单克隆抗体&疾病诊断

成就
• • 国外： 自1975年建立B淋巴细胞杂交瘤制备McAb成功以来，到现在的近30年间，又做了大 量的工作，并取得了明显的进展。美、英、日、法等国于1978年起先后建立了 McAb公司100多家，并于1979年将第一个杂交瘤产品供应市场，现已有几十种杂交 瘤细胞株和几百种McAb商品化，投入市场。现在全世界已有1 000多个实验室从事 这方面的研究工作，并形成一股McAb“生产热”，估计全世界研究建立的杂交瘤细 胞株数已达5万种以上。为交流总结McAb的研究工作经验，在法国Bussard教授的 倡议下，组成了“国际杂交瘤细胞专家委员会”，附属在国际免疫学会中；还建立 了一个“国际杂交瘤细胞及其产物McAb资料数据库”，专门搜集有关杂交瘤细胞的 信息，并回答各种咨询。 国内： 1. 至今，国内外报道的动物用单抗已达数百种，据不完全统计，其中针对畜禽病原 体的有163种，几乎包括了国内外严重流行的大多数传染病和寄生虫病。另有36种分 别针对14种动物(包括人)的免疫球蛋白单抗，另外57种分别是针对动物激素、独特 型和动物组织抗原等的单抗。这些单抗试剂主要用于下列几个方面：①用于生物医 学各学科的基础研究；②用于疾病的诊断、检疫及流行病学研究；③用于疾病预防 与治疗；④用于生物活性物质的提取；⑤用于妊娠诊断，性别鉴定和鉴别控制，促 进畜禽生长，提高家畜繁殖力等。 我国动物用单抗的研究发展亦很快，取得了多项研究成果，有的已在较大范围推广 应用，获得了显著的经济效益和社会效益，如马传染性贫血单抗诊断试剂盒和旋毛 虫单抗快速ELISA诊断试剂盒，另有10多种单抗试剂盒已完成或即将完成开发研究。
• 应用学科：
• 定义2：
• 应用学科：
• 定义3：
• 应用学科：
What单克隆抗体
• 动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，具有不 同基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体 受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激 活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分 裂增殖形成效应B细胞（浆细胞）和记忆B细胞， 大量的浆细胞克隆合成和分泌大量的抗体分子分 布到血液、体液中。如果能选出一个制造一种专 一抗体的浆细胞进行培养，就可得到由单细胞经 分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞 将合成针对一种抗原决定簇的抗体，称为单克隆 抗体。
单克隆抗体的提纯＆保存
• 一般常用金黄色葡萄球菌蛋白A－琼脂糖4B亲 和层析法。 • 单克隆抗体的保存 由腹水中获得的抗体,经离 心去除细胞成分，再经冷冻超速离心,取上清液加 0.1％NaN3，少量分装，冷冻于-70℃可保存几年。 但应避免反复冻融,否则抗体失活，特别是IgM抗 体。提纯的单克隆抗体,冷冻干燥保存于2～8℃， 取出时溶解后，保存于2～8℃，至少一个月内可 保持稳定。腹水抗体也可冷冻干燥低温(4℃)保存 两年，融化后放臵4℃下保存一个月。短期使用的 腹水抗体，4℃3～4 个月仍保持稳定, 培养上清加 0.1％NaN3，贮于-20℃，两年不失活性。
单克隆抗体
• 中文名称：
• 英文名称： • 定义1：
– 单克隆抗体 – monoclonal antibody;McAb;mAb – 高度均质性的特异性抗体，由一个识别单一抗原表位的B细胞克隆所分泌。 一般来自杂交瘤细胞。 – 免疫学（一级学科）；免疫系统（二级学科）；免疫分子（三级学科） – 只识别一种表位(抗原决定簇)的抗体，来自单个Ｂ淋巴细胞的克隆或一个 杂交瘤细胞的克隆。 – 生物化学与分子生物学（一级学科）；总论（二级学科） – 由单一杂交瘤细胞克隆分泌的只能识别一种表位（抗原决定簇）的高纯度 抗体。 – 细胞生物学（一级学科）；细胞培养与细胞工程（二级学科）
How制备单克隆抗体
1）免疫脾细胞的制备 2）骨髓瘤细胞的培养与筛选
3）细胞融合的关键: 1技术上的误差常常导致融合的失败。2融合试验最大的失败原因是 污染，融合成功的关键是提供一个干净的环境，以及适宜的无菌操作技术。
4）阳性克隆的筛选 应尽早进行。 5）克隆化 6）细胞的冻存与复苏 7）大规模单克隆抗体的制备 选出的阳性细胞株应及早进行抗体制备，因为融合细胞随培 养时间延长，发生污染、染包体丢失和细胞死亡的机率增加。抗体制备有两种方法。一是 增量培养法，即将杂交瘤细胞在体外培养，在培养液中分离单克隆抗体。该法需用特殊的 仪器设备，一般应用无血清培养基，以利于单克隆抗体的浓缩和纯化。最普遍采用的是小 鼠腹腔接种法。选用BALB/c小鼠或其亲代小鼠，先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射， 一周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去。通常在接种一周后即有明显的腹水产生，每只 小鼠可收集5～10ml的腹水，有时甚至超过40ml。该法制备的腹水抗体含量高，每毫升可 达数毫克甚至数十毫克水平。此外，腹水中的杂蛋白也较少，便于抗体的纯化。
杂 交 瘤 技 术
单 克 隆 抗 体 的 制 备
单克隆抗体的应用
• • • • • 检验医学诊断试剂 蛋白质的提纯 小分子抗体的应用 抗体融合蛋白的应用 双特异抗体的应用
检验医学诊断试剂
• • • • • 病原微生物抗原、抗体的检测 肿瘤抗原的检测 免疫细胞及其亚群的的检测 激素测定 细胞因子的测定
四、抗体融合蛋白的应用
肿瘤的体内显像诊断 单链抗体排除速度快，穿透力强，在肿瘤 组织中的分布指数较完整抗体分子高 放射显像时，放射性核素排除较快，对身 体危害程度小，显像的本底较低 理想的显像定位诊断载体 病毒的诊断和抗病毒感染 血液性疾病的诊断 白血病的免疫诊断及分型
五、双特异抗体的应用
在体外免疫检测中的应用 自身红细胞凝集试验 快速检测HBV和HIV病原体等 避免化学交联减低两者的活性，从而提高酶免疫检测的敏感度 用双特异抗体作为二抗，检测限达1ng/ml 在体内肿瘤放射免疫显像诊断中的应用 方法： 双特异抗体的一只臂结合靶抗原，一只臂结合半抗原螯合 剂，后者可选择性地与放射性核素结合，利用二次导向系统 显示 特点： 更高的的灵敏度和清晰度 在体内免疫治疗中的应用 抗体分子可与放射性核素、细胞毒药物、毒素、等多种分子相 融合，这些分子在抗体结合靶分子后可提供重要辅助功能 双功能抗体可有效针对低水平的肿瘤相关抗原，并将细胞毒物 质输送到肿瘤细胞 抗体还可与携带药物的脂质体、各种PEG偶联，从而增强体内 运输和药代动力学
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动物用单克隆抗体的发展前景
• First.动物用McAb必须走向产业化今后动物用单抗的研究重点应放在 产业化上，将现有成果转化为生产力。目前，我国动物用单抗的成果 大多数还没有产业化，其实现产业化的进程总体上很缓慢。为此，要 加速这一进程，下列几点必须引起重视。要突破“单抗建株、鉴定” 的研究框架，从研究工作开始，就应着眼其应用价值，这一问题主管 部门和研究人员都要重视。在很多方面，单抗的应用要解决的技术问 题更多更复杂，其所需的人力、物力、财力的投入亦较大。要选准产 业化的目标，以点带面，上述数百种单抗其开发应用价值不尽一致， 作为动物用单抗开发的产品，应具备一定的条件，以针对畜禽疾病单 抗试剂为例，应包括单抗针对的疾病流行范围广、发病率高、经济意 义大，或有重要的公共卫生意义；单抗能解决常规诊断试剂无法解决 的问题，如在临床上区分强毒感染和疫苗毒感染所引起的免疫应答； 单抗的适用性要大等，目前，口蹄疫、猪瘟、新城疫、伪狂犬病、鸡 传染性法氏囊病、沙门氏菌病、布鲁氏菌病、钩端螺旋体病、弓形虫 病、大肠杆菌病、畜禽Ig单抗等诊断盒应在短期内完成产业化进程。 建立产品基地，区域试验基地，促进单抗试剂的产业化。理顺单抗试 剂与常规诊断试剂、核酸探针的关系。
• Second.动物用McAb的应用领域要拓宽分析上述动物用单抗的类别， 不难看出动物用单抗研究存在很大的不平衡，有许多空白尚需填补， 如有一些主要传染病(包括人兽共患病)的病原体单抗还未研制；对于 寄生虫病病原单抗、真菌毒素单抗，以及水产业的动物病原体单抗和 生物毒素单抗、畜禽繁殖育种用单抗等国内外的研究仍处于起步阶段， 应予加强；对于畜牧兽医科学中其他学科亦应多加引入单抗技术的应 用研究，这样将更加广泛深入地促进相关学科的发展。另一方面，动 物用单抗的基础研究方面应有重点的解决一些关键问题。以动物传染 病为例，单抗与分子生物学的有机结合将越来越深入地揭示动物传染 病病原体的分子病理发生机制、抗原结构，以及特定的致病基因等。 而单抗在基因工程中的应用，加快了基因工程疫苗的研究进程。此外， 在动物传染病治疗性和预防性单抗研究仍有许多方面需要探索。 3. 研制新型抗体新型抗体是利用生物技术改建和生产的抗体，包括嵌合 抗体、重构抗体、单链抗体、单域抗体、抗独特型抗体及酶抗体等。 新型抗体的研究不仅具有重要的理论价值，而且在疾病的预防和诊疗 上的意义也日趋明显。新型抗体的研究与生产将克服常规单抗技术的 繁琐过程，不仅扩大了抗体的应用功能，而且为产业化生产带来了便 利。因此，应积极开展动物用新型抗体的研究。
二 、 蛋 白 质 的 提 纯
三、小分子抗体的应用
定义： 分子量较小但具有抗原结合功能的分子片段 优点： 分子量小,穿透性强,抗原性低 不含Fc段，不会与带有Fc段受体的细胞结合，不 良反应少 可在原核系统表达及易于基因工程操作 半衰期短，有利于及时中和及清除毒素 应用： 用于肿瘤的导向治疗 肿瘤的影像分布 基因治疗 细胞内抗体： 在细胞内表达 特异性识别某一基因产物 可干扰该基因产物的生物活性 研究基因结构与功能的关系
病原体测定： 肝炎病毒－HAV,HBV,HCV,HDV,HEV TORCH－弓形虫,风疹病毒,巨细胞病毒 ，单纯疱疹 病毒 细胞表面CD测定： CD4/CD8:Th/Tc 白血病的分型 激素的测定： 内分泌疾病的诊断 药物测定(TDM)： 抗排斥药物抗肿亲和层析中重要 的配体。将单克隆抗体吸附在 一个惰性的固相基质（如 Speharose 2B、4B、6B等） 上，并制备成层析柱。当样品 流经层析柱时，待分离的抗原 可与固相的单克隆抗体发生特 异性结合，其余成分不能与之 结合。将层析柱充分洗脱后， 改变洗脱液的离子强度或pH， 欲分离的抗原与抗体解离，收 集洗脱液便可得到欲纯化的抗 原。