结核分枝杆菌的试验室诊断
结核分枝杆菌药敏试验结果的判读
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表型药敏试验
V.S.
V.S.
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固体罗氏培养基法与液体培养基法DST的比较
不同方法
药物种类
价格 （ＲＭＢ）
从培养到获得DST 结果 2-3个月
罗氏培养基
多种（除PZA外） 15元/药
液体培养基
多种（包括PZA） >100元/药
2-4周
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微孔板法药敏试验
板式药敏试验的技术特点：
1. 包含的药物种类较多，包括是包括了一些新型的抗结核药 物，如莫西沙星，克拉霉素，阿莫西林/克拉维酸钾、氯 法齐明。 2. 获得耐药浓度，发现中度敏感/低度耐药菌株。 3. 缩短报告结果时间。一般2周，特殊情况下3周报告结果。 4. 提高了标准化程度。药敏培养板的制备实现了标准化，结 果的读取依赖专业设备，有利于质量控制。
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可能敏感株和可能耐药株的MIC分布情况 （1）
Clinically susceptible strains (PS)
Frequency of strains
Clinically resistant strains (PR)
Break Point MIC
Minimal inhibitory concentrations (MIC)
绝对浓度法
10-3 mg
IHN：1，10μg /ml SM：10，100μg /ml RFP：50，250μg /ml EMB：5，50μg /ml KM: 30μg /ml OFLX: 3μg /ml
报告结果时间
4-6周
4周
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绝对浓度法和比例法药敏试验出现结果差异
用两种药敏试验方法测定了360株结核分枝杆菌对H、R、S、E的药敏性, 两种方法的符合率： H R S E 81.1% 92.5% 83.6% 98.6%
肺结核实验室检测方法金标准
肺结核实验室检测方法金标准
肺结核实验室检测的金标准是基于培养和鉴定结核分枝杆菌。
以下是具体步骤：
1.痰液样本收集：患者需要提供早晨醒来时的深咳痰液样本，
以获得有效的细菌数量。
2.痰液预处理：痰液样本经过预处理，包括离心和去除杂质。
这一步通常包括液体化和浓缩痰液。
3.痰液培养：将预处理后的痰液接种到培养基上，通常是液体
培养基。
培养基中的结核分枝杆菌将逐渐增殖形成菌落。
4.鉴定：通过常规培养、染色和生化试验等方法，鉴定已培养
的菌落是否为结核分枝杆菌。
5.药敏试验：对已鉴定的结核分枝杆菌进行药敏试验，以确定
哪些药物对其具有抗菌作用，从而为治疗方案的选择提供依据。
此方法被认为是金标准，因为它能够准确检测到结核分枝杆菌，并且可以确定其对药物的敏感性，为结核病的诊断和治疗提供可靠的结果。
但是，该方法需要相对较长的时间（通常需要几周）来进行培养和鉴定，因此在临床实践中可能需要其他更快速的检测方法来尽早确诊结核病。
结核分枝杆菌实验报告
一、实验目的1. 了解结核分枝杆菌的生物学特性及致病机理；2. 掌握结核分枝杆菌的培养、分离、鉴定及检测方法；3. 增强实验室操作技能，提高对结核病的防控能力。
二、实验原理结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）是一种革兰氏阳性细菌，是引起结核病的病原体。
本实验通过培养、分离、鉴定及检测结核分枝杆菌，了解其生物学特性及致病机理。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：（1）结核分枝杆菌菌种；（2）牛肉浸液；（3）鸡蛋；（4）石炭酸复红染液；（5）无菌生理盐水；（6）无菌试管；（7）酒精灯；（8）高压蒸汽灭菌器；（9）显微镜；（10）生物安全柜。
2. 实验仪器：（1）恒温培养箱；（2）电热恒温水浴锅；（3）无菌操作台；（4）超净工作台；（5）显微镜。
四、实验方法与步骤1. 菌种复苏（1）将冷冻保存的结核分枝杆菌菌种复苏于牛肉浸液中，37℃恒温培养24小时；（2）观察菌落生长情况，记录结果。
2. 分离纯化（1）将复苏后的菌液涂布于牛肉浸液琼脂平板上，37℃恒温培养24小时；（2）挑取单菌落进行纯化，重复涂布、培养，直至获得纯化菌落。
3. 鉴定（1）挑取纯化菌落，用无菌生理盐水洗涤，制成菌悬液；（2）将菌悬液滴加于石炭酸复红染液中，37℃恒温染色30分钟；（3）用无菌生理盐水冲洗，观察菌体形态及染色特性；（4）挑取染色阳性菌落，进行生化试验，如氧化酶试验、触酶试验等，以鉴定结核分枝杆菌。
4. 检测（1）挑取纯化菌落，制成菌悬液；（2）将菌悬液滴加于含有药物的琼脂平板上，37℃恒温培养24小时；（3）观察药物对菌落的抑制作用，判断药物对结核分枝杆菌的敏感性。
五、实验结果与分析1. 菌种复苏：复苏后的菌落呈白色，表面光滑，呈干燥状，有明显的溶血现象。
2. 分离纯化：纯化后的菌落呈白色，表面光滑，呈干燥状，有明显的溶血现象。
3. 鉴定：挑取染色阳性菌落，进行生化试验，结果显示氧化酶试验、触酶试验均为阳性，符合结核分枝杆菌的生物学特性。
结核病实验室诊断技术介绍
1．结核分枝杆菌鉴定方法1. 1萋尼氏抗酸染色痰涂片显微镜检查目前萋尼氏抗酸染色痰涂片显微镜检查是我国结核病实验室使用最为普遍的方法，其操作简单快捷，特异性高，设备要求低，但是灵敏度较低，不能及时发现病人。
1.2 发光二极管荧光显微镜（LED荧光显微镜）发光二极管荧光显微镜管利用二极管光源，延长了显微镜使用寿命，不需要暗室，且价格低廉，可以提高涂片的阳性检出率。
目前在国内应用评估结果显示灵敏度较明场显微镜明显提高，已在部分区县开始使用。
1.3 交叉引物恒温扩增结核病诊断技术在恒定温度下，特殊的引物和特异性探针在酶的作用下，反应体系在一个密闭的反应管内反应。
扩增反应一般不超过一个小时，最短半小时。
目前应用玻璃化试剂，稳定性好，便于运输。
目前在国内区县级应用评估。
1.4 夹层杯结核病诊断方法将痰标本（或其它标本）用专用消化灭活液充分消化，完全暴露并保留抗酸杆菌，通过自动离心涂片机（或半自动制片染色机）对消化后的标本进行充分集菌。
直接在夹层杯装置中进行抗酸染色，取出基片或膜片置于普通显微镜进行观察。
夹层杯法操作方便快捷，便于标准化操作，通过消化灭活，安全性改善，阳性检出率也比直接涂片法大大提高。
夹层杯的装置有沉降式和虑过式，适用于不同工作量的医疗机构。
1.5 环介导等温扩增方法采用2对引物在等温条件下即可完成DNA的扩增，扩增结果通过肉眼观察荧光进行判定，诊断是否为结核病。
同时整个反应体系采用封闭系统减少了工作区域扩增子的污染，整个反应过程只需一个小时即可完成，通过肉眼观察荧光判读结果。
2．结核分枝杆菌培养方法2.1 固体培养培养是结核病诊断的精标准，也是获得分离菌株开展耐药检测的前提，我国结核病实验室最常用的是固体罗氏培养法，包括简单法和中和离心法。
虽然培养是诊断的精标准，但是花费时间长，需要4-8周时间。
2.2 液体培养液体培养通过添加生长刺激剂，改变检测方法提高检测灵敏度等方式缩短了阳性报告时间。
结核病实验室诊断技术2017.10.13
• 绝对浓度法 • 比例法
• 液体培养法
基于固体培养基；时间：4周 多种药物
基于液体培养基，时间：4-12天 INH/RFP/SM/EMB/PZA
结核分枝杆菌药物敏感试验
不同药敏方法的差异
三者在临界药物浓度接种菌量、结果判读方法等方面都有一定差 别，导致结果有很少一部分不相符
比例法和绝对浓度法检测结果的一致率4 药均高达96 %以上,对于 结核分支杆菌,二种方法测试 SM INH RFP EMB的耐药率均无显著 性差异
涂片显微镜检查的敏感性
观察到的AFB
AFB估计数量 涂片阳性的可能性(%)
数量
( /ml)
• 0 in ≥100 fields
< 1,000
<10
• 1-2 in 300 fields 5,000 – 10,000
50
• 1-9 in 100 fields about 30,000
80
• 1-9 in 10 fields
结核分枝杆菌药敏试验-菌型鉴定
利用固体罗氏鉴别培养基的鉴别：
中性罗氏 培养基
+
噻吩-2-羧酸 肼TCH
+
对硝基苯 甲酸PNB
+
菌型鉴定 NTM
+
+
-
人型Mtb
+
-
-
牛型Mtb
结核分枝杆菌药敏试验-菌型鉴定
• 原理：硝基苯甲酸还原酶机制
绝大部分非结核分枝杆菌能将对硝基-苯甲酸（PNB ）还原为细菌能够利用的对氨基-苯甲酸（PABA），而 绝大部分（98%以上）MTBC缺乏对硝基-苯甲酸（PNB ）还原酶活性，为对氨基-苯甲酸（PABA）将对硝基苯甲酸（PNB）还原为细菌能够利用的对氨基-苯甲酸 （PABA） • 局限：鉴定周期长15天-30天，特异性不高
tbs标准诊断
tbs标准诊断TBS标准诊断。
TBS（Tuberculosis）是一种由结核分枝杆菌引起的传染病，通常侵袭肺部，但也可能影响其他部位，如肾脏、脊椎和脑部。
TBS标准诊断是确诊和治疗TBS的重要步骤，它可以帮助医生准确判断患者是否感染了结核分枝杆菌，并确定最佳的治疗方案。
一、临床症状。
TBS的临床症状包括持续的咳嗽、咳痰、胸痛、咯血、乏力、食欲不振、体重减轻等。
这些症状可能并非都出现在每位患者身上，但如果患者出现了上述症状，特别是持续咳嗽超过3周，就需要考虑TBS的可能性。
二、影像学检查。
X线胸片是诊断TBS的重要工具之一，它可以显示肺部的异常情况，如结节、浸润、空洞等。
CT扫描可以更清晰地显示肺部病变的细节，对于复杂的病例尤为重要。
三、实验室检查。
痰涂片检查和痰培养是诊断TBS的关键实验室检查项目。
痰涂片检查可以快速发现结核分枝杆菌的存在，而痰培养则可以确定结核分枝杆菌的种类和对抗生素的敏感性，从而指导治疗方案的制定。
四、临床评估。
临床评估是医生根据患者的临床表现、影像学检查和实验室检查结果，综合判断患者是否患有TBS的过程。
医生需要综合分析各项检查结果，排除其他疾病的可能性，最终做出诊断。
五、治疗方案。
根据TBS的严重程度和患者的个体情况，治疗方案包括抗结核药物的联合使用，通常需要持续服药6个月或更长时间。
在治疗过程中，医生需要密切监测患者的病情和药物耐受性，及时调整治疗方案。
六、预防控制。
TBS的预防控制工作包括对结核分枝杆菌的传播途径和感染风险的认识，加强对高危人群的监测和筛查，及时发现和治疗感染者，以及加强公众对TBS的认识和预防意识。
结语。
TBS标准诊断是确诊和治疗TBS的重要步骤，它需要医生综合运用临床症状、影像学检查和实验室检查等手段，做出准确的诊断，并制定科学的治疗方案。
同时，预防控制工作也至关重要，只有加强对TBS的认识和预防意识，才能有效遏制TBS的传播。
结核分枝杆菌的分子生物学鉴定
结核分枝杆菌的分子生物学鉴定
结核分枝杆菌是引起结核病的主要病原体之一，在临床实验室中的分子生物学鉴定已被广泛应用。
结核分枝杆菌的分子生物学鉴定主要包括PCR扩增、DNA序列分析和基因芯片检测等技术。
其中，PCR 扩增是最常用的方法之一，通过特异性引物扩增结核分枝杆菌的特定DNA片段，从而实现对其的鉴定。
DNA序列分析则可对PCR扩增的产物进行测序，通过比对数据库中的序列信息来确定结核分枝杆菌的种属和亚型。
基因芯片检测是一种高通量的技术，可同时检测多种结核菌的相应基因，准确鉴定结核分枝杆菌的种属和亚型。
结核分枝杆菌的分子生物学鉴定为结核病的诊断和流行病学调查提供了有力支持，有助于加强对结核病的防控和治疗。
- 1 -。
结核分枝杆菌
实养法、分子生物 学方法、免疫学方法和噬菌体法。 痰涂片直接镜检是检测抗酸杆菌（AFB）最普遍 的实验室诊断方法，特异性较高，但灵敏性较低， 涂片中分枝杆菌要达到103-104cfu/ml才可检测出 阳性结果，且仅能检出1/2—3/4的活动性结核患 者，漏检率相当高 。
罗氏（LÖwenstein Jensen）培养法是目前检测 MTB的“金标准”，但其检测周期长（8周）， 导致无法及时确诊结核患者，并无法及时治疗； 新近发展起来并广泛使用的快培检测技术无疑大 大缩短了检测周期，但确诊仍需2-3周，依然无 法实现结核病快速诊疗； 基于免疫学的检测方法快速，操作简单，成本低 廉，但灵敏度有限； 基于核酸扩增的检测方法快速、准确，但成本高 昂、技术要求高，难以在发展中国家常规实验室 中广泛开展。
分枝杆菌属
1982年，Robert Koch首次发现结核分枝杆菌为 结核病德致病菌。在微生物分类上，分枝杆菌归 属原核生物界，厚壁菌门，放线菌目，分枝杆菌 科，分枝杆菌属。 临床将分枝杆菌分为结核分枝杆菌，非结核分枝 杆菌，麻风杆菌及腐物寄生性分枝杆菌。
致病性
肺结核是一种因感染结核分枝杆菌（MTB）， 偶尔为牛分枝杆菌，非洲分枝杆菌而引发的传染 病，在低收入地区发病率相对较高。据WHO统 计，全球约1/3的人口感染MTB，每年新增患者 900万，并有300万人死于该病。
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医院检验科
1
结核疫情及诊断进展
2
黛玉脸色苍白， 瘦骨嶙峋，经不断 咳嗽及吐血后，香消玉殒，结束了一场 哀怨凄绝的爱情故事。
3
我国结核病疫情
全球结核病第二高负担国家，结核病疫情表现有“六
多” 。
一、感染人数多——5.5亿人感染过结核菌，约占全国人口
的45％，高于全球平均水平。 二、患病人数多——活动性肺结核、传染性肺结核患病率 分别为367/10万和122/10万， 三、新发患者多——全国每年新发活动性肺结核患者145 万， 其中传染性 肺结核患者65万。 四、死亡人数多——全国每年约有13万人死于结核病。 五、农村患者多——全国约有80％的结核病人集中在农村， 主要在经济不发达的中西部地 区。 六、耐药患者多——全国结核病耐药率高达28％。 4
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三、荧光染色法：
是涂片法中阳性率较高，较快速的方法， 集菌与荧光染色相结合，则荧光显微镜下的抗 酸杆菌阳性率可达50%， 荧光法的缺点： 假阳性率较高， 保存时间短，不到4个月
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四、培养法
一般都用改良罗氏固体培养基 接种后第3第7天观察，以后每周观察一 次菌落生长情况，第8周若仍无生长，报 告为阴性。 优点：准确，灵敏度略高于涂片法；可 以鉴定死菌与活菌；可进一步进行菌种 鉴定和药敏试验. 缺点：诊断周期长，最快也需要6周。 有一定的污染率
结核病实验室 诊断方法介绍
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概 述
结核病人的细菌学检查不仅是发现传染源 的主要途径和手段，也是结核病确诊和制 订抗痨方案，考核疗效、评价治疗效果的 可靠标准。 由于结核菌的遗传特性决定其生长周期长， 致使常规细菌学检查方法存在着灵敏度低、 操作复杂，需时间较长和影响因素较多， 不易标准化等缺陷，使细菌学诊断发展缓 慢，无法充分满足临床诊断的需要。
将经过消化灭活处理液处理的痰液、或其他体液标本混 悬液置于具有符合光学要求基片的夹层杯中，经过专业离心 机离心将混悬液中细菌或细胞牢固附着基片上，并在夹层杯 中直接染色后取出基片在载波片上封片，置显微镜下观察。
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优点：
1、操作方便，易于掌握。 2、片中结核菌分布均匀，染色效果清晰 3、液基结核菌制片技术较离心浓缩集菌法有显著提 高： 该方法将所有消化后标本的抗酸杆菌均完整 地保留于液基薄片中，从而显著提高了检出率。 4、安全性有所提高： 消化，制片，烤片，染色均在 彭氏杯中完成，操作人员不直接接触标本。 采用 结核专用消化液，可有效杀灭结核分支杆菌，更好 的提高了操作的安全性。
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涂片优点：简便、快速、价廉
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涂片的缺点
敏感性低：5000～10000条菌／ml 特异性差：所有分枝杆菌均可着色 无法区别死菌与活菌：结果均为阳性
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痰菌假阴性原因
病变是封闭或开放； 病变性质和其中能够排出的菌量和排出 时间间歇； 结核分枝杆菌形态多样性；
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二、液基夹层杯结核杆菌检验工作原理
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检测方法
1．菌悬液的制备 2.接种及培养 3.结果判定与报告 敏感（一）： 含药培养基上无菌落生长。 报告菌落数：当含药培养基上菌落数在20个以下时， 报告菌落个数。 耐药（1+）： 含药培养基上菌落数约占斜面面积1/4； 耐药（2+）： 含药培养基上菌落数约占斜面面积1/2； 耐药（3+）： 含药培养基上菌落数约占斜面面积3/4； 耐药 (4+)： 含药培养基上菌落呈菌苔样生长。
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本法弊端
操作繁琐 需时久，4周 结果准确性差
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五、液体培养＋ 显微镜观察药敏试验
是2000年建立的一种痰标本液体培养结合显微镜观察技 术。其原理是MTB含有索状因子，因此其在液体培养基 中生长时分泌索状因子，形成索状特征性结构，利用倒 置显微镜观察索状结构可用于MTB的快速诊断。由于液 体培养基营养丰富，因此MTB生长迅速，使MTB的培 养时间显著缩短，培养阳性率显著增加。该法还能在培 养的同时直接进行临床标本的直接药敏试验，因此能显 著缩短从临床标本到耐药性测定的所需时间，这是其它 传统方法所不具有的，也是MODS的最大优点。
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培养假阴性的原因
个别细菌营养要求的特异性； 细菌和细菌营养代谢异质性； 细菌培养前处理对细菌活性影响；
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分枝杆菌药物敏感性试验
绝对浓度法检测分枝杆菌药敏实验是采用含药罗氏培养基进行的。常用药物终浓度（μg/ml） ____表 1 绝对浓度法含药培养基中的药物终浓度_____ 药 物 浓 度（μg/ml） 低浓度 高浓度 异烟肼 1μg/ml 10μg/ml 利福平 1μg/ml 10μg/ml 链霉素 10μg/ml 100μg/ml 乙胺丁醇 5μg/ml 50μg/ml 对氨基水杨酸 1μg/ml 10μg/ml 氨硫脲 10μg/ml 100μg/ml 乙硫异烟胺 25μg/ml 100μg/ml 卡那霉素 10μg/ml 100μg/ml 卷曲霉素 10μg/ml 100μg/ml 紫霉素 10μg/ml 100μg/ml 氧氟沙星 5μg/ml 50μg/ml 左氧氟沙星 5μg/ml 50μg/ml 环丙沙星 5μg/ml 50μg/ml 司帕沙星 5μg/ml 50μg/ml 力克肺疾 1μg/ml 10μg/ml 丁胺卡那 10μg/ml 100μg/ml
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实验室诊断方法
病原学诊断 辅助诊断
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病原学诊断
一、涂片抗酸染色镜检法， 二、液基夹层杯结核杆菌检验 三、荧光染色法 四、培养法 五、液体培养＋显微镜观察药敏试验 六、快速培养检测法， 七、色谱法 八、分子生物学法 九、噬菌体生物扩增法
8Байду номын сангаас
一、涂片抗酸染色镜检法：
国内大多采用厚涂片，比薄涂片法可提高 阳性率；涂片萎尼抗酸染色法能保存较久， 可备复查； 因费时、繁琐，综合医疗单位常因重视不 够，致涂阳检出率低于5%，专业机构涂阳 率可达到30%。 国外痰涂片阳性率可达30%～40%，反复 多次查，可增加到65%～75%；