氨 基 酸 自 动 分 析 仪 简 介

氨基酸自动分析仪氨基酸是蛋白质的组成成分，是蛋白质化学研究的主要内容之一。

蛋白质是一切生命物质的基础，因此，探讨和揭示生命现象的发生、生长、新陈代谢、遗传变异过程，都与氨基酸的研究有关。

随着近代物理学、化学和电子学的飞速发展，氨基酸的分析技术亦在不断更新。

氨基酸分析仪是本世纪50年代研制的，仅40多年，已发展到现在的进样、分离、检测和数据处理全部自动化的程度。

检出量由微克分子到毫微克分子，分析时间由原来的24小时到现在的半个小时，分析技术的提高促进了其他科学领域的发展。

一、氨基酸自动分析仪的进展用于氨基酸分析的方法很多，有纸色谱法、柱色谱法、薄层色谱法、电泳法及气相色谱法等。

一般认为离子交换柱色谱法是较为精确的检测方法，氨基酸分析仪就是在此基础上研制成功的。

1951年Moor和Stein采用离子交换树脂色谱，用茚三酮试剂显色和分光光度计检测而设计，后来在Spaekman的协助下，使分析操作自动化。

迄今氨基酸分析仪的条件和自动程度有了很大的改观，其特点主要表现以下几个方面。

⒈树脂粒径减小近年来制成的小颗粒球状树脂，使氨基酸分析仪得到很大改进。

由于树脂粒径减小就对应地增加等量树脂的总面积，使现在少量树脂达到过去大量树脂的分离效果，从而减小了树脂柱的内径和体积，节省了试剂用量，缩短了分析时间。

树脂的粒径从200→20→10→5µm。

⒉色谱柱内径缩小树脂粒径减小使填充树脂床的色谱柱内径减小，由过去的粗长柱变为微柱。

色谱柱内径的变化为18→6→2.8→1.75mm。

⒊输压泵压力增高一般氨基酸分析仪采用低压泵，其施加于输液的压力只有几9.80665×104Pa，以后增加至几十9.80665×104Pa，现在发展到2068×104Pa。

⒋分析时间缩短由于树脂粒径的改善，色谱柱内径缩小和泵压增高，使分析时间大大缩短。

蛋白质水解液的分析时间从过去的24小时缩短到现在的半个小时左右。

⒌仪器灵敏度提高由于仪器的不断改进，使灵敏度大为提高，过去仪器的最高灵敏度已远不及现在仪器的最低灵敏度。

现在一般氨基酸分析仪的灵敏度均达到0.1nmol。

⒍试剂用量减少由于分析时间大大缩短，致使试剂消耗量大为降低。

氨基酸分析的试剂要求纯度很高，且价格昂贵，试剂用量减少会降低分析费用，试剂流量(每小时茚三酮试剂的用量)的变化为70→35→18→3.5ml。

⒎样品用量少由于仪器灵敏度不断提高，同时不少仪器采用单柱分析法，所以样品用量逐渐减少，从过去一次分析需要样品几ml到现在只用20µl。

这对科研中难以收集和制备的样品以及许多生物样品的微量分析提供了十分有利的条件。

⒏自动化程度提高由于采用多样品自动注入器、程序控制和数据处理系统，使仪器从进样到每个氨基酸结果打印的全过程都自动化。

并且当仪器出现故障时又能自动停机，因此可以自动地进行工作。

⒐显色试剂和检测器的改善显色试剂中除了茚三酮仍被广泛应用外，荧光试剂受到人们的重视。

以前认为很有发展前途的荧光胺已被邻苯二甲醛所取代。

目前用邻苯二甲醛的荧光计检测器检测的灵敏度比用茚三酮显色后经分光光度计检测的灵敏度高100倍以上。

二、氨基酸分析原理⒈氨基酸的理化特性氨基酸是无色的结晶物质，氨基酸分子()至少有一个氨基和一个羧基，在水溶液中呈中性、弱酸性或弱碱性，是两性电解质，它所带的电荷随介质pH而变化。

当氨基酸处于H+介质中，羧基的解离作用被抑制，整个分子获得一个质子带正电荷；反之，当它处于OH-介质中，则从氨基夺走一个质子，从而整个分子带负电荷。

当处于某一pH下，两性离子所带正负电荷数相等时，此时的pH值就是该氨基酸的等电点，整个分子呈电中性。

一般氨基酸都能溶于水和其他极性溶剂，而难溶于乙醚、三氯甲烷、苯等非极性溶剂。

由于氨基酸结构不同，等电点亦有差异。

氨基酸等电点是取决于其羧基和氨基的解离常数的相对值。

由于羧基的解离常数大于氨基酸的解离常数，故一般氨基酸的等电点为弱酸性。

由于氨基酸分子中都具有氨基和羧基，因此，它们都能产生氨基和羧基的一般化学反应，如酯化、甲基化、乙酰化以及酸碱中和反应等。

这里仅就氨基酸分析仪采用的与茚三酮试剂显色反应加以描述。

氨基酸与水合茚三酮共同加热被氧化分解为CO2、NH3和比氨基酸少一个碳原子的醛，此时茚三酮被还原。

在弱酸性溶液中(pH=5)，还原茚三酮与NH3及另一个分子茚三酮缩合成蓝紫色化合物茚二酮炔―茚二酮胺(DYDA)。

反应式为：由于DYDA在570nm处有最大吸收峰，所以广泛地用于氨基酸比色测定。

唯脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应生成黄色物质，在440nm处有较强的吸收峰。

⒉离子交换树脂离子交换色谱是以液体作为流动相，用离子交换树脂装在柱内作为固定相，与适当的检测器连接起来的专用液相色谱法。

其基本原理与离子交换色谱相同。

各种氨基酸的酸碱性、极性和分子结构不同，常用阳离子交换树脂在色谱柱上分离，可用不同的pH值和离子浓度的缓冲液依次将它们洗脱，酸性氨基酸先被洗脱下来，其次是中性和碱性氨基酸，同类型的氨基酸，分子量较小的先洗脱出来。

由于氨基酸不吸收可见光，故洗脱液需与茚三酮反应显色后才能检测，最后根据检测信号的大小计算各种氨基酸的含量。

离子交换树脂有以下类型：⑴阳(酸性)离子交换树脂凡是含有酸根的树脂为阳离子交换树脂，这类树脂又可分为强酸型、中强酸型和弱酸型三类。

强酸型含有磺酸基团(―SO3H)；中强酸型含有磷酸根(―PO3H2)、亚磷酸根(―PO2H2)；弱酸型含有羧基(―COOH)或酚羟基(―OH)。

以上这些交换树脂在交换时反应机理如下：⑵阴离子交换树脂阴离子交换树脂都含有氨基，它可分为强碱型、中碱型和弱碱型三类，如含季胺盐[―N+(CH3)3]为强碱型；叔胺[―N(CH3)2]、仲胺[―NHCH3]、伯胺类为弱碱型。

既含强碱基团也含弱碱基团的交换树脂是中强碱型树脂。

交换反应如下：强碱型R―N+(CH3)3OH-+Cl-→R―N+(CH3)3Cl-+OH-弱碱型R―N(CH3)2+H2O→R―N+(CH3)2H+OH-R―N+(CH3)2H•OH--+Cl-→R―N+(CH3)2HCl+OH-以上所列离子交换树脂含有一个分子的不溶基底物质及一个活性根，但这些活性根的存在会增加物质的溶解度，一般的方法是在树脂中加入“交联结构”，使它成为一个高分子量的大聚合物，上下左右索扯固定，不能溶解。

氨基酸分析仪所用的强酸型阳离子交换树脂是由苯乙烯及二乙烯苯合成的，其中苯乙烯是主要成分，磺酸根联结在其上，形成磺化苯乙烯。

二乙烯苯是用来做交联结构的，它把直链结构的磺化苯乙烯错综地连贯起来，防止因吸水溶解而溃散。

磺化苯乙烯与二乙烯苯的聚合如图1.4.1所示。

使用离子交换树脂应注意交联度，即二乙烯苯占树脂单体的百分率。

交联度大，树脂的结构紧密，空隙度、渗透性以及溶胀性较小，适应于分子量较小的氨基酸分离；反之交联度小的树脂，结构疏松，空隙度、渗透性及溶胀性大，在离子交换中结构不稳，高压的洗脱液会把这种树脂破坏，氨基酸分析所用的树脂交联度为8%～12%。

目前，国外各厂商都有自己的树脂，配制方法均属专利产品，所以树脂的售价昂贵。

⒊氨基酸自动分析仪原理氨基酸分析仪是在离子交换色谱的原理指导下制成的，是一种专门用来分析氨基酸的液相色谱仪。

它的结构一般是由色谱系统、自动加样系统、检测系统、控制系统、数据处理系统组成。

如图1.4.2所示，流程图的主要部件有，进行氨基酸分离的离子交换树脂色谱柱；分离的各个氨基酸与茚三酮试剂反应的水浴(100℃±1℃)；用于检测氨基酸显色的比色计及记录仪和数据处理系统；输送缓冲液和茚三酮试剂的恒流泵；缓冲液自动转换阀；自动进样器；保持色谱柱分离温度的恒温水浴。

用于氨基酸分析的样品都需用pH2.2的缓冲液溶解或配制，由于pH2.2都较各种氨基酸的等电点小，即各氨基酸都处于[H+]浓度很大的酸性溶液中，这样的溶液有利于氨基酸的氨基(―NH2)电离，而不利于羧基(―COOH)的电离。

因此，在pH2.2的缓冲液中各氨基酸呈R―CH―COOH状态，带正电荷。

柱里的磺酸型阳离子交换树脂R―SO3-H+被柠檬酸钠(生理体液为柠檬酸锂)缓冲液平衡时形成R―SO3-Na+。

当带正电荷的氨基酸进入色谱柱前端，此时氨基酸浓度处于最大值，氨基酸与Na+进行如下交换：由于缓冲液的流动以及氨基酸的吸着，氨基酸在流动相中的浓度下降，这时氨基酸就会解吸，这种解吸作用使交换树脂恢复到原来的形式。

这样当氨基酸通过离子色谱柱时，连续地吸着与解吸，加之各种氨基酸彼此性质不同，吸着的程度就有差异，在缓冲液的作用下便形成了分离。

当逐渐提高洗脱缓冲液的pH值时，氨基酸的正电荷逐渐减少，与树脂的结合力逐渐减弱，最后从离子色谱柱被洗脱下来。

氨基酸的结构不同，与树脂的结合力也有差异。

酸性氨基酸所带的氨基少，正电荷也少，与树脂结合不紧，它容易被洗脱下来。

如天门冬氨酸，是第一个洗脱下来的氨基酸，其等电点为：天门冬氨酸等电点(pI)=½(2.1+3.9)=3.0相反，赖氨酸所带的氨基(―NH2)多，在pH2.2缓冲液中，正电荷多，它与树脂结合紧密，被Na+置换困难，故洗脱下来的速度就慢。

赖氨酸的等电点(pI)=½(9.0+10.5)=9.75氨基酸侧链除具有氨基和羧基外，有的氨基酸还带有其他基团，这些基团在一定条件下也能离解，如酚羟基(酪氨酸)、咪唑基(组氨酸)及胍基(精氨酸)等，在一定条件下，这些基团的解离状态及它们对树脂的亲和力和被洗脱的速度是有区别的，这些区别是各氨基酸在色谱柱被分离的基础。

不同氨基酸与离子交换树脂亲和力的强弱如下：碱性氨基酸>芳香族氨基酸>中性氨基酸>酸性及羟基氨基酸。

因此，氨基酸的分离便有先后顺序，一般酸性及带羟基的氨基酸最先洗脱下来，然后是中性氨基酸，最后是碱性氨基酸。

图1.4.3是Beckman 121MB型氨基酸分析仪蛋白质水解液中各氨基酸的出峰顺序。

氨基酸的分离是用不同pH值的缓冲液进行的，一般标准分析(蛋白质水解液分析)采用柠檬酸缓冲液，如果分析生理体液(如尿、血浆、乳汁、脑脊液及动植物组织提取液等)则该为柠檬酸锂缓冲液，因为天门冬酰胺与谷氨酰胺在钠盐缓冲液中不易分离，两者重叠成一个峰，不能得出各自的结果。

标准氨基酸分析(蛋白质水解液分析)，Beckman 121MB型一般使用三种缓冲液。

即pH3.28洗出天门冬、苏、丝、谷、脯、甘、丙、胱、缬等氨基酸；pH3.90洗出蛋、异亮、亮、酪、苯丙等氨基酸；pH4.95洗出赖、组、精等氨基酸。

除以上缓冲液外，还有再生液，浓度为0.2mol/L NaOH。

每做完一个样品，仪器自动吸入再生液，将柱子冲洗干净后，再做第二个样品。