RP-HPLC
RP-HPLC-MS 方法分析几种蛋白的 胰蛋白酶酶解多肽产物的条件优化
RP-HPLC-MS方法分析几种蛋白的胰蛋白酶酶解多肽产物的条件优化引言在生物体内，蛋白的翻译后修饰过程是蛋白发挥各种不同生化功能的基础，这些翻译后修饰包括糖基化、氧化、甲基化和磷酸化等。
作为生物药物的蛋白在生产、运输、保存过程中会产生变体，从而影响到药物的活性和稳定性。
因此蛋白的肽谱经常被用来研究蛋白的翻译后修饰过程以及蛋白变体的存在。
同时也用于生物制药行业蛋白产品初级结构的确认 [1-3] ，从而更好地控制生化药品的质量和确保病人的用药安全。
本文采用胰蛋白酶酶解蛋白的方法，得到各种蛋白的肽谱，比较几款不同的反相色谱柱在分离蛋白酶解片断时的差异，同时借助质谱，评价蛋白酶解产物-多肽在酸性或者碱性流动相条件下表现出分离性能的差异。
仪器配置Thermo Ultimate 3000系统：泵：DGP-3600RS；自动进样器：WPS-3000TRS；柱温箱：TCC-3000RS；检测器：DAD-3000RS 质谱：TSQ Vantage色谱软件：Chromeleon 6.8测试条件与紫外检测器兼容的液相色谱条件色谱柱： 1- Acclaim 120 C18, 3mm×150mm, 3µm (P/N063691, S/N001119)；2-Acclaim 120 C8, 2.1mm×100mm, 3µm (P/N059123, S/N001337)；3-Hypersil GOLD C4, 2.1mm×150mm, 1.9µm (S/N1008512×7, LOT10603)；流动相： 95%超纯水+5%乙腈+0.1%TFA：5%超纯水+95%乙腈+0.08%TFA, 梯度洗脱：Time/min A/%B/%098240406040.1208045208045.198260982流速：0.5 mL/min (ID=3mm), 0.25 mL/min (ID=2.1mm)分析时间：60 min检测器波长：214 nm进样量：20 µL柱温：35 ℃与质谱兼容的液相色谱条件色谱柱：1- Acclaim 120 C18, 3mm×150mm, 3µm (P/N063691,S/N001119)；2-Acclaim 120 C8, 2.1mm×100mm, 3µm (P/N059123, S/N001337)；3-Hypersil GOLD C4, 2.1mm×150mm, 1.9µm (S/N1008512×7, LOT10603)；流动相：A：2%乙腈, B：98%乙腈, C：10 mmol/L 醋酸铵，用乙酸调节pH=3.75, D：10mmol/L 醋酸铵，用氨水调节pH=9.79,梯度洗脱：Time/min A/%B/%C/D% -5.0782200.0782206030502060.108020650802065.1782207578220张婷婷金燕赛默飞世尔科技（中国）有限公司2流速：0.5 mL/min (ID=3mm), 0.25 mL/min (ID=2.1mm)分析时间：60 min质谱条件：离子化方式： ESI, Positive Voltage: 3000 V; Capillary Temperature: 350.0 ℃ Vaporizer Temperature: 400.0 ℃Sheath Gas Pressure: 40.0 arb, Ion Sweep GasPressure: 0 arb Auxiliary Gas Pressure: 12.0 arb; Scan Range ：150- 1500 m/z 质谱扫描参数：Scan time 0.286 s 分辨率：Q1Peak Width 0.7 FWHM.进样量：20 µL 柱温：35 ℃样品前处理准备牛血清白蛋白(BSA)、马肌红蛋白、细胞色素C 以及胰蛋白酶(Trypsin)四种蛋白标准品。
枸橼酸离子测定(RP-HPLC)
附录Ⅶ H 枸橼酸离子测定法第二法高效液相色谱法离子色谱法第三法高效液相色谱法照高效液相色谱法（附录）测定色谱条件和系统适用性试验色谱柱：18烷基硅烷键和硅胶填充色谱柱（柱长250mm ，柱直径4.6mm，内径5μm），例如Waters S ymmetry S heild RP18（250mm ×4.6mm i.d.,5μm）。
流动相：18.2mmo l/L 磷酸盐缓冲液，0.1%异丙醇溶液（pH 2.0~2.5）；柱温：40℃；流速：1.0 mL/min；样品池温度：室温；运行时间：50min；紫外检测器检测波长：210nm。
取5.0mmol/L 的枸橼酸离子溶液20μl，注入色谱柱，记录色谱图，拖尾因子按枸橼酸离子色谱峰测定应为0.95~1.40。
测定法精密称取经减压干燥至恒重的枸橼酸钠（C6H5Na3O7·2H2O）0.735g，置100ml容量瓶中，用超纯水溶解并稀释至刻度。
精密量取5.0ml、10.0ml、15.0ml，分别置25ml容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得相对应的5.0mmo l/L、10.0 mmo l/L、15.0 mmo l/L枸橼酸离子对照溶液。
分别精密量取20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；另精密量取供试品溶液1ml，置15ml离心管中，精密加 1.5%磺基水杨酸4ml，混匀。
室温静置2小时以上，以每分钟3000转离心10分钟。
取上清液，同法测定。
以标准溶液枸橼酸离子浓度对峰面积进行直线回归，求得直线回归方程。
计算出供试品溶液枸橼酸离子含量（mmo l/L），再乘以相应的供试品稀释倍数（5），即为供试品枸橼酸离子含量（mmo l/L）。
[附注]（1）根据供试品枸橼酸离子含量，可适当调整枸橼酸离子对照品溶液浓度。
（2）根据供试品蛋白浓度不同，可以适当调整沉淀剂磺基水杨酸的加量。
（3）直线回归相关系数R应不低于0.999。
RP-HPLC法测定人血浆中头孢拉定的浓度
ＲＰ－ＨＰＬＣ法测定人血浆中头孢拉定的浓度目的：建立测定血浆中头孢拉定浓度的高效液相色谱法。
方法：色谱柱为DiamonsilTM C18柱（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：0.05 mol/L KH2PO4-乙腈（85∶15）；柱温：35℃；流速：1.0 ml/min；检测波长：262 nm；进样量：20 μl。
结果：头孢拉定在0.5~40.0 μg/ml范围内有良好的线性关系，r=0.999 9；血浆中药物最低检测浓度为0.25 μg/ml（S/N=3）；提取回收率为75%；血浆中三种浓度回收率分别为(106.0±6.3)%、(103.0±4.6)%、(97.5±1.2)%，日内、日间RSD 分别为4.9%、2.6%、1.0%及7.9%、3.2%、1.9%。
结论：本法操作简单、快捷、专属性强，方法灵敏度和准确度均较高，适用于头孢拉定血药浓度及生物利用度的测定。
标签：头孢拉定；高效液相色谱；血药浓度头孢拉定是第一代头孢菌素类抗生素，是目前临床上用来治疗呼吸道、泌尿道和皮肤软组织等轻、中度感染的常用药物之一。
目前头孢拉定在国内应用广泛，对头孢拉定的研究很多。
头孢拉定在组织体液中分布良好，它在心肌、子宫、肺、前列腺和骨组织中皆可获有效浓度。
其中脑组织中药物浓度仅为同期血药浓度的5%~10%，脑脊液中浓度更低。
血浆蛋白结合率为6%~10%。
口服0.5 g后6 h累积排出给药量的90%以上。
头孢拉定在体内很少代谢，丙磺舒可减少本品经肾排泄。
口服本品后吸收迅速，空腹口服0.5 g，于给药1 h后可达血药峰浓度（Cmax=11~18mg/L），血消除半衰期(t1/2)约为1 h。
本文建立了测定血浆中头孢拉定浓度的高效液相色谱法。
本法操作简单、快捷、专属性强，方法灵敏度和准确度均较高，适用于头孢拉定血药浓度及生物利用度的测定。
1 仪器与试药1.1 仪器高效液相色普仪：LC-9A泵（日本岛津公司）、SPD-6A V型紫外可见检测器（日本日立公司）、N3000色谱工作站（浙江大学）；XW-80型涡旋混合器（上海手术器械厂）；TGL-16G型离心沉淀器（上海安亨科学仪器厂）。
RP—HPLC法测定缬沙坦含量
RP—HPLC法测定缬沙坦含量目的建立HPLC测定缬沙坦原料的含量。
方法供试品溶液与对照品溶液稀释相同倍数后经过精密度试验、重复性试验、稳定性试验、回收率试验、测定定量项、样品测定等步骤。
结果在进样浓度为5.0～75.0 μg/mL范围内与峰面积线性良好，r=0.9999（n=18），平均回收率为100.9%（RSD%=0.49%，n=9）。
结论该方法专属性好，准确，灵敏，用于缬沙坦含量的测定结果可靠。
标签：缬沙坦；含量；高效液相色谱；定量分析缬沙坦（Valsartan），化学名为（S）-N-戊酰基-N-{[2’-（1H-5-四氮唑-基-1，1’-联苯）-4-基]-甲基}-缬氨酸。
缬沙坦结构中含1个手性碳原子，产品为S-构型。
本文所研究的缬沙坦由湖南千金湘江药业股份有限公司研制生产。
1仪器与试药Agilent 1260高效液相色谱仪；UV-762 紫外分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；BS110S 电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）。
缬沙坦对照品由中国药品生物制品检定所提供，批号为100651-201203，含量99.8%；缬沙坦原料6批（批号20121001～20121003，20121101～20121103）。
甲醇、乙腈均为色谱纯，磷酸氢二钠为分析纯；水为二次重蒸水。
2方法与结果2.1色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水-冰醋酸（500∶500∶1）为流动相；检测波长为225 nm；流速为1.0 mL/min。
理论板数按缬沙坦峰计算应不低于4000，缬沙坦与相邻杂质峰的分离度应符合要求。
2.2 溶液制备取本品适量，精密称定，加流动相溶解并定量稀释制成约含缬沙坦0.05 mg/mL的样品溶液；另取缬沙坦对照品适量，精密称定，加流动相溶解并定量稀释制成约含缬沙坦0.05 mg/mL的对照品溶液。
2.3线性关系及标准曲线精密称定缬沙坦10 mg，置50 mL量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，分别精密量取2.5 mL，2.5 mL，4 mL，5 mL，6 mL，7.5 mL置100 mL、20 mL、20 mL、20 mL、20 mL、20 mL量瓶中，制成5 μg/mL、25 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL、60 μg/mL、75 μg/mL 6个浓度范围，用流动相稀释至刻度，摇匀。
rp-hplc纯化肽步骤
rp-hplc纯化肽步骤第一步：样品制备在进行RP-HPLC纯化之前，首先需要准备样品。
样品可以是从生物体中提取的复杂混合物，也可以是已经合成的单一肽。
如果是从生物体中提取的样品，需要进行前处理步骤，如细胞裂解、蛋白质沉淀等，以去除杂质和净化目标肽。
第二步：色谱柱选择选择合适的色谱柱对于RP-HPLC纯化过程至关重要。
常用的色谱柱包括C18、C8、C4等。
选择柱的主要考虑因素是目标肽的亲水性和疏水性特点，以及样品的复杂程度。
对于复杂样品，可以选择具有更高分离效能的柱，以获得更好的分离纯化效果。
第三步：溶剂体系选择溶剂体系的选择也对RP-HPLC纯化过程的效果有重要影响。
常用的溶剂体系包括甲醇/水、乙腈/水等。
溶剂体系的选择应考虑样品的溶解度、目标肽的亲水性和疏水性特点，以及色谱柱的适应性。
一般情况下，需要进行试验性的溶剂体系优化，以获得最佳的分离效果。
第四步：梯度洗脱RP-HPLC纯化的关键步骤是梯度洗脱。
在梯度洗脱过程中，通过改变溶剂体系的组成，将样品中的目标肽从色谱柱上洗脱下来。
一般情况下，初始时使用较为亲水的溶剂组成，逐渐增加疏水溶剂的比例，以实现肽的分离纯化。
梯度洗脱的条件需要根据具体样品的特点进行优化。
第五步：收集和分析在RP-HPLC纯化过程中，洗脱液会通过检测器进行检测，根据检测器的信号可以判断目标肽的洗脱时间。
一般情况下，可以根据检测器信号设置分数收集装置，将不同洗脱时间的肽分别收集起来。
收集的肽样品可以进行质谱分析、氨基酸分析等进一步的鉴定和表征。
第六步：纯化后处理纯化后的肽样品可能还存在一定的杂质，需要进行进一步的纯化后处理。
常见的纯化后处理方法包括凝胶过滤、透析、浓缩等。
这些处理方法可以去除残余的溶剂和盐类，提高肽样品的纯度和质量。
RP-HPLC纯化肽的步骤包括样品制备、色谱柱选择、溶剂体系选择、梯度洗脱、收集和分析以及纯化后处理。
合理选择色谱柱和溶剂体系，优化梯度洗脱条件，可以获得高纯度和高产量的肽样品。
反相高效液相色潽法RP
RP-HPLC的特点和优势
特点
RP-HPLC具有高分离效能、高灵敏度、高选择性等优点。该方法能够分离复杂样品中的微量组分，特别适合于分 离和分析生物样品和环境样品中的有机小分子。
优势
RP-HPLC的流动相选择范围广泛，可以根据不同样品的性质选择合适的流动相，提高分离效果。此外，RPHPLC使用的固定相种类也较多，可以根据分离需求进行选择。该方法操作简便，易于自动化，可广泛应用于科 研和工业生产中。
有机污染物分析
RP-HPLC可用于检测水体、土壤等环境中的有机 污染物，评估环境质量。
工业废水处理监测
通过RP-HPLC，可以监测工业废水处理过程中有 害物质的去除效果。
化工产品分析
RP-HPLC可用于分析化工产品中的组分和含量， 控制产品质量和生产过程。
THANK YOU
提高了分离性能和选择性。
应用领域
RP-HPLC广泛应用于药物分析、生化研究、环境监测、食品安全等领域。在药物分析 中，RP-HPLC用于药物的分离、纯化和质量控制。在生化研究中，RP-HPLC用于蛋白 质、核酸等生物大分子的分离和检测。在环境和食品安全领域，RP-HPLC用于检测和
监测各种污染物和有害物质。
原理
在RP-HPLC中，样品在非极性固定相和极性流动相之间的分配作用实现分离。 组分在固定相和流动相之间的溶解度差异导致不同的迁移速度，从而实现分离。
发展历程和应用领域
发展历程
RP-HPLC起源于20世纪60年代，随着高效液相色谱技术的发展而逐步完善。早期的 RP-HPLC使用硅胶作为固定相，后来逐渐发展为使用有机聚合物和混合模式固定相，
等领域。
电化学检测器
通过电化学方法对待测组分进 行氧化还原反应，从而进行检
106成品纯度RP-HPLC分析方法验证方案20120723
目录一、目的： (3)二、范围： (3)三、责任： (3)四、分析方法描述： (3)五、方案培训： (3)六、验证内容： (4)十、缩写与定义： (8)十一、参考文件： (8)十二、附件： (8)一、目的：1. 证明该方法适用注射用重组人白细胞介素-1受体拮抗剂成品纯度的测定。
2. 验证注射用重组人白细胞介素-1受体拮抗剂成品纯度测定的RP-HPLC方法的可靠性和有效性。
二、范围：1. 适用于注射用重组人白细胞介素-1受体拮抗剂成品纯度测定的RP-HPLC分析方法验证。
三、责任：四、分析方法描述：1. 仪器和色谱柱1.1 HPLC泵：二元或二元以上梯度洗脱泵1.2 HPLC检测器：UV检测器或二极管阵列检测器。
1.3色谱柱：C4，4.6×250mm，孔径300Å或相同规格的色谱柱1.4 操作条件1.4.1流动相：A：0.1%TFA的水溶液B：0.08%TFA的乙腈溶液1.4.2 流速：0.7mL/min1.4.3 检测波长：280nm1.4.4 柱温：40±2℃1.4.5 样品温度：4±2℃1.4.7 上样量：1mg/ml，20 L1.4.8 按下表进行梯度洗脱，必要时调整流动相比例，使主峰保留时间约为16分钟，主峰前后的相关蛋白与之分离度不小于1.5。
1.5 结果计算按峰面积归一法计算，主峰及其相关蛋白峰面积应不低于总面积的98%，主峰面积应不低于95%。
五、方案培训：1. 验证开始前首先由起草人对相关人员进行方案培训，按照培训管理规程的规定进行记录，并将培训记录的复印件纳入验证报告的附件。
六、验证内容：1. 相关确认1.1 仪器确认：确认相关仪器、设备经过校验，在校验合格期内。
记录表格见附件一表1。
1.2 色谱柱确认确认色谱柱的规格，序列号。
记录表格间附件一表2。
1.2 试剂、标准品和样品确认确认所用试剂、标准品和样品规格和纯度符合要求，在有效期内。
记录表格见附件一表3，4。
反向键合相色谱rp-hplc
反向键合相色谱rp-hplc反向键合相色谱（RP-HPLC）反向键合相色谱（RP-HPLC）是一种常用的色谱技术，它基于化学键合受体固定相和疏水样品相互作用的原理，实现对化合物的分离和定量分析。
本文将介绍RP-HPLC的原理、应用以及分析方法的优化。
一、RP-HPLC的原理RP-HPLC通过使用疏水固定相和溶剂系统控制溶解度差异实现物质的分离。
在RP-HPLC中，疏水固定相通常是含有C18链或者其他疏水性功能团的硅胶或化学键合硅胶，而样品则是通过疏水作用与固定相发生相互作用。
当样品溶解度与固定相相比较大时，样品将与固定相更多地发生作用，分离效果更好。
因此，RP-HPLC常用于疏水性化合物的分离。
二、RP-HPLC的应用1. 药学分析：RP-HPLC广泛应用于药学领域，用于药物的质量控制、分析和药代动力学研究。
其高分离效率和灵敏度使其成为药物分析的首选方法之一。
2. 环境监测：RP-HPLC被用于水体、空气和土壤中的有机污染物的监测和分析。
这种方法能够精确地分离和定量分析各种环境样品中的有机物质。
3. 食品安全：RP-HPLC可用于食品中添加剂、农药残留、重金属和食品中的天然毒素等的分析。
有效的分离和定量方法有助于保障食品的质量和安全。
4. 生物医学研究：RP-HPLC在生物医学研究中也有广泛应用，例如蛋白质和肽的分离和纯化，以及生物样品中代谢产物的分析等。
三、RP-HPLC分析方法的优化在进行RP-HPLC分析时，为了获得更好的分离效果和分析结果，可以采取以下优化策略：1. 选择适当的固定相：根据样品的特性选择合适的固定相材料，例如C18、C8、C4等。
不同固定相的特性会对分离效果产生影响。
2. 优化溶剂流动速度：通过调整溶剂的流动速度，可以更好地控制样品在固定相上的吸附和解吸过程，从而改善分离效果。
3. 优化pH条件：调整溶液的pH值可以改变样品的溶解度和分子电荷等特性，进而影响分离效果。
4. 调整溶剂比例：通过改变两种溶剂的比例，可以调节溶剂强度和样品与固定相的亲和性，从而提高分离效果。
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RP-HPLC法测定金钱草中槲皮素和山奈素两种黄酮成分的含量
摘要：目的建立同时测定金钱草中槲皮素和山奈素两种黄酮含量的反相高效液相色谱法，用于金钱草质量标准的研究。
方法ODS柱，甲醇-水-磷酸(500：500：1)的反相高效液相色谱系统。
结果槲皮素和山奈素分别在 3.195×0.001～0.15975μg，3.252X0.001～0.1626μg 范围内呈良好线性关系，相关系数分别为0.9999和0.9999，平均回收率分别为97.58％和102.7％，RSD分别为1.16％和1.O1％。
结论本方法简便可靠，准确，分离度好，可用于金钱草的质量控制。
关键词：反相高效液相色谱法；金钱草；槲皮素；山奈素；黄酮
金钱草为报春花科多年生草本植物过路黄(Lysimachia christinae Hance)的全草；清利湿热、通淋、消肿。
为热淋、石淋、黄疸、疮毒之要药，煎剂有显著利尿作用，并能促进胆汁从胆管排出，有排石作用。
抗菌实验对金黄色葡萄球菌有抑制作用，金钱草总黄酮及酚酸有抗炎作用。
茎叶主要含酚性成分、甾醇、黄酮类、氨基酸、鞣质、挥发油、胆碱等；根含皂苷。
除用聚酰胺柱分离了槲皮素和山奈素等5种黄酮类成分的报道外，对其单成分含量测定的方法在文献中少见报道。
我们应用RP-HPLC法对其中的两种黄酮成分进行含量测定，为质量标准研究提供科学依据。
1 仪器与试药
瑞士Mettler Toledo AG285电子天平；DZF-1真空干燥箱；ZQ-250 超声波清洗器；美国安捷伦公司高效液相色谱仪Agilentl100 Series，配置四元泵，自动进样器(进样范围为0.1～100μ1)，紫外可见光检测器，柱温箱，在线真空脱气泵，色谱工作站等。
槲皮素和山奈素对照品均由中国药品生物制品检定所提供；金钱草购自四川，经鉴定为报春花科过路黄的全草，符合《中国药典}2000版一部规定；甲醇为色谱纯；水为超纯水；其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2．1 色谱条件和系统适应性
色谱柱：Alltima Cl8柱(150mmX4.6mm，5μm)；流动相：甲醇-水-磷酸(500：500：1)(0.45μm 微孔滤膜滤过，用前超声脱气)；检测波长：360nm；柱温：30℃：流速：1.0ml/min。
在此色谱条件下，测得槲皮素(Q)、山奈素(K)对照品贮备液和供试品溶液色谱图.
可见槲皮素(Q)峰的保留时间约为9.8 min，山奈素(K)峰的保留时间约为18.1min；图Q、K两峰与相邻峰分离度均大于1.5，理论塔板数分别为3700和6229。
2．2 溶液的配制
2．2．1 对照品溶液的配制精密称取经五氧化二磷干燥过夜的槲皮素(Q)和山奈素(K)对照品适量于同一量瓶中，加甲醇制成每毫升含0.Olmg的混合溶液，作为对照品贮备液(Q为1.065 X 0.01mg/ml，K为1.084X 0.01 mg/ml)。
2．2．2 供试品溶液的制备
精密称取经粉碎的金钱草粉末2g于三角烧瓶中，加入25ml甲醇，超声处理30min，放冷至室温，用中速分析滤纸滤过，吸取续滤液20ml置分液漏斗中，用石油醚(20ml，15ml，15ml)萃取3次，除去其中的脂溶性杂质后，合并下层液，用乙酸乙酯-水(15：lO)混合液25ml分3次萃取，合并萃取液，回收乙酸乙酯，残渣加甲醇溶解并转移至25ml量瓶中，加甲醇至刻度，用O.45μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液，备用。
2．3 标准曲线的制备
倾取上述对照品贮备液置样品瓶中，以0.3、0.5、1、2,4、6、8、10、15μl体积进样，按上述色谱条件进行测定，分别以槲皮素(Q)和山奈素(K)进样量为横坐标，以峰面积积分值为纵坐标，得回归方程分别为：
槲皮素(Q)：Y=37292X，r=0.9999，线性范围为：3.195×0.001～0.15975μg
山奈素(K)：Y=39597X，r=0.9999，线性范围为：3.252×0.001～0.1626μg
结果表明槲皮素(Q)和山奈素(K)分别在3.195×0.001～0.15975μg和3.252×0.001～0.1626μg 范围内，对照品进样量和其峰面积积分值具有良好的线性关系。
2．4 精密度试验
精密吸取上述对照品贮备液1OμL，按“样品测定”项下方法操作，重复进样6次，结果测定Q、K峰面积积分值，RSD分别为0.30％和0.31％(n=6)。
2．5 重复性试验
取金钱草粉末，按照“供试品溶液制备”方法制备5份，按照“样品测定”项下方法操作，含量测定。
计算得Q和K的RSD分别为1.12％和0.31％(n=5)。
2．6 稳定性试验
精密吸取新制备的供试品溶液10 ，按“样品测定”项下方法在25℃温度下每隔1 h测定1次，共测定12次，记录峰面积，结果12次进样Q和K峰面积的RSD分别为1.91％和O.44％，表明供试品溶液在12h内稳定(n=12)。
2．7 加样回收率试验
精密称取已知含量的样品3份，分别加入同法制备的对照品贮备液(Q为0.8224×0.001mg/ml，K为1.030×0.001 mg/ml)1.0ml、1.0ml、1.5ml，按照“供试品溶液制备”方法处理，按上述色谱条件测定.
2．8 样品测定
按“2．2．2”项方法制备金钱草供试品溶液，按上述色谱条件测定，3批样品测定结果。
3 讨论
3．1 流动相的选择。
因为金钱草中的黄酮类成分含有酚羟基，呈弱酸性，故选择酸性缓冲系统。
分别比较了甲醇-水-磷酸(500：500：1)系统、乙腈-水-磷酸(330：670：1)系统、甲醇-乙腈-水-磷酸(150：165：335：1)系统，结果表明后两系统在不同流速下供试品色谱峰呈现不同程度的前沿或拖尾现象。
使用甲醇-水-磷酸(500：500：1)系统不但可以得到良好的峰形，而且目标峰与其相邻色谱峰的分离度良好，因此选择该系统作为流动相。
3．2 提取溶剂的选择。
分别比较了甲醇、50％甲醇、60％甲醇、7O％甲醇及95％乙醇、5O％乙醇、60％乙醇、70％乙醇作为提取溶剂同法处理药材粉末，含量测定结果表明，选用甲醇时峰形最好，且目标物含量较高，故选用甲醇作为该方法的提取溶剂。
3．3 提取方法的选择。
分别比较了4种提取金钱草粉末的方法：①超声波提取3O分钟后不经其它溶剂处理，直接过滤进样；②超声波提取3O分钟后，过滤，精密吸取续滤液1Oml，加25％盐酸15ml，回流提取3O分钟，加甲醇至50ml；③超声波提取3O分钟后，过滤，精密吸取续滤液2Oml置分液漏斗中，用石油醚(20ml、15ml、15m1)萃取3次，除去其中的脂溶性杂质后，合并下层液，用乙酸乙酯．水(15：lO)混合液25 lTl1分3次萃取，合并上层液，混匀，精密吸取10ml，加25％盐酸15ml，回流提取3O分钟，加甲醇至5Oml；④同“2．2”供试品溶液的制备。
结果①法目标物含量虽高，但干扰较大；②、③法目标物含量最高，但回收率不高，且考虑到黄酮苷在酸性条件下水解转化为苷元，结果要涉及到总黄酮的换算，实际工作嫌复杂；④法干扰小，目标物回收率较高，可以较真实的反映该生药中槲皮素、山奈素两种黄酮成分的含量，故选择④法测定。