理
T4/T8细胞比值降低
是T4细胞减少或T8细胞增高所致 见于艾滋病、再生障碍性贫血、某些白血病、传染性单核
低的一个范围内。 需要经常性监测受者的免疫功能，T4/T8细胞比值是非常
好的一个监测指标 当受者T4/T8细胞比值出现小于0.2的情况时，必须立即停
CD45-FITC CD4-RD1 CD8-ECD CD3-PC5
流式淋巴细胞亚群检测技术原理
联合CD45的四色方案
第二种是用CD45/CD3/CD19/CD16和（或）CD56做第二管的 标记，用于检测T3细胞、B细胞和NK细胞
CD45-FITC CD56-RD1 CD19-ECD CD3-PC5
T4细胞增高
提示体内存在细菌等病原微生物感染，主要见于临床各种 细菌性感染性疾病。
器官移植发生排斥反应 支气管哮喘 SLE活动期 某些免疫增强药物的有效结果 注意:昼夜变化（傍晚的峰值可为上午的两倍）
流式淋巴细胞亚群检测技术原理
T4细胞降低
提示体内存在病毒等病原微生物，主要见于临床各种病毒 感染性疾病，以HIV感染时减少最为明显
流式淋巴细胞亚群检测技术原理
固有免疫 NK细胞
检测方法
采用流式细胞术（FCM） 是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个
细胞(或生物学颗粒)的理化特性进行多参数定量分析和分 选的技术
流式淋巴细胞亚群检测技术原理
FCM
检测对象：单细胞悬液或生物颗粒； 检测参数：多参数； 检测特点：单细胞水平分析； 检测速度：高速，最高达上万个细胞/秒； 检测结果：精度高、准确性好； 可对目标细胞进行分选；
流式淋巴细胞亚群检测技术原理
检测目的
功能
数量
1
相互协作 共同参与
比例
流式淋巴细胞亚群检测技术原理
T、B细胞相互作用 流式淋巴细胞亚群检测技术原理
流式淋巴细胞亚群检测技术原理
主要检测项目
T4细胞 总T细胞
T8细胞
淋巴细胞
B细胞 NK细胞
流式淋巴细胞亚群检测技术原理
淋巴细胞的免疫标志
总T淋巴细胞 CD3+
淋巴细胞亚群检测
流式淋巴细胞亚群检测技术原理
目录
1 淋巴细胞的分类 2 淋巴细胞亚群检测方法 3 淋巴细胞亚群检测原理 4 淋巴细胞亚群的免疫功能 5 淋巴细胞亚群的临床意义
流式淋巴细胞亚群检测技术原理
淋巴细胞的分类
细胞免疫 T淋巴细胞
体液免疫 B淋巴细胞
淋巴细胞占外周血白细胞总数的20%-40%
杀伤特点： 连续性杀伤 特异性杀伤 MHC限制性
流式淋巴细胞亚群检测技术原理
T8细胞增高
提示体内存在病毒或胞内寄生菌等病原微生物感染 主要见于HIV、HBV、CMV、EB等病毒感染 也可见于结核杆菌感染等
流式淋巴细胞亚群检测技术原理
T8细胞降低
移植排斥反应 可见于γ免疫球蛋白缺乏症 胸腺发育不良 严重联合免疫缺陷病 糖尿病等
流式淋巴细胞亚群检测技术原理
免疫荧光染色
FCM可检测下列细胞成分：
表面标记物
胞浆标记物 核内标记物
核内抗原
可溶性成分
分泌到胞外的 细胞因子
细胞因子
核酸含量
黏附因子
表面受体
流式淋巴细胞亚群检测技术原理
胞内抗原
联合CD45的四色方案
第一种是用CD45/CD3/CD4/CD8做四色标记，主要可以检测 T3细胞、T4细胞、T8细胞这三种不同的亚群
流式淋巴细胞亚群检测技术原理
常用荧光素
荧光素分子 FITC PE PerCP APC PE-Cy5 PE-Cy7
激发光波长 （nm）
488 488 490 633 488 488
发射光波长 （nm）
525 575 675 660 670 755
中文名 异硫氰酸荧光素 藻红蛋白 多甲藻叶绿素蛋白 别藻青蛋白 藻红蛋白-花青素5 藻红蛋白-花青素7
T4细胞减少也可见于γ免疫球蛋白缺乏症、胸腺发育不良 、严重联合免疫缺陷病、严重创伤、大手术等
流式淋巴细胞亚群检测技术原理
T8细胞
主要功能：特异性直接杀伤靶细胞 两条途径：一是分泌穿孔素、颗粒酶及淋巴毒素
等直接杀伤靶细胞 二是通过Fas/FasL途径诱导细胞凋亡。
流式淋巴细胞亚群检测技术原理
流式淋巴细胞亚群检测技术原理
流式淋巴细胞亚群检测技术原理
总T细胞降低
提示体内的T细胞免疫功能减弱 见于某些白血病、应用免疫抑制剂药、放疗过程中、先天
性细胞免疫缺陷、艾滋病、多发性骨髓瘤、传染性单核细 胞增多症，以及过劳等造成机体免疫功能处于相对较低的 其他一些情况
流式淋巴细胞亚群检测技术原理
流式淋巴细胞亚群检测技术原理
细胞增多症、免疫缺陷综合征、某些病毒感染、恶性肿瘤 、结核病等 一般来说，导致T4/T8比值倒置，以全身性、侵袭和破坏 机体免疫系统的感染引起的倒置变化幅度最大 临床抗感染治疗有效时，可以观察T4/T8细胞比值的逐步 恢复
流式淋巴细胞亚群检测技术原理
T4/T8细胞比值临床意义
器官移植受者免疫功能监测 个体化免疫治疗疗效判断 受者需要的是一种恰当的免疫抑制，将免疫功能控制在较