微生物限度及无菌检查
微生物限度和无菌检查法验证
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方法验证的步骤与内容 1、制备验证试验用菌液 按药典无菌检查法中培养基灵敏度检查项中试验用 菌液的制备方法将规定需用的试验菌分别制成每毫 升中含10～100个菌（CFU）的供试菌液。 2、样品的前处理方法 样品的前处理方法是验证试验的一部分，需证明所 用的处理方法对各试验菌的生长无影响。 根据供试品的性状，选用以下适宜的方法，或几种 方法联合使用： 溶解：验证所用溶液、助溶剂和水浴助溶温度对微 生物的生长无影响。
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乳化：验证所用乳化剂和水浴助溶温度的有效性、 使用量及对微生物的生长无影响。 破乳：验证所用破乳剂的有效性、使用量及对微生 物的生长无影响。 萃取：验证有机相选择的合理性、有效性及对微生 物的生长无影响。 稀释：验证降低供试品相对抑菌浓度的有效稀释倍 数。 离心：验证所用转速、时间和微生物的分布情况。 应说明采取某种前处理方法的原因，如样品不需要 特别的前处理就能制成均匀的供试液，这一步可以 省掉，直接进入确定样品有无抑菌性的步骤。
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选择适当的方法消除或有效降低供试品的抑菌性 根据供试品的特性选择药典规定的消除其抑菌性的 方法（一种或几种方法联合），或根据药物的化学 特性，寻找出其他合理、有效的方法，特别是有效 的中和剂；并通过模拟试验（验证试验）对消除或 降低抑菌性的效果进行检验。 无菌检查可采用：①薄膜过滤法；②中和法（目前 药典仅收载β-内酰胺酶处理法）。 ①薄膜过滤法适用于液体供试品和可溶于水的固体 供试品（只要许可，应首先采用）。验证的重点是 确定滤膜的适用性、确定冲洗的方法和冲洗液的用 量。
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方法验证中应注意的问题与评价要求 1、验证试验的完整性 验证试验的完整性与方法的科学性密切相关，验 证工作不完整，就不能全面体现供试品和试验过 程对微生物的影响情况，则很可能影响或干扰对 最终试验结果的判断。故应按照中国药典2005年 版的要求进行方法验证。特别是对某些具有抑菌 性的供试品，需采取适当的方法消除或有效降低 供试品的抑菌性。在对供试品进行特殊处理时， 既要考察供试品的抑菌性，还要考察在供试液制 备过程中微生物受影响的程度（稀释剂对照组） 。
无菌检查微生物限度检查方法学验证实例
供试液制备：取样品10瓶分别加0.1%蛋
白胨溶液30 ml溶解后，过滤。
7.活菌计数
活菌计数结果见表1。
10－4稀释
10－5稀释
10－7稀释
试验次数
1
2
1
21Βιβλιοθήκη 2金黄色葡萄球菌56
60
枯草芽孢杆菌
77
79
白色念珠菌
86
70
黑曲霉菌
80
76
铜绿假单胞菌
47
50
方法验证
直接接种法：取样品12支，分别接种8支硫乙醇酸盐和4支霉菌液体培养基2ml/支后，再按要求加入相应的阳性菌液（30-100个/ml），置规定温度培养3-5天，逐日观察结果。
仪器和滤器：HTY-2000A集菌仪，全封闭无菌试验过滤培养器（批号20050105）北京牛牛基因有限公司。
01
方法：中国药典2005年版无菌检查的验证实验
02
操作方法 菌液制备： 取金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物少许接种至营养肉汤培养基中, 生孢梭菌的新鲜培养物少许接种至硫乙醇酸盐流体培养基中, 32.5±2.5℃培养18～24小时；
培养：硫乙醇酸盐流体培养基桶30-35℃培养；真菌培养基桶23-28℃培养。观察结果。
结果 细菌和真菌数计数结果分别见表1和表2。
表1 细菌数计数 表2 真菌数计数结果
*
菌 种
大肠埃希菌
金黄色葡萄球菌
枯草芽孢杆菌
铜绿假单胞菌
生孢梭菌
计数(CFU)
22
26
36
39
62
66
58
54
45、 23
128、108
中国药典2020微生物限度检查
中国药典2020微生物限度检查
中国药典2020中对微生物限度的检查要求如下：
1.总菌落数限度：需满足以下要求：
- 不应含有大肠埃希菌或粪链球菌。
- 对无菌制品，其总菌落数规定不应超过制定的标准。
- 必须符合产品特性和验证的任何特定需求。
2.酵母和霉菌限度规定：
- 对无菌制品，每克中不应含有可繁殖的酵母和霉菌。
- 对非无菌制品，每克中不应含有可繁殖的酵母和霉菌。
建议
进行采样和检测多数生物制品样品。
3.大肠菌群限度规定：
- 每克中不应含有大肠菌群。
对某些产品（如消毒剂指定的测定），可以采用其他方法或者规定了合适分析方法的产品例外。
4.针对特定微生物的检查：
- 对某些产品，药典可能要求进行特定微生物的检查，以确保
产品的安全性和质量。
需要注意的是，这只是中国药典2020中关于微生物限度检查
的一般要求，具体的规定可能因产品类型和特性而有所不同。
因此，在进行微生物检查时，需根据产品的特定需求和合适的分析方法进行操作。
在实际生产和质量控制过程中，还需严格按照相关法规和标准进行操作，确保产品质量和安全性。
无菌室、阳性对照室、微生物限度室区别
无菌室、阳性对照室、微生物限度室区别无菌检查、微生物限度检查的所有操作均需在严格控制微生物污染的环境下进行，操作环境的无菌保证程度将直接影响无菌检查结果，为了保证无菌检查用洁净室（区）环境的稳定性，确保检查结果的可靠性，对洁净室（区）的环境质量采取合理的控制措施和评价方法是必要的。
无菌检查、微生物限度检查应在环境洁净度10000级和局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程必须严格遵守无菌操作，防止微生物污染。
单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。
隔离系统按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。
无菌室应采光良好、避免潮湿、远离厕所及污染区。
面积一般不超过10平方米，不小于5平方米；高度不超过2.4m。
由1~2 个缓冲间、操作间组成（操作间和缓冲间的门不应直对），操作间与缓冲间之间应具备灭菌功能的样品传递箱。
在缓冲间内应有洗手盆、毛巾、无菌衣裤放置架及挂钩、拖鞋等，不应放置培养箱和其他杂物；无菌室内应六面光滑平整，能耐受清洗消毒。
墙壁与地面、天花板连接处应呈凹弧形，无缝隙，不留死角。
操作间内不应安装下水道。
无菌操作室应具有空气除菌过滤的单向流空气装置，操作区洁净度100级或放置同等级别的超净工作台，室内温度控制18~26℃，相对湿度45%~65%。
缓冲间及操作室内均应设置能达到空气消毒效果的紫外灯或其他适宜的消毒装置，空气洁净级别不同的相邻房间之间的静压差应大于5Pa，洁净室（区）与室外大气的静压差大于10Pa。
无菌室内的照明灯应嵌装在天花板内，室内光照应分布均匀，光照度不低于300lx。
缓冲间和操作间所设置的紫外线杀菌灯（2~2.5W/平方米），应定期检查辐射强度，要求在操作面上达40/μW/平方厘米，不符合要求的紫外杀菌灯应及时更换。
无菌室应每周和每次操作前用0.1%新洁尔灭或2%甲酚液或其他适宜消毒液擦拭操作台及可能污染的死角，开启无菌空气过滤器及紫外灯杀菌1小时。
无菌、微生物限度检查及方法验证
01
02
03
直接接种法
将样品接种在培养基上， 观察是否有微生物生长。
薄膜过滤法
将样品通过薄膜过滤，收 集滤膜上的微生物，再进 行培养。
离心沉淀法
将样品离心，收集沉淀物 中的微生物，再进行培养 。
无菌检查的注意事项
确保环境洁净
无菌检查需要在洁净的环境中进行，以避免 外界微生物的污染。
避免样品中防腐剂的影响
方法验证
方法验证的定义与目的
定义
方法验证是对检测方法的可靠性、准确性和可重复性的评估过程，以确保该方 法能够满足预期的检测要求。
目的
方法验证的目的是确保所采用的无菌、微生物限度检查方法具有足够的灵敏度 、特异性、重现性和可操作性，以保证检测结果的准确性和可靠性。
方法验证的流程
准备验证计划
制定详细的验证计划，包括验 证实验的设计、实验步骤、数 据收集和分析等内容。
进出口检验
进出口药品需要进行严格的微生物限度检查，以确保药品符合进口 国或地区的质量标准，保障公众健康。
方法验证在药品质量控制中的应用
验证无菌、微生物限度检查方法的可靠性
通过方法验证可以确保无菌、微生物限度检查方法的准确性和可靠性，提高药品质量控制 水平。
评估检测方法的性能指标
方法验证过程中需要对检测方法的性能指标进行评估，如灵敏度、特异性、重现性等，以 确保检测结果的准确性和可靠性。
如果样品中含有防腐剂，可能会抑制微生物 的生长，因此需要进行相应的处理。
正确选择培养基
根据待测样品的特性，选择适合的培养基， 以确保微生物能够正常生长。
定期进行方法验证
无菌检查方法需要定期进行验证，以确保其 可靠性。
0义与目的
中国药典无菌、微生物限度与细菌内毒素检查方法学验证内容详解
国家药典委员会
中国药品生物制品检定所
二00五年十月十一日
● 验证的目的: 验证所采用的方法和条件是否适合 于供试品的无菌检查。 即确认供试品在该检验量、该检验条件下无抑菌 活性或其抑菌活性以被充分消除到可以忽略不计。 ● 验证的意义：保证检验结果的准确、可靠及检 验方法的完整性。
二、无菌检查验证的关键点
中检所和药典会多次召开会议肯定工作的成绩、 研讨存在的问题，希望各级领导能给予高度重 视，从各方面支持这项工作长期持续发展。 实际工作中，药品生产、研发企业和各级药检 所在工作中都存在很多困难和问题。
关于执行《中国药典》2005年版微生物限度 检查法和无菌检查法有关问题的说明
国药典发[2005]98号
验证的目的是为了确认试验中供试品应选择药 典中所收载的何种供试液制备方法、何种测定
方法及确定的检测系统是否适用于该供 试品的检验，即只有通过方法验证，才 能确定供试品的检验条件和方法，保证 “微生物限度检查”或“无菌检查”方法的 科学性和检验结果的准确性。
2．不同企业生产的相同品种，特别是中 成药，因原料来源、工艺、辅料的不同， 药品可能表现出不同的抑菌特性；同一个 企业生产的相同品种，因原料来源不同、 工艺改变或不同实验室等原因，也可能导 致检测结果的差异。因此，不同企业生产 的相同品种进行“微生物限度检查”或“无菌 检查”时，其具体试验方法如冲洗量等不 能简单照搬，需通过验证试验核实该试验 方法和检测系统是否适宜。
生孢梭菌 (Clostridium sporogenes) [CMCC(B) 64 941]
白色念珠菌 (Candida albicans) [CMCC(F) 98 001]
黑曲霉 (Asperglllus niger) [CMCC(F) 98 003]
无菌检测和微生物限度常见问题
无菌检测和微生物限度常见问题1、问:做无菌验证时阳性对照菌是怎么加入的？可以在加完培养基后用无菌的注射器把菌液注入吗？答:严格的说是要在最后一遍冲洗液中加入阳性对照菌的,这主要是考量滤膜对于阳性菌的截留性～但是滤器如果可以提供滤膜对于阳性菌的充分截留的话在最后的培养体系中加入阳性菌也是未尝不可的.如果供试品没有抑菌作用,可以在加完培养基后用无菌的注射器把菌液注入,摇匀如果供试品有抑菌作用,正如安哥洛卡所讲,在最后一次冲洗液中加入阳性对照菌,摇匀,抽虑,加培养基.无菌检查，加入阳性的方法可以有许多种，可以根据个人的习惯。
只是注意：1、避免人为污染。
2、阳性菌加入数量2、问:离心沉淀法的原理、操作和注意事项是什么?答:原理:利用沉降系数的差异将供试品和微生物进行分离;操作:取规定量的供试液，3000转/分离心20分钟（供试液如有沉淀，先以500转/分离心5分钟，取全部上清液再离心），弃去上清液，留底部集菌液约2ml，加稀释剂至原规定量.注意事项:真菌由于沉降系数比较小,500r/min离心5min，黑曲霉、白色念珠菌回收率为20%,因此其检查不适宜用低速离心沉淀法.3、问:稳定性实验的微生物及无菌检查,是否每次都要做?答:是;原因:一实验期内可能会染菌;二灭菌后微生物并不是就彻底"死亡",有些成为碎片,这些碎片在一定的条件和时间下,可以自我修复而复活.三稳定性的考察，也应包括药品有效期的考察，在此期间所有的项目都应是合格的，无菌也是其中之一，如果在有效期内无菌不合格，也可以说明该药品存在一定的缺陷，至少，有效期有问题。
4、问:眼部给药制剂如何做卫生学检验?答:液体制剂:无菌检查;半固体及固体制剂:微生物限度检查5、问:滴眼液的微生物限度为何进行无菌检查?答:一滴眼剂产品系按照无菌工艺生产且终产品为灭菌产品,故其成品的微生物质量应要求统一为无菌;所以,滴眼剂产品的临床合理用药应与其卫生标准要求一致,即将其微生物质量要求统一为无菌,显然更为合理;二滴眼剂的微生物质量要求为无菌,是与各国药典在滴眼剂要求上的统一,及对《中国药典》此项规定合理性的补充及完善等方面看,滴眼剂成品的微生物质量要求统一为无菌具有必要性。
微生物限度与无菌-内毒素区别
微生物限度-无菌-内毒素区别与联系微生物检测基本就这3项了。
微生物限度：用营养琼脂、玫瑰红钠培养。
洁净度中等操作台内进行（B级)无菌：硫乙醇酸盐、改良马丁在无菌套筒里操作并培养。
洁净度要求较高(A级）内毒素：鲎试剂稀释不同浓度来判定。
洁净度要求不高，D级情况下即可。
我的理解微生物泛指细菌和霉菌酵母菌等等、应该是包罗万象，各种杂菌都有无菌则也是各种杂菌与微生物限度检测的微生物有什么区别？内毒素是一种热源，服用没什么关系，在注射后容易导致人体发热。
内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分，叫做脂多糖。
脂多糖对宿主是有毒性的。
内毒素只有当细菌死亡溶解或用人工方法破坏菌细胞后才释放出来，所以叫做内毒素。
耐高温比如说注射液产品用气接触产品，他应该用滤器过滤其他吧。
用膜直径改用0.45（过滤）的好还是0.22（除菌）的好？滤膜泡点肯定要做的，高风险产品应该要最少2层滤膜吧。
用了这滤膜可以不用检这3项还是要检其中项目？而且有的企业只是一年验证一下，不对气体日常可行吗？求大神详解3者的联系与区别，各什么时候需要检这3项及为什么。
答：微生物限度针对非无菌产品无菌和内毒素针对无菌产品。
微生物限度，无菌检验，内毒素检验均为供试品安全性检测。
主要区别是微生物限度，无菌检验是检验活的微生物方法，内毒素检验可以检验死去的微生物中内毒素含量。
什么时候选用不同的检验方法，主要参见药典要求，例如口服制剂选择微生物限度，注射剂和眼用制剂选择无菌检验，注射剂也需要做内毒素检验。
选择不同实验方法主要依据是供试品生物风险级别和供试品用途。
例如纯化水检验中不需做内毒素实验，注射用水检验中不需做无菌实验。
依据是纯化水主要用途为清洗，注射用水用途是配液，所以注射用水的微生物风险更高，需要做内毒素实验，控制风险。
微生物限度和无菌实验用具要求无菌，内毒素实验用具要求去除内毒素。
检验环境要求现行药典微生物限度和无菌实验均是C级下局部A级，微生物限度在超净工作台，无菌实验在生物安全柜内操作。
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计数方法适用性检查
1.供试液的制备
u 水溶性供试品 u 非水溶性供试品：可适量加入如聚山梨酯80等表面活性剂，加入量及加 入的试剂均需进行验证，以证明其无明显抑菌性。 u 油性供试品：十四烷酸异丙酯或其它无抑菌性的表面活性剂。 u 肠溶供试品：一般肠溶制剂用pH8.6磷酸盐缓冲液，结肠制剂用pH7.6磷 酸盐缓冲液。
阳性对照组：相当于1g或1ml的供试液+不大于 100cfu的目标菌
阴性对照组：与供试液同体积的稀释液
耐胆盐格兰阴性菌检查
1.供试液制备和预培养：取供试品10g，加胰酪大豆胨液体培养基至100ml，放置20~25℃培养 约2小时内。 2.定性试验：取1:10的供试液10ml，加至肠道菌增菌培养基中（加入量应经过验证），此方法 适用于标准为不得检出的供试品。 3.定量试验：三管法，同上述MPN法，每级稀释级均取1ml加入一管培养基中。 4.选择与分离：取上述培养物划线于紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上。 5.结果判断：若紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上有菌落生长，定性试验判断是否检出；定量试验 则对应培养管，查表确定供试品中含有耐胆盐格兰阴性菌的可能菌数。
概要
实验室 管理要
求
菌种管 理
培养基 适用性 检查
微生物 限度检
查
无菌检 查
总体要求： 各功能区域应明确标识，特别是菌种储藏室、污染物处理
区、阳性菌室等存在生物安全危害的区域。
洁净室要求： 洁净室作为药品微生物实验室的核心区域，应远离交通干道、厕所及污染区，
应选上、下水道及其他安装适宜的位置。 洁净室与各配套功能区，包括清洗、培养基配制、消毒/灭菌、灭菌物品存放和
洁净度级 过滤完整性 别
气流组织
A级
B级
检漏试验 监测周期
24个月
C级
单向流 监测周期
24个月 ①单向流 （静态）
监测周期 24个月
②非单向流 -
非单向流 -
空气流速
0.25-0.50 m/s 监测周期 12个月
①单向流(静态 ) 0.25-0.50m/s 监测周期 12个月 ②非单向流 -
-
D级
非单向流 -
验
推荐的药品 洁净实验室 的监测频次 及监测项目 通则（9205 表2）
表5 警戒线 和就偏咸
受控区域
无菌隔离系统
内部 外部
采样频次
监测项目
空气悬浮粒子 ③、浮游菌①或沉降菌 ②、表面微生
每次实验 物（含手套）
每半年一次 空气悬浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面微生物
微生物 洁净实验室
A级 B级 C级
保存温度：甘油冷冻管和瓷珠保存管均在-30℃或-80℃ 琼脂斜面培养基在4~8℃
3.工作用菌株的制备
菌种的确认: 划线于选择性培养基 革兰氏染色 适宜的生化实验 全自动微生物鉴定仪
工作用菌种的制备：选择性培养基上的典型菌落分别划线于相应的琼脂 斜面上
工作用菌株斜面的保存
u除铜绿假单胞菌外,菌株斜面均在4~8℃保存，保存2~3个月 u铜绿假单胞菌置室温保存，保存1~2个月
指示能力：
指示能力：
u耐胆盐革兰阴性菌：紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基—大肠埃希菌和铜 绿假 单胞菌 u大肠埃希菌：麦康凯琼脂培养基 u沙门菌：木糖醇赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基和三糖铁琼脂培养基 u金黄色葡萄球菌：甘露醇氯化钠琼脂培养基 u白色念珠菌：沙氏葡萄糖琼脂培养基和念珠菌显色培养基
三糖铁琼脂实验
三、培养基适用性检查—微生物限度检查
1.计数培养基的适用性检查： 验证菌： TSA：金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、黑曲霉、
白色念珠菌 SDA：黑曲霉、白色念珠菌 验证菌加入量：不大于100cfu 培养基：待检培养基、标准培养基 方法：注皿法 培养条件：TSA：30~35℃，不超过3天 SDA：20~25℃，不超过5天
程序、日常监测、UV灯与过滤器定期更换等） 定期再验证管理与环境监测计划
环境的清洁、消毒 所用清洁、消毒剂的种类和使用规定 规定清洁、消毒的频次、方法；（每次试验/或每日、每周、
每月等） 建立清洁、消毒记录； 实验室对所用的消毒剂种类应定期更换，使用的消毒剂应
无菌。
二、菌种管理
传输、培养区域、结果观察、试验菌实验和办公室等，要集中，减少污染，便 于管理和使用。 空气机组或空气净化系统：洁净或无菌室应配备独立的空气机组或空气净化系 统，定期更换并保存记录。 洁净区 、活菌操作区：在时间或空间上有效分隔不相容的实验活动。 活菌操作区：配备生物安全柜；病原微生物的分离鉴定工作在二级生物安全实 验室进行。
洁净实验室（环境监测）：各洁净级别空气悬浮粒子的标准 （通则9205表3）
洁净度级别
悬浮粒子最大允许数 / 立方米
静态
动态
≥0.5μm ≥5.0μm ≥0.5μm ≥5.0μm
A级
3520
20
3520
20
B级
3520
29
352000
2900
C级
352000
2900
3520000
29000
D级
3520000
控制菌的培养基实用性检查
促生长能力：
u 液体培养基：分别在待检培养基和标准培养基中加入目标菌。 u 固体培养基：涂布法，不大于100cfu
抑制能力：
u 大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、沙门菌对应的对照菌是金黄色葡萄球菌； u金黄色葡萄球菌对应的对照菌是大肠埃希菌； u 溴化十六烷三甲胺琼脂培养基和念珠菌显色的对照菌是大肠埃希菌
菌种的采 购
标准储备 菌株的制
备
工作用菌 株的制备
1.菌种的采购
我国的菌种保存机构
普通微生物菌种保藏管理中心(CCGMC) 农业微生物菌种保藏管理中心(ACC) 工业微生物菌种保藏管理中心(CICC) 医学微生物菌种保藏管理中心(CMCC) 抗菌素菌种保藏管理中心(CACC) 兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC) 林业微生物菌种保藏管理中心(CFCC) 专利微生物菌种保藏管理中心
3.实验用菌液的制备
稀释液：pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液 黑曲霉：含0.05%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨冲液或0.9%无菌氯化 钠溶液 稀释方式：10倍递增稀释 菌液制备后：室温下放置，应在2小时内使用；2~8 ℃可在24小时内使用。 黑曲霉的孢子液可保存在2~8 ℃ ，可在验证过的储存期内使用。
木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板上沙门菌菌落形态：淡红色或无色， 透明或半透明，中心有或无黑色。
结果判断：如可疑菌落生长，应挑取可以菌落转种于三糖铁琼脂培 养基斜面上。
大肠埃希菌检查
增菌培养：1:10的供试液接种至胰酪大豆胨液体培养基中。 选择和分离培养：取上述培养物1ml转种至麦康凯液体培养基100ml中， 42~44℃培养24~48小时，取此培养物划线于麦康凯琼脂平板上。 结果判断：如有菌生长，应进行鉴定试验判定是否检出大肠埃希菌。
沙门菌检查
u增菌培养：供试品10g直接接种至胰酪大豆胨液体培养基中。 u选择和分离培养：取上述培养物0.1ml转种至RV沙门增菌液体培养基10ml中， 30~35℃培养18~24小时，取此培养物划线于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板 上。
空气悬浮粒子③ 、浮游菌①、沉降菌 ②、表面 每次实验
微生物（含手套及操作服）
空气悬浮粒子④、浮游菌、沉降菌、表面微生物 每周一次
（含手套及操作服）
每季度一次 空气悬浮粒子④、浮游菌④、沉降菌、表面微生物
D级
每半年一次 空气悬浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面微生物
生物安全实验室（BSL-2)：
实验室应建立洁净室（区）和隔离系统的验证、使用和清 洁维护标准操作规程，对可能影响检测结果的工作（如洁 净度验证及监测、消毒、清洁维护等）能够有效地控制、 监测并记录。实验室对所用的消毒剂应进行效力验证并定 期更换，消毒剂在使用前应尽可能使用0.22μm的无菌滤膜 进行除菌过滤。
无菌取样的环境 无菌取样应在无菌实验室内进行，特别是采用无菌生产的
产品，应有非常严格的无菌防护措施，避免在抽样过程中 造成微生物的污染。 如果可能，所有的样品包括非灭菌样品均应在具有无菌条 件的特定抽样间进行无菌抽样。
无菌洁净室的运行 建立使用登记制度 按洁净室管理规范的要求制立SOP（开启运行、人员进入
1.硫乙醇酸盐流体培养基的适用性检查： 验证菌： 金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌 验证菌加入量：不大于100cfu 培养基量：12ml 方法：直接接种法 培养条件：30~35℃，不超过3天
2.胰酪大豆胨液体培养基的适用性检查： 验证菌： 枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉 验证菌加入量：不大于100cfu 培养基量：9ml 方法：直接接种法 培养条件：20~25℃，不超过5天
2.标准储备菌株的制备
培养基：胰酪大豆胨液体培养基(TSB)； 沙氏葡萄糖液体培养基 (SDB)； 胰酪大豆胨琼脂培养基 (TSA)； 沙氏葡萄糖琼脂培养基 (SDA)； 梭菌增菌培养基。
培养温度：细菌：30复苏方法图示：
标准储备菌种保存
保存媒介：甘油冷冻管 琼脂斜面培养基 瓷珠保存管
反应原理：沙门氏菌不发酵乳糖，使 斜面呈红色，发酵葡萄糖，而使底层 呈黄色，且能分解培养基中的硫氨基 酸，生成H2S，H2S遇铅或铁离子形 成黑色的硫化铅或硫化铁沉淀物。
三、培养基适用性检查—无菌检查
无菌性检查 每批培养基随机抽取5瓶（支），各置相应规定温度培养
14天，应无菌生长。
培养基灵敏度检查
uMPN法：仅用于需氧菌总数没有适宜计数方法的情况下 u 九管法：连续3个稀释级，取1ml供试液接种于9~10ml胰酪大豆胨液体 培养基，每级制备3份，置30~35℃培养3天，观察是否有微生物生长， 查微生物最可能检索表，得到供试品需氧菌总数的最可能数。