结核病的实验室诊断方法及评价

耐多药结核病的实验室诊断条件：因耐多药结核分枝杆菌的生物危险性，

1）需P2及以上实验室，目前我院实验室条件基本具备即将投入运行，

2）日常培养及涂片用的生物安全柜滤膜已超出使用年限，工作人员生物安全得不到保障，应定期予以更换。

耐多药结核分枝杆菌主要以结核分枝杆菌体外药物敏感性测定作为其诊断依据。因此其基础是培养，只有培养出阳性结核分枝杆菌才能进一步通过结核分枝杆菌体外药物敏感性测定诊断是否为耐多药结核分枝杆菌。

1.已进人临床常规应用的测定方法:目前包括绝对浓度法、比例法及应用BACTEC460、BACTEC 960、BacT/ ALERT 3D、ESPII等仪器系统快速检测结核分枝杆菌的药物敏感性。其中:绝对浓度法以最低抑菌浓度或以无生长为终点作为判断标准，是我国目前普遍采用的方法;比例法以是否能够抑制99%的细菌生长作为判断标准，是世界卫生组织推荐使用的方法;后四种仪器方法则是比例法的特化，其特点是以细菌的代谢过程指示细菌生长状况。

2.处于研究探索阶段的测定方法:此类方法很多，抗性比例法、Etests法、噬菌体生物扩增法、液体变色培养基测定法、荧光素酶测定法、硝酸盐还原试验等。

3分子生物学方法对结核分枝杆菌耐药性检测已有一些进入临床检测。基因突变是引起抗结核药物耐药性的最主要的原因。多种以PCR为基础的分子生物学技术用于检测与耐药相关基因的突变，作为快速耐药性检测方法在实验室或临床得到开展。这些方法具体包括：主要是DNA序列分析法，聚合链反应-单链构象多态性分析（PCR-SSCP），另外还包括基因芯片技术、异质性双链构象分析、变性梯度凝胶电泳、线性探针杂交技术、RNA/RNA错配检测技术和分子灯塔技术等。由于结核分枝杆菌的耐药性与基因突变的确切关系未完全阐明，检测耐药相关基因的分子生物学方法虽然能快速准确地检测到耐药相关基因的突变，但由于判断药物敏感性时存在固有的缺陷，检测结核分枝杆菌耐药性的基因型鉴定法不能完全替代表型鉴定法。

结核病的实验室诊断方法及评价

(一)标本的采集

1．痰标本采集新发病人应在抗结核药物治疗前留取痰标本。治疗中的病人应停药2～3天后留取痰标本。病人于清晨漱口后，留取3～5ml合格的痰标本(深咳后吐出的黏液痰、脓样痰、干酪样痰、褐色血样痰或含少量新鲜血液的血痰)，遇到唾液或口永，应重新留取。至少采集3次。WHO推荐的采集容器为国际通用的螺旋盖痰瓶、可密封塑料盒或蜡纸盒。痰容器上应标明病人姓名、编号、检查项目和容器序号。

2.胃冲洗液幼儿不会吐痰，常将痰液咽下，故可用清晨空腹胃洗出液，直接涂片染色或进行结核杆菌培养，连续作三次可提高培养阳性率。胃液结核杆菌检出率以浸润性肺结核和干酪性肺炎为最高，其次为粟粒型肺结核。胃液、痰液或其他分泌物中结核杆菌检查，有时对诊断有决定性意义。

3.支气管肺泡灌洗和支气管冲洗支气管肺泡灌洗和支气管冲洗液至少5ml并以无菌容器盛装，以用于检验。

4.病灶组织或干酷块等先用组织研磨器磨碎后再行涂片。

5．尿液留全量夜尿，静置4或5小时后，弃上清液，取沉淀部分尿液10ml，3000rpm．离心30min，取沉渣涂片。

6.体液或脑脊液无菌操作收集体液或脑脊液，放置冰箱或室温24h，待薄膜形成后涂片。也可将脑脊液离心沉淀，3000rpm，离心30min，弃上清液，取沉淀物涂片。

(二)试验方法及评价

1．细菌学诊断方法

(1)涂片检查法：包括直接涂片法、荧光染色涂片法和集菌涂片珐。痰液、脓液可直接涂片。用萋尔-尼尔逊染色法(Ziehi-Neelsen)简称萋尼染色法，若镜检找到抗酸性杆菌，则可能是结核杆菌。此法简便、快速，技术要求低，无需特殊仪器且能当天出结果，十分经济，符合我国国情。但其敏感性差，一般需5000～10000条菌／ml才能得到阳性结果；特异性差，各种分枝杆菌均可着色，要进一步鉴定是否为结核分枝杆菌；不能区分死菌与活菌。

【萋尼氏染色法】

①涂片：取经95％乙醇擦拭脱脂过的干燥、清洁、无油污、无划痕的新玻璃片(玻片不能重复使用)，于玻片背面的左端1／3处以蓝色或黑色记号笔(玻璃铅笔)编号。用接种环挑取痰标本的脓样，干酪样部分约0.05～0.1ml，于玻片正面的右侧2／3处，均匀涂沫成10mm×20mm的卵圆形痰膜，自然干燥后待检。

②试剂：

⊙碱性复红乙醇染色储存液：

碱性复红液：8克碱性复红溶于95％乙醇100ml中。

5％石碳酸水溶液：5克石碳酸溶于100ml蒸馏水中。

③染色步骤；

【荧光染色法】

①试剂：

染色剂z金胺“O”0．1g溶于95％乙醇10ml，加5％石炭酸90ml。

脱色剂：3％盐酸乙醇液。

复染剂：0.5％高锰酸钾水溶液。

②染色步骤：

③镜检与报告方式：在暗色背景下，抗酸杆菌呈黄绿色或橙色荧光。必须用40×物镜确认菌体形态，应具有萋-纳氏抗酸染色镜经检验后，方可应用荧光染色法，注意勿过读或漏判。荧光染色后涂片应在24h内检查，遇需隔夜时，置4℃保存，次日完成镜检。

物镜20×检查结果按下列标准报告：

阴性(-)：0条／50视野

可疑(+)；1～3条／50视野

阳性(1+)：l1～99条／50视野

(2+)：1～9条／每视野

(3+)：10～99条／每视野

(4+)：≥100条／每视野

物镜40×检查细菌细胞形态。

(2)常规培养法：结核分枝杆菌培养阳性是确诊结核病的“金标准”。改良罗氏培养法是目前较为成熟的分离培养方法，根据结核杆菌生长缓慢，菌落干燥、颗粒状、乳酪色像菜花状，菌体染色抗酸性强等特点判断是否为结核杆菌。如菌落、菌体染色都不典型,则可能为非典型分枝杆菌，应进一步作鉴别试验。此法培养时间长，不适于快速检测结核杆菌，且阳性率也只有30％～40％，使大量结核病人漏诊或误诊。同时各种分枝杆菌均可生长，也需进一步鉴定是否为结核分枝杆菌。

⊙培养结果报告方式：

抗酸杆菌培养阴性：斜面无菌落生长。