蛋白质工程的研究
生命科学中的蛋白质工程研究
生命科学中的蛋白质工程研究蛋白质是生命体系中最为重要的分子之一，它们既是细胞的基础结构，也是调节、催化和传递信息的关键分子。
随着人类对于生物系统的研究不断深入，蛋白质工程日渐受到广泛的关注和重视。
蛋白质工程是将生物大分子的结构与功能进行改造和设计以获得特定特性的一种技术手段。
在生命科学领域中，蛋白质工程的研究涉及到基因工程、生物物理、化学、计算机及统计学等多个领域，其广泛应用于药物开发、工业生产、环境保护以及农业生产等众多领域。
蛋白质工程的目的是改变蛋白质的结构、稳定性、活性以及特异性，通过合适的设计策略提高蛋白质的功能性能，使之更好地服务于生命科学的诸多领域。
基于蛋白质工程的技术手段，科学家们不仅可以改变蛋白质的天然结构和功能，还可以将不同物种之间的新颖功能融合到人类细胞中，并在细胞间相互传递。
蛋白质工程的方法主要包括蛋白质突变、重组、翻译后修饰和拼合等多种技术手段。
其中，对于生产高效生物催化剂、工业用途的生物制造以及药物开发中的蛋白质工程研究，产生了十分显著的技术应用。
蛋白质突变是蛋白质工程中最为常用的手段之一，其目的是在蛋白质序列中，以单体的方式进行改变，从而实现蛋白质的基本结构和功能的改变。
蛋白质突变可以通过PCR技术、基因重组等手段进行操作，从而将突变的DNA序列重定向到目标物品上。
这项技术已经广泛应用于药物开发、制药工业、质谱学和蛋白质结构研究等领域。
蛋白质重组是将异源蛋白质种的基因结构重组到宿主细胞中，使得宿主细胞能够产生外源性的蛋白质。
该技术因其高效、产量高、质量好的优点，已成为了生产重组蛋白质等新型药物的主要工序。
压缩感分辨率，角分辨率，垂直分辨率和时间分辨率为这种技术的重要性质。
鉴于现今世界对于新型药品的需求，蛋白质重组技术有望进一步提高其成本效益，推动市场发展。
蛋白质翻译后修饰是指蛋白质在生物体内的翻译后，通过不同的酶或调节因子等蛋白质进行几乎所有的修饰行为。
其中，糖基化是最为常见的一种翻译后修饰方式。
蛋白质工程的研究策略
蛋白质工程的研究策略蛋白质工程是研究如何将蛋白质结构与功能结合起来的一门学科。
随着现代分子生物学和生物化学的发展,蛋白质工程已经成为生命科学研究的重要领域之一。
本文将探讨蛋白质工程的研究策略,包括蛋白质结晶、蛋白质纯化、蛋白质结构预测和蛋白质功能研究等方面。
1. 蛋白质结晶蛋白质结晶是蛋白质工程中的第一步。
通过蛋白质结晶,我们可以获得单个蛋白质分子的大小、形状和结构等信息,从而对蛋白质的结构和功能进行初步研究。
蛋白质结晶的方法包括溶剂热法、溶胶-凝胶法、离子交换树脂法等。
溶剂热法是最常用的方法之一。
这种方法利用溶剂热反应,将蛋白质分子从溶液中结晶出来。
在溶剂中加入适量的结晶溶剂,使蛋白质分子在溶剂中溶解,然后加热溶剂,使蛋白质分子逐渐结晶。
溶剂热法的优点是可以结晶出多种不同类型的蛋白质,而且操作简便,成本较低。
溶胶-凝胶法是另一种常用的蛋白质结晶方法。
这种方法利用蛋白质分子在凝胶中的特性,将蛋白质分子从溶液中结晶出来。
在凝胶中加入适量的蛋白质浓度和特定的溶剂,使蛋白质分子在凝胶中扩散,最终形成结晶体。
溶胶-凝胶法的优点是可以结晶出高纯度的蛋白质,而且可以得到不同结构的蛋白质。
离子交换树脂法也是一种常用的蛋白质结晶方法。
这种方法利用离子交换树脂的离子性质,将蛋白质分子离子化,然后将其吸附在树脂上。
通过改变树脂的结构和参数,可以得到不同结构的蛋白质。
2. 蛋白质纯化蛋白质纯化是保证蛋白质结构与功能一致性的关键步骤。
蛋白质纯化的方法包括电泳分离、离心分离、化学分离等。
电泳分离是最常用的蛋白质纯化方法之一。
这种方法利用蛋白质分子在泳道中的特征,将蛋白质分子从混合物中分离出来。
通过调整泳道参数,可以得到不同结构的蛋白质。
离心分离是另一种常用的蛋白质纯化方法。
这种方法利用蛋白质分子在离心力下的特性,将蛋白质分子从混合物中分离出来。
通过调整离心力参数,可以得到不同结构的蛋白质。
化学分离也是常用的蛋白质纯化方法。
蛋白质工程在食品安全中的应用研究
蛋白质工程在食品安全中的应用研究协议关键信息1、研究目的明确蛋白质工程在提升食品安全方面的具体目标和预期成果。
2、研究范围界定蛋白质工程应用于食品安全的领域和环节。
3、研究方法详述采用的实验、分析和评估手段。
4、时间安排设定各个研究阶段的起止时间。
5、责任与义务明确参与各方在研究中的职责和应尽义务。
6、成果归属确定研究成果的所有权和使用权限。
7、风险与应对分析可能面临的风险及相应的解决措施。
1、引言11 蛋白质工程的发展现状111 简述蛋白质工程的技术进展和应用领域。
112 强调其在解决食品安全问题上的潜力。
12 食品安全的重要性121 阐述食品安全对公众健康和社会稳定的影响。
122 分析当前食品安全面临的挑战。
2、研究目标21 开发新型食品安全检测方法211 利用蛋白质工程技术设计高灵敏度的检测试剂。
212 提高检测的准确性和特异性。
22 改进食品加工过程中的蛋白质稳定性221 研究如何通过蛋白质工程增强蛋白质在加工过程中的抗变性能力。
222 减少加工过程中有害物质的产生。
23 研发具有抗菌和保鲜功能的蛋白质231 利用蛋白质工程创造具有抗菌活性的蛋白质。
232 延长食品的保质期，降低食品腐败的风险。
3、研究范围31 食品中蛋白质的结构与功能分析311 对各类食品中关键蛋白质的结构进行解析。
312 研究其功能与食品安全的关系。
32 蛋白质工程技术在食品添加剂中的应用321 开发安全、高效的蛋白质类食品添加剂。
322 评估其对食品品质和安全的影响。
33 蛋白质工程与食品包装材料的结合331 研究具有抗菌、阻隔性能的蛋白质包装材料。
332 测试其在实际应用中的效果和安全性。
4、研究方法41 基因工程技术411 介绍基因编辑和重组技术在蛋白质工程中的应用。
412 说明如何通过基因改造获得所需的蛋白质特性。
42 蛋白质结构预测与设计421 运用计算机模拟技术预测蛋白质结构。
422 基于结构设计具有特定功能的蛋白质。
蛋白质工程研究的基本内容
蛋白质工程研究的基本内容下载温馨提示：该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by the editor. I hope that after you download them, they can help yousolve practical problems. The document can be customized and modified after downloading, please adjust and use it according to actual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types of practical materials, such as educational essays, diary appreciation, sentence excerpts, ancient poems, classic articles, topic composition, work summary, word parsing, copy excerpts,other materials and so on, want to know different data formats and writing methods, please pay attention!蛋白质工程是一门综合性的研究领域，旨在设计、改造和生产具有特定功能和性质的蛋白质分子。
蛋白质工程技术的研究与应用
蛋白质工程技术的研究与应用近年来，随着科技的不断发展和进步，人们对于生命科学的研究和应用越来越深入，其中一个重要的方向就是蛋白质工程技术。
蛋白质作为生命体的基本组成部分，它的研究和应用一直是生命科学领域的重要课题，而蛋白质工程技术的出现，则为人们提供了更多的可能性和发展空间。
一、蛋白质工程技术的研究和发展蛋白质工程技术是指对蛋白质分子进行人工改造和设计，使其具有更符合人类需求的性质、结构和功能的技术。
这种技术主要通过对蛋白质分子的基因序列、空间构象、化学结构等方面进行调整和改变，从而获得具备特定功能或性质的新型蛋白质。
蛋白质工程技术的研究和发展已经成为了当今生命科学领域的热点之一。
目前，蛋白质工程技术主要包括以下几种类型：1. 蛋白质表达与纯化技术。
这是蛋白质工程技术中最基础的一种类型，它主要是通过对蛋白质基因进行重组和表达，在细胞内大量生产目标蛋白质，并对其进行提纯和纯化，从而获得高品质的蛋白质样品。
2. 蛋白质结构与构象解析技术。
这种技术主要是通过利用X射线晶体学、核磁共振等技术手段对蛋白质样品的结构和构象进行精细分析和解析，从而了解其在三维空间中的构成和结构特点。
3. 蛋白质设计与改造技术。
这种技术主要是通过对蛋白质基因和分子结构进行人工设计和改造，从而获得具有一定特殊功能或属性的新型蛋白质。
二、蛋白质工程技术的应用蛋白质工程技术的应用领域非常广泛，涵盖了生物制药、生物能源、生物催化、食品、保健品等多个领域。
下面简单介绍一下其中几个比较重要的应用领域。
1. 生物制药领域。
蛋白质工程技术在生物制药领域的应用非常广泛，可以用于生产各种治疗性蛋白质、抗体、酶等生物制剂，从而为临床治疗提供更好的选择和有效的帮助。
2. 生物能源领域。
蛋白质工程技术可以用于生产能量生产生物质，如生物柴油、生物气和生物酒精等，从而代替传统的化石能源，降低对环境的污染和损害。
3. 食品和保健品领域。
蛋白质工程技术可以用于生产具有特殊功能的新型蛋白质，如特殊食品原料、保健品成分等。
蛋白质工程在生命科学中的应用研究
蛋白质工程在生命科学中的应用研究随着生物技术的不断发展，蛋白质工程逐渐成为生命科学领域中的重要研究方向。
蛋白质作为生命体内最基本的功能分子之一，承担着生命活动的重要功能。
然而，随着对生命机理研究的深入，人们发现自然界中存在的蛋白质不能完全满足人类的需求，因此需要通过蛋白质工程技术对蛋白质进行改造，以满足不同领域的应用需求。
一、蛋白质工程的定义及意义蛋白质工程是一种对蛋白质进行改造的技术，通过改变蛋白质的序列或结构，使其获得新的性质或功能。
蛋白质工程能够使蛋白质表现出更高的稳定性、更强的活性、更好的溶解性、更小的体积等良好性质，具有广泛的应用前景。
二、蛋白质工程的基本技术1. 基因重组技术：基于PCR扩增、限制性内切酶切割和连接等技术使目标基因得以被克隆、合成、定向进行定点改变，从而实现蛋白质序列的构建。
2. 蛋白质表达技术：使用真核或原核细胞等载体，添加目标蛋白质编码基因来表达目标蛋白质。
3. 蛋白质纯化技术：结合目标蛋白质的性质，采取逆向拓扑法、亲和柱层析法等方法进行纯化。
4. 蛋白质分析及测定技术：包括分子量测定、色谱分析、氨基酸序列分析、同位素标记等方法。
三、蛋白质工程在医学中的应用蛋白质工程技术对于制造生物药物具有重要的作用，许多生物药物的研制都采用了蛋白质工程技术。
例如，利用蛋白质工程技术对免疫球蛋白进行改造，可以制造出针对特定疾病的抗体药物。
目前，人类已经利用蛋白质工程技术成功地制造出多种生物药物，如白蛋白、EPO、血细胞生长因子等。
四、蛋白质工程在生物技术中的应用蛋白质工程技术可以使流感病毒的基因被改造，使其具有特定的抗体，以达到制造抗流感疫苗的效果。
蛋白质工程技术在农业应用方面，可以用来改良作物品种，提高作物的产量和抗病能力。
基于蛋白质工程技术开发的酶类产品、粘合剂、饲料添加剂也具有重要的应用前景。
总结：蛋白质工程技术在生命科学中具有广泛的应用前景。
通过对蛋白质进行改造，可以使其获得新的性质或功能，满足不同领域的应用需求。
蛋白质工程和人工酶的研究和应用
蛋白质工程和人工酶的研究和应用蛋白质是生命活动中不可或缺的物质，在细胞内发挥着重要的催化、运输、信号传递等功能。
近年来，随着生物技术的发展，人们开始重视对蛋白质的研究和应用。
其中，蛋白质工程和人工酶的研究和应用成为热门话题。
本文将以此为主题，探讨蛋白质工程和人工酶的研究进展、应用现状及前景展望。
一、蛋白质工程的研究进展为了实现人类对蛋白质的更深入理解、更高效利用和更精确控制，人们提出了蛋白质工程的概念，即应用基因重组、突变、构建等手段对蛋白质进行修饰和改造，使其具有更好的性能和功能。
蛋白质工程的研究涉及到许多领域，如基础科学、医药学、食品工业等，这里介绍其中几个重要的方向。
1. 基因重组技术利用基因重组技术可以将两个不同物种的基因进行重组，产生具有新性状的蛋白质。
例如，将鼠的免疫球蛋白基因和人的免疫球蛋白基因进行重组，可以产生人-鼠嵌合型免疫球蛋白，用于治疗某些疾病。
此外，还可以将两种酶基因进行重组，产生具有更高催化效率的蛋白质。
2. 突变技术通过突变技术可以产生蛋白质的不同形态或性质，如改变酶的催化活性、选择性、稳定性等。
例如，将胰岛素的丝氨酸替换为脯氨酸，就可以得到抗胰岛素的药物。
此外，还可以利用突变技术优化抗体的结构和亲和力，用于治疗癌症等疾病。
3. 构建技术构建技术可以通过合成不同肽段或蛋白质区域实现蛋白质的修改和修饰，如纯化、过滤、结晶等，从而达到改变蛋白质功能和结构的目的。
例如，将含有低氧感受器域的蛋白质进行构建，可以得到与肿瘤发生相关的蛋白质，为癌症治疗提供了新的思路。
二、人工酶的研究进展人工酶，即由非酶性物质构建的具有酶活性的体系，是生物催化领域的一个重要研究方向。
相较于天然酶，人工酶具有更好的稳定性、特异性和选择性，能够用于催化试剂合成、生物转化、环保等多个领域。
1. 化学人工酶化学人工酶是利用小分子化合物模拟酶的活性和选择性，从而实现生物催化的过程。
其中，小分子主要包括有机配体、有机催化剂等。
化学生物学中的蛋白质工程研究
化学生物学中的蛋白质工程研究蛋白质是生物体内重要的组成元素，也是生物体内发挥重要生理功能的基础。
研究蛋白质的结构和功能，以及对其进行工程改造，对于深入了解生物系统的结构与功能有着极为重要的作用。
因此，蛋白质工程在化学生物学领域中占据着非常重要的地位。
它通过改变蛋白质的结构和性质，探究蛋白质的各种生理功能和导致其功能失调的原因，进而为科学家们创造出更有效的技术和催化剂开发出更可靠高效的药物提供了基础和保证。
蛋白质工程的历史和现状早在二十世纪初期，人们就开始尝试将外源蛋白质（如胰岛素）投入体内，实现糖尿病的治疗。
但当时生物技术和低效的分离纯化工艺不允许人们将这一技术应用于大规模生产。
而随着基因工程和蛋白质工程的发展，这一技术逐渐得到完善和广泛应用。
随着人们对蛋白质结构和功能的了解越来越深入，蛋白质工程技术也得到了进一步的发展。
目前，蛋白质工程已成为生物化学和生物医学领域中的一个重要分支，并得到越来越广泛的关注。
蛋白质工程的主要研究内容蛋白质工程主要分为两个方面：一、基础研究基础研究主要针对蛋白质的结构和功能，通过对蛋白质的构造和作用机制进行深入研究，探究蛋白质分子在异类物质中的作用。
比如，研究一些重要的结构基元，如螺旋和β折叠等，以及这些基元之间如何运作组成了蛋白质结构。
同时，通过对蛋白质结构的误差修正和重构，可以改变其理化性质和功能。
二、应用研究应用方面主要涉及蛋白质在人类健康、农业等领域中的应用。
特别是在药物开发方面的应用，如利用蛋白质工程技术来研究早期阶段药物的安全性和有效性，以及开发新型的蛋白质药物等，都是近年来研究的热点方向之一。
蛋白质工程的应用目前，蛋白质工程的应用已经广泛涉及生物科技、医药制药、工业生产和食品添加剂等领域。
有三个主要的应用方向。
一、生物科技蛋白质工程技术结合基因工程、细胞工程、分子生物学等先进技术，可以制备高效的酶、蛋白质药物、干扰素、抗体、免疫检测试剂等。
二、化学制药蛋白质药物已成为医药制药研究的主要方向之一。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
1 胰蛋白酶的蛋白质工程
我们早期开展的蛋白质结构与功能的研究工作, 选择了胰蛋白酶自溶作用为对象, 研究猪 胰蛋白酶在有限度的自溶过程中化学结构的变化及其对酶活性的影响。胰蛋白酶属于丝氨酸 蛋白酶类, 是一条具有223个氨基酸残基和以异亮氨酸为 N 末端的单肽链。胰蛋白酶即使在温 和的条件下, 也很容易发生自溶作用。在60年代中期, 我们曾从猪胰蛋白酶的自溶产物中应用 离子交换纤维素柱层析和葡聚糖凝胶过滤分离出几个具有酶活性的蛋白峰。由于工作的中断, 对于这些活性产物未作进一步的鉴定。1978年后, 又重新开展了这一研究, 发现猪胰蛋白酶虽 比牛胰蛋白酶较为稳定, 但还是很容易发生自溶作用。自溶产物经层析分离, 得到4个组分具有 胰蛋 白酶 活性, N 末端 基分析 表明在 这些 活性产 物中, Ar g117-Val118, Lys145-Ser146, 及
2. 328
0. 562
0. 467
0. 358
野生型鼠胰蛋白酶
0. 424
0. 303
0. 145
6. 1×10- 3
突变体 R62D
0. 312
—
99. 6×10- 3 —
突变体 K97E
0. 15×10- 3
1. 7×10- 3
—
—
突变体 K175E
酶
天然酶 缺失突变体 R117E R117L R117M R117C
Km
/ LmolõL- 1 24. 08 16. 60 2. 67 4. 52 8. 32 —
K cat
/ s- 1 12. 34 11. 11
0. 056 74. 04
6. 01 —
Kca t/ Km
/ Lõ( s õLmol) - 1 0. 51 0. 67 0. 021
16. 38 0. 72 —
相对
活性 1 1. 31 0. 041
31. 97 1. 41 0
半衰期
10. 5 13. 5 12. 5 12. 5
8. 0 —
可见, 大部分突变体的稳定性有所提高, 与预想结果相符, Arg117Cys 突变体没有活性[7], 而 Arg117 Leu 的活性比野生型提高了31倍。
2. 2 A-A 结构域突变体结构与功能的研究
分别用 PCR 和限制性内 切酶酶切的方法获得两段小鼠 MT-Ⅰ A-结 构域的基因, 并与 pGEX-4T-1融合表达载体连接、表达, 经过超声破碎、Glutat hione Sepharose 4B 亲和层析、凝 血酶酶切以及 Sephadex G50分子筛纯化等步骤, 最后得到了突变体蛋白。突变体蛋白的产率 约为每 L 培养基3～4 mg 蛋白。脱金属后突变体蛋白的分子量、氨基酸组成分析和 N 端部分 氨基酸序列测定结果均与预期值相符, 二价金属与各突变体蛋白的结合比率也为预期的8÷1左 右, Cd 和 Zn 从 A-A结构域突变体蛋白上的半解离 pH 值与天然兔肝 MT 和表达的小鼠 MT 都非常相近, 表明这些突变体蛋白仍具有金属硫蛋白的特征。在不同 pH 时分别对这3种 Cd 饱 和的 A-A结构域突变体蛋白进行了紫外扫描光谱和圆二色谱( CD) 的测定。各突变体蛋白的紫 外吸收谱线与小鼠 MT-I 是基本一致的, 即在 pH 8. 0时, 所有的 Cd 结合蛋白都在250 nm 处呈 现较高的吸收值; 当 pH 降至2. 0时, 由于金属从蛋白上的解离, 这一吸收肩完全消失。在 CD 谱中, 258 处的峰同样表示 结合簇, 并且随 降至2. 0而消失; 其中258 处的峰为 -
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ0 引 言
生物技术的兴起使得分子生物学的理论与工程实践紧密结合。70年代初, DNA 重组技术 诞生[ 1] , 并成功地用于基因操作, 从而产生了基因工程[ 2] 。80年代初, 产生了蛋白质工程[ 3] , 即 通过对蛋白质已知结构和功能的了解, 借助计算机辅助设计, 利用基因定位诱变等技术改造基 因, 以达到改进蛋白质某些性质的目的。蛋白质工程的出现, 为认识和改造蛋白质分子提供了 强有力的手段[ 4] 。
2. 1 单一 MT 结构域结构与功能的研究
同时用蛋白酶水解和大肠杆菌表达两种方法获得了单一的 MT 结构域。前者是将提取的 天然 MT 蛋白脱去金属后, 再根据不同结构域对不同金属的亲和性不同, 在脱金属 MT 中加 入一定量的金属离子部分饱和蛋白, 然后用枯草杆菌蛋白酶酶切, Sephadex G75层析纯化得 到单一的结构域[ 12] 。大肠杆菌表达则是将 A-结构域基因插入表达载体 pGEX-4T -1中表达成 融合蛋白[ 13] , 再经亲和层析、凝血酶酶切及分子筛层析等方法获得 A-结构域蛋白。这些结构域 的氨基酸组成、分子量、金属结合比率等结果与预期基本是一致的。另外, 测定了它们的紫外吸 收光谱和圆二色谱, 也具有与天然 MT 相似的特征, 用原子力显微镜可以观察到球状结构。所 有结果表明, 两种方法得到的单一结构域均能独立形成以金属-巯基结合簇为中心的结构, 并 具有与完整的天然 MT 相似的金属结合特征。
DOI：10.13209/j.0479-8023.1998.109
北京大学学报( 自然科学版) , 第 34 卷, 第 2-3 期, 1998 年 4 月 Act a Scientiar um Nat ur alium Universit atis Pekinensis, Vol. 34, No. 2- 3 ( Apr , 1998)
表2 胰蛋白酶及其突变体的 Kcat/ Km Table 2 K cat/ Km values of tr ypsin and it s mutants
Lõ( sõmmol) - 1
胰蛋白酶种类
pH6. 85
TA ME 底物
TL ME 底物
pH8. 85
T AME 底物
T LME 底物
脏器提取牛胰蛋白酶*
此外, 我们还进行了精氨酸底物专一性的改造, 通过将酶分子表面的正电荷改变成负电
荷, 以提高催化基团 His57的 pKa 值, 从而在 pH 较高的条件下显示出对精氨酸更高的专一
性。我们选择了 Arg 62 Asp, Lys 97 Glu 及 Lys 175 Gl u 作为研究目标, 进行了组合突变得到了 如表2所示的结果。
此外, 我们还进行了胰蛋白酶特异二硫键的研究。与同源的胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶相 比, 胰蛋白酶具有( 22, 157) 和( 129, 232) 两对特异性二硫键。对( 22, 157) 这对二硫键定位改造 的结果表明: Cys 22 Ser 失去胰蛋白酶活性, 而 Cys157 Ser 和 Cys 22 Ser/ Cys157 Ser 均保持了 酶活性。对( 129, 232) 这一对二硫键进行定位改造, 也得到了相似的结果。 232 丧失了
第 2-3 期 唐建国等: 蛋白质工程的研究 34 5
结 构域的 Cd 结 合簇, 而220nm 左右 的小 峰则 归因 于 MT 的 B-结构 域。用原 子力 显微 镜 ( AF M) 观测其中一个 A-A结构域突变体的构象, 与小鼠 MT -I 类似, 可以看到两个相连的大小 相等的球状结构。所有这些结果都证明了即使没有 B-结构域的存在, A-A结构域突变体也能够 独立形成两个以金属-巯基结合簇为中心的球形结构。各突变体蛋白与不同金属结合的亲和性 不同, 对于 Cd 的亲和性大小的顺序是 A-KKS-A> A-SKKS-A> A-GKKST -A> 小鼠 MT -I; 而对 于 Zn, 仅 A-KKS-A具有比小鼠 MT-I 更强的亲和性。这说明不同的连接区对于蛋白与金属的 结合能力有一定的影响; 连接区越长, 蛋白的金属结合能力就越弱, 而天然金属硫蛋白的连接 区在这些突变体中仍然是最佳选择。这些突变体蛋白对于自由基的拮抗能力为: A-SKKS-A> A-KKS-A> A-GKKST -A> 小鼠 MT-I, 即所有突变体蛋白都具有比天然 MT 更强的拮抗自由 基能力。这一结果也说明 MT 抗自由基的活性中心可能存在于 A-结构域, 但这需要更深入的 实验来证明。以上所有结果表明, 用分子剪裁的方法所得到的 A-A突变体蛋白均具有与天然金 属硫蛋白类似的结构和功能, 证实了 A-结构域的独立性, 同时也说明两个结构域之间的连接 区对于整个蛋白分子的功能行使起着相当重要的作用。通过体外实验筛选出一种具有比天然 MT 分子更强生物功能的突变体: A-KKS-A, 并将其基因转入植物, 以应用于环保工作, 如检测 或清除重金属污染等等。
3 44 北京大学学报( 自然科学版) 百年校庆 纪念专刊 第 34 卷
胰蛋白酶活性, 而 Cys129 Ser 和 Cys129 Ser/ Cys 232 Ser 均保留了酶活性[8]。进一步的研究正 在进行中。
2 金属硫蛋白的蛋白质工程
金属硫蛋白( Met allot hionein, MT ) 是一类富含半胱氨酸的小分子蛋白质, 其61个氨基酸 中含有20个半胱氨酸, 可以通过巯基结合大量金属元素。它在自然界广泛存在, 在体内微量金 属元素的运输、储存及代谢, 重金属解毒、拮抗自由基和电离辐射等方面起着重要的作用。MT 一般由两个大小相近、结构和功能类似的结构域组成: A-结构域( 4个二价金属和11个 Cys) 和 B-结构域( 3个二价金属和9个 Cys) , 并由连接区的一段小肽( KKS) 连接。以往的实验结果表 明, 这两个结构域对于不同的金属具有各自独立的亲和能力[9] 。为研究其中单一结构域的结构 和功能的独立性, 同时也为获得一种结构稳定, 并具有比天然 MT 更高的金属结合能力的突 变体, 我们进行了以下几方面的工作: ( 1) 分别用蛋白酶水解天然 MT 和大肠杆菌表达的方法 获得单一的结构域, 并研究其结构与功能; ( 2) 用基因工程的方法构建了3个具有不同的连接 区的 A-A结构域突变体, 即 A-KKS-A( 以天然连接区连接) 、A-SKKS-A和 A-GKKST -A, 并研究 其结构与功能; ( 3) 将单一 A-结构域和多拷贝 A-结构域( A12) 基因转入植物, 研究转基因植株对 重金属抗性的提高[ 10, 11] 。