无菌检测和微生物限度常见问题

无菌检测和微生物限度常见问题1、问:做无菌验证时阳性对照菌是怎么加入的？可以在加完培养基后用无菌的注射器把菌液注入吗？答:严格的说是要在最后一遍冲洗液中加入阳性对照菌的,这主要是考量滤膜对于阳性菌的截留性～但是滤器如果可以提供滤膜对于阳性菌的充分截留的话在最后的培养体系中加入阳性菌也是未尝不可的.如果供试品没有抑菌作用,可以在加完培养基后用无菌的注射器把菌液注入,摇匀如果供试品有抑菌作用,正如安哥洛卡所讲,在最后一次冲洗液中加入阳性对照菌,摇匀,抽虑,加培养基.无菌检查，加入阳性的方法可以有许多种，可以根据个人的习惯。

只是注意：1、避免人为污染。

2、阳性菌加入数量2、问:离心沉淀法的原理、操作和注意事项是什么?答:原理:利用沉降系数的差异将供试品和微生物进行分离;操作:取规定量的供试液，3000转/分离心20分钟（供试液如有沉淀，先以500转/分离心5分钟，取全部上清液再离心），弃去上清液，留底部集菌液约2ml，加稀释剂至原规定量.注意事项:真菌由于沉降系数比较小,500r/min离心5min，黑曲霉、白色念珠菌回收率为20%,因此其检查不适宜用低速离心沉淀法.3、问:稳定性实验的微生物及无菌检查,是否每次都要做?答:是;原因:一实验期内可能会染菌;二灭菌后微生物并不是就彻底"死亡",有些成为碎片,这些碎片在一定的条件和时间下,可以自我修复而复活.三稳定性的考察，也应包括药品有效期的考察，在此期间所有的项目都应是合格的，无菌也是其中之一，如果在有效期内无菌不合格，也可以说明该药品存在一定的缺陷，至少，有效期有问题。

4、问:眼部给药制剂如何做卫生学检验?答:液体制剂:无菌检查;半固体及固体制剂:微生物限度检查5、问:滴眼液的微生物限度为何进行无菌检查?答:一滴眼剂产品系按照无菌工艺生产且终产品为灭菌产品,故其成品的微生物质量应要求统一为无菌;所以,滴眼剂产品的临床合理用药应与其卫生标准要求一致,即将其微生物质量要求统一为无菌,显然更为合理;二滴眼剂的微生物质量要求为无菌,是与各国药典在滴眼剂要求上的统一,及对《中国药典》此项规定合理性的补充及完善等方面看,滴眼剂成品的微生物质量要求统一为无菌具有必要性。

三同时,中国已加入WTO,进出口药品已有明确质量要求(在国外药典中,眼用药品都以无菌要求),同时临床用药更加合理与规范。

故现行药典将滴眼剂的卫生标准统一为强制性无菌要求。

6、问:如何进行灭菌验证?答:可用生物指示剂进行验证,湿热灭菌:湿热脂肪芽孢杆菌孢子干热灭菌:枯草芽孢杆菌孢子7、问:为何洁净度沉降菌的检查只用营养琼脂?答:一玫瑰红钠培养基对细菌的生长有抑制作用,而营养琼脂对于真菌的生长则没有抑制作用,所以选用营养琼脂作为培养基二营养琼脂主要为培养细菌,而且培养时间是2天,原因为细菌为原核生物,生长与繁殖的能力较霉菌等真核生物强,所以控制了细菌,霉菌等真菌也在一定程度上也得到了控制三厂家在制定自己的内控标准时,可以同时对细菌和真菌进行控制.8、问:微生物培养时间范围如何界定?答:含量测定所允许的误差为±2%,如果照此限度,无菌培养时间为14天*24小时/天=336小时，它的2%为6.72小时,前后共13.44小时；又加上无菌检验没有必要达到含量测定所要求的精度,所以我们完全可以在培养的第十四天的任何上班时间观察结果下结论.微生物限度检查培养时间分别为48小时及72小时,它们的2%分别为0.96小时，1.44小时,即我们只能在准确培养时间的前后1~2小时内计数.9、问：抗生素乳膏，需加聚山梨酯80、司盘、单硬脂酸甘油酯乳化，后离心集菌（离心后不分层），再薄膜过滤。

但基质堵住膜孔，过滤速度非常慢，怎么办？答：1、可以用十六烷酸异丙酯萃取基质，使之分层，取水层进行薄膜过滤（回收率差）。

2、样品加入吐温-80，乳化（45度）-----薄膜过滤。

关键词：抗生素乳膏、十六烷酸异丙酯、萃取、吐温-80、乳化（45度）、薄膜过滤10、问:陶瓦盖作用及使用范围答:陶瓦盖的主要作用为防止菌落蔓延生长成片或发生重叠影响计数,通常在在效价测定中使用,在微生物限度检查中仅在易形成片状菌某些剂型如蜜丸、水丸中使用.11、问:如何根据消毒物品的特性确定合格的灭菌时间和温度?答:一般情况下，含有糖分的培养基温度需控制在115℃15～20min，不含糖分的培养基温度控制在121℃15～20min，而含菌的培养基（使用过）温度需控制在121℃30min左右，此外每次使用时，应放入必要的监视指标。

12、问:如何减少培养基灵敏度下降引起的误差?答:目前大多数单位使用干粉培养基，使用较方便，但由于其极易吸潮，如存放不当出现凝块，则其凝固性较差，应避免使用。

新鲜配制的培养基应在2℃～20℃避光保存，但不得冻结，保存时间不得过2周。

硫乙醇盐流体培养基储存过程中，若氧化还原层超过1/5，须经水浴加热煮沸10min 方可使用，但只限一次。

否则可使培养基中糖、微生物和氨基酸受到破坏，影响质量13、问:如何控制细菌的培养时间?答:不同的培养时间对样品细菌总数计数结果的影响样品经24h培养后，有的菌落很小，容易漏掉，培养48h后，菌落不但变大，而且还有很多新生长出来的菌落，培养72h后，菌落数增加不多，但菌落明显变大，而且混杂的霉菌生长旺盛，影响结果的观察计数。

同时这也是一些样品经72h培养后细菌总数技术有明显增加的一个原因。

培养24h和培养48h计数结果有明显差异，后者合格率明显降低，所以在规定的培养环境下，应严格遵守培养时间，以便真实的反映出样品中细菌总数的水平。

14、问:菌种保藏与管理应执行哪些程序?答:菌种保藏与管理应有完整的程序，保藏的菌种必须具备该菌种的详细历史及有关资料。

一般是首先填写菌种卡片，登记菌种名称编号，来源历史，形态特征，生化与血清学鉴定，以及菌种传代次数、最宜培养基和培养条件、保藏方法、贮存条件及保藏地址等15、问:青霉素酶的保存条件及温度对其活性的影响答:青霉素酶能够在4℃保存6个月以上活性不发生显著改变。

与同时采用的加入甘油或增加氯化钠浓度保护酶活性的方法比较,没有显著的不同;温度对青霉素酶的活性影响很大。

55℃时对青霉素G呈现最高水解活性,随着温度的升高或降低,酶水解活性逐渐下降。

缓冲液pH对酶活性存在一定的影响,最适酸碱度为pH7.0,在应用本酶进行青霉素制剂无菌检查等应用时,需特别注意测试温度及酸碱度的影响.16、问：标准灭菌时间按F0=Ft*10(t-121)/10计算，F0要大于8，在160--170度是短时间就能做到的，为什么干热灭菌要两小时以上呢？答：湿热灭菌和干热灭菌的效果是不同的，饱和蒸汽的穿透性比干热空气穿透强得多,蒸汽冷凝时放出的潜热传给待灭菌品,使之升温并使待灭菌品所带的微生物尤其是表面的微生物发生水合作用,从而加速了它们的死亡。

所以在达到同样灭菌效果的前提下,湿热灭菌所需要的时间要短得多。

（公式F0=Ft*10(t-121)/10只适合于湿热灭菌,F0系T=121℃及Z=10℃下的FT值。

如果把121℃理解为“标准状态”,那么F0可理解为“标准灭菌值”）17、问：验证是不是要3批样品的一次，还是一批样品的3次，还是3次样品3次得实验？答：1)、验证的目的，是要考察实验方法的可行性（避免出现假阳性、假阴性），2)、在样品的药物组成、成份、给药途径一致的前提下，验证时，“同一个批号的做3次”或“3个批号的各做一次”，均可。

18、问：做实验的好习惯是什么？答：1).实验前后清洁洗手，完毕清理实验现场，器皿洗净归原，仪器等电源关闭。

2).试剂、样品标签详细准确，包括剂量，规格，时间，实验人员等等；实验记录详细准确，以便备查和分析。

3).提前分析实验内容及步骤，准备好全部的试剂及相应工具、仪器，不懂或者有疑问的步骤和地方问清楚，重点难点重点标出，做到心中有数；实验完毕及时分析。

4).科学计划、合理分配时间，做到忙而不乱。

实验中仔细观察试验过程，及时记录可疑或者需要注意的地方。

5).多读文献多与别人交流，开拓思路，改进方案，对于实验的进展及方向做到一定的把握。

19、问：限度检查所用器皿用自来水洗后一定用纯化水再洗吗?答：GMP认证中关于QC的规程中"分析用玻璃器皿清洁规程"要求如下1.0目的提供玻璃器皿的清洁方法的文件指导。

2.0范围化验室部门所有玻璃器皿。

3.0责任化验室人员。

4.0程序4.1玻璃器皿每次使用后，使用者必须使其清洁并放于固定位置备用。

4.2一般玻璃器皿清洁，用饮用水或去污剂洗涤后，器壁应不挂水珠，再用少量纯化水冲洗器皿三次，放固定位置自然干燥。

4.3定量分析用玻璃器皿（如滴定管；移液管等）清洁，先把器皿内的水沥掉，然后往其中加入洗液，浸泡一段时间，放掉洗液，用饮用水冲洗后，再用纯化水冲洗三次，倒置自然干燥。

4.4水分测定用的玻璃器皿清洁过程同1或2，清洁后置于105~107℃烘箱内烘干。

然后存放于干燥器中。

20、问：洁净室甲醛气体熏蒸消毒验证方案是什么？答：1)、甲醛消毒方法在所有的消毒液中甲醛最常用。

当相对湿度在65%以上、温度在24~40℃时，甲醛气体的消毒效果最好，但若采用过多的甲醛，会因聚合而析出白色粉未附在建筑物或设备表面。

一般甲醛的消毒方法如下：A：消毒前先用丝绸浸注射用水（纯化水）擦洗房间建筑物和设备表面，然后用5%麝香草酚溶液喷酒或擦洗，静置1小时后，再用丝绸浸注射用水（纯化水）擦洗一次。

B：计算体积（包括房间及风管体积），按10ml/m3的比例准备浓度为36%的甲醛溶液（甲醛密度为1.1g/ml），按2~3g/m3的比例准备高锰酸钾溶液。

C：在房间中放入试验装置，如不锈钢培养皿支架；直径90mm双碟玻璃培养皿；枯草杆菌试纸，每张试纸上枯草杆菌数量为1*106个，每个培养皿中放2张试纸，1张做无菌试验，1张做含菌数试验。

培养皿的数量应根据房间面积确定。

D：消毒流程：在不锈钢容器中加入高锰酸钾，用双层纱布盖住桶口，再倒入36%浓度的甲醛溶液甲醛气体扩散（约30min）启动空调器让甲醛气体循环（约20min）关闭通风系统，房间熏蒸消毒，不少于7hr房间排气，用新鲜空气置换（约2hr）开启空调系统用75%酒精喷酒环境。

E：质监部门取样培养。

判断标准：试纸内枯草杆菌数量小于1*103个为合格。

F：取样后用丝绸沾0.1%的新洁尔灭溶液擦洗机器表面；用0.1%新洁尔灭溶液或1%Germ Warfare溶液或75%酒精喷洒建筑物四周。

0.1%新洁尔溶液与1%Germ Warfare溶液溶液每月轮换一次。

2)、气体熏蒸灭菌后室内环境中残留量的测试用甲醛气体进行熏蒸灭菌后，需用全新空气换气若小时，由于甲醛的环境标准只有（1~2）*10-6，要使环境中的残留的甲醛浓度尽可能低至不致使人嗅出特殊气味（<0.55*10-6>，并对眼睛无刺激（<1*10-6>，然后根据测定的室内环境中甲醛残留量的结果，正确设定换气时间，以保证在达到作业环境中无菌的前提下，对人身心健康不致产生不良影响。