脲酶试验标准操作规程
脲酶的测定——精选推荐
一.液态法1.原理：大豆制品中的脲酶可使尿素分解成氨，会使酚红指示剂改变颜色。
2.试剂2.1尿素:GB696，分析纯。
2.2酚红指示剂2.2.1称取0.1g酚红，加1.43mL0.1mol/L氢氧化钠溶液，在研钵中研磨以促溶解；2.2.2转移至250mL定量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀备用。
3.操作方法3.1取0.2g粉末样品，置于25mL比色管中。
3.2加0.02g尿素，加酚红指示剂2滴，再加水20mL，充分摇匀15s。
3.3记录粉红色出现时间，并根据时间判断尿酶活性，颜色出现时间应少于15min。
颜色出现时间脲酶活性1min 极强1～5min 强5～15min 稍有15min 无同时作空白对照试验。
样品空白(不加尿素)及试剂空白(不加样品)，只有上述空白正常时，即酚红指示剂不改变颜色，试验结果才是可靠的。
一般企业认为7、8分钟变色较为合适。
二、半固态法1.原理：大豆制品中的脲酶可使尿素分解成氨，会使酚红指示剂改变颜色。
2.试剂2.1稀硫酸（H2SO4）0.2N。
2.2尿素一酚红试剂2.2.1将1.2克酚红溶解于30ml0.2N的NaOH中；2.2.2用蒸馏水将之稀释至约300mL；2.2.3加入90g尿素（分析纯）并溶解之；2.2.4用蒸馏水稀释至2L；2.2.5加入14mL 1.0N的H2SO4或70mL o.2N的H2SO4；2.2.6用蒸馏水稀释至最后体积3L；2.2.7溶液应具明亮的琥珀色。
3.操作方法3.1在一个150ml的烧杯中倒入少量试剂，注意溶液必须呈明亮的琥珀色。
若溶液已转变为深桔红色，滴人稀硫酸溶液并搅拌之，直至溶液再度呈琥珀色。
3.2量一匙粉末样品，放置于培养皿中。
3.在样品上加入两匙试剂，轻轻搅拌，将样品平铺于培养皿中。
若仍有干样品斑点，则再加入试剂，直至将样品浸湿。
4.放置5分钟后观察：a. 没有任何红点出现：再任其放置25分钟，若仍无红点出现，说明大豆粉过熟。
b. 有少量红点：少量尿素酶活性，可用。
脲酶活性的测定
大豆制品中脲酶活性的测定定性法：酚红法一、原理：酚红指示剂在pH 6.4-8.2时由黄变红，大豆制品中所含的尿素酶在pH=7.0，T=30℃时可将尿素水解产生氨，释放的氨可使酚红指示剂变红，根据变红的时间长短来判断脲酶活性的大小。
二、仪器和试剂：粉碎机：粉碎时不产生强烈发热；分析天平；25ml纳式比色管；恒温水浴锅；0.1%酚红指示剂：0.1g苯酚红溶于100ml 95%乙醇溶液；结晶尿素；三、方法：将试样粉碎，准确称取0.05±0.001g试样于25ml纳式比色管，加入0.2g结晶尿素及5滴酚红指示剂，加入25ml蒸馏水，摇动10s，立即置于30±0.5℃水浴锅中，开始计时，观察溶液颜色变化， 5min 后，取出比色管，摇匀，观察溶液颜色。
空白试验：不加尿素，其他同上。
品质判定：如果溶液为明显的粉红色，则认为该大豆制品脲酶活性超标，为不合格产品。
•0-1min变红，活性非常强（＞1.0）；•1-2min变红，活性大概0.5-1.0；•2-5min变红，活性大概0.3-0.5。
四、注意事项：1.粉碎样品时，不应产生大量热，否则会影响结果判定；2.称量样品时，一定要将样品混合均匀，否则会造成试验误差；3.试样和空白试验同时操作，过程要迅速，防止时间影响。
尿素-酚红法一、原理：酚红指示剂在pH 6.4-8.2时由黄变红，大豆制品中所含的尿素酶可将尿素水解产生氨，释放的氨可使酚红指示剂变红，根据变红样品占所有样品的比例来判断脲酶活性的大小。
二、仪器和试剂：表面皿；0.2N氢氧化钠溶液：称取0.8g氢氧化钠溶于100ml蒸馏水；1.0N硫酸溶液：移取7.0ml浓硫酸溶于500ml蒸馏水；尿素-酚红试剂：用500ml烧杯将0.8g酚红溶于20ml 0.2N氢氧化钠溶液，用蒸馏水稀释至约300ml，加入60g尿素，并溶解之，转移至2L容量瓶，冲洗烧杯数次,加蒸馏水至约1.5L，加入9.4ml 1.0N 硫酸溶液，用蒸馏水定容至2L；此时溶液应具有明亮的琥珀色；（过段时间溶液会变为深橘红色，可滴入稀硫酸溶液搅拌之，直至溶液再次变为琥珀色）三、方法：将一满匙样品放入表面皿中，摊平，将以调好的尿素-酚红试剂滴入表面皿中的样品上，直至完全浸湿，停留5min，观察样品的颜色反应。
脲酶活力测定（纳氏试剂比色法）
实验四 脲酶活力测定（纳氏试剂比色法）一、实验原理脲酶催化尿素水解成氨和二氧化碳，最适反应pH 7.0 。
反应式： (NH 2)2CO+ H 2O 脲酶2NH 3 + CO 2氨与纳氏试剂反应生成黄色配合物，其吸光度与氨浓度成正比，故可用以测定服酶的活力大小。
反应式：NH 3·H 2O ＋2K 2HgI 4 + 3KOH HgO ·HgNH 2I ＋7KI + 3H 20 （纳氏试剂） （碘化氨氧合汞） 二、实验步骤将待测酶液用磷酸盐缓冲液适当稀释后，按下述顺序操作：取3 支干净干燥试管，编号：1、空白；2、标准；3、样品。
按下表步骤加入实（7）从样品管加尿素开始计时，准确反应5min ，立即向样品管（3号管）加1 mol ·L -1H 2SO 4 1.00mL ，终止反应。
（8）另取3支干净试管，分别对应于上面各反应液进行显色。
三、结果计算脲酶活力（U · mL -1) = ( A 3 - A 1 ）* 标准管中的NH 3微摩尔数 ( A 2 - A 1 ) * min * 酶样品毫升数 式中：n 为酶样品的稀释倍数 四、仪器和试剂1 、分光光度计、恒温水浴器、试管等。
2 、“有机溶剂沉淀法制备大豆脲酶”实验中制备的脲酶提取液和粗酶液，用磷酸盐缓冲液适当稀释。
3 、3 ％尿素底物溶液：3g 高纯尿素用磷酸盐缓冲液溶解，并定容至100mL 。
4 、磷酸盐缓冲液（pH7.0）：6.70 g Na2HPO4 ·2 H2O , 3.25 g KH2PO4 ，溶于蒸馏水并定容至100 mL 。
5 、1 mol·L -1 H2SO4溶液：56mL 浓硫酸，缓慢加入盛有约600 mL 蒸馏水的容量瓶中，冷却后加水定容至1000mL。
6 、硫酸铵标准溶液：称取在60°C干燥至恒重的分析纯硫酸铵1.322g，蒸馏水溶解，并定容至100mL 。
脲酶的测定方法
一、脲酶测定(比色法)脲酶是对尿素转化起关键作用的酶，它的酶促反应产物是可供植物利用的氮源，它的活性可以用来表示土壤供氮能力。
1、试剂配制：（1）pH6.7柠檬酸盐溶液：取368g柠檬酸溶于600mL蒸馏水中，另取295g 氢氧化钾溶于水，再将两种溶液合并，用1N氢氧化钠将pH调至6.7，并用水稀释至2L。
（2）苯酚钠溶液：称取62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2mL甲醇和18.5mL 丙酮，后用乙醇稀释至100mL（A液），保存再冰箱中。
称取27g氢氧化钠溶于100mL水中（B液），保存于冰箱中。
使用前，取A、B两液各20mL混和，并用蒸馏水稀释至100mL备用。
（3）次氯酸钠溶液：用水稀释制剂至活性氯的浓度为0.9％，（1.9g次氯酸钠溶于1L水中）溶液稳定。
（4）10％尿素溶液：10g尿素溶于100mL水中。
（5）N的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水稀释至1L，则得1mL 含0.1mgN的标液，再将此液稀释10倍制成氮工作液（0.01mg/mL）。
2、操作步骤称取5ｇ土置于50mL容量瓶中,加1mL甲苯处理,加塞塞紧轻摇15ｍｉｎ;往瓶中加入5mL10%尿素液和10mL的柠檬酸盐缓冲液(ｐＨ6.7),仔细混匀。
在37℃恒温箱中培养24ｈ。
然后用热至38℃的蒸馏水稀释至刻度(甲苯应浮在刻度以上),摇荡,将悬液过滤。
取滤液1mL置于50mL容量瓶中,用蒸馏水稀释至10mL,然后加入4mL苯酚钠溶液,并立即加入3mL次氯酸钠溶液，加入每一试剂后,立即将混合物摇匀,20ｍｉｎ后,将混合物稀释至刻度,在波长578ｎｍ处测定吸光值。
脲酶活性以样品所得的吸光值减去对照样品吸光值之差,根据标准曲线求出氨态氮量。
标准曲线绘制：分别取0、1、3、5、7、9、11、13mL氮工作液置于50mL容量瓶中，加蒸馏水至20mL，再加4mL苯酚钠溶液和3mL次氯酸钠溶液，随加随摇匀，20min后显色，定容。
1h内再分光光度计上于578nm处比色。
脲酶Km值的测定(2009)
脲酶Km值的测定一、[背景与目的]K m值一般可看作是酶促反应中间产物的解离常数。
测定K m在研究酶的作用机制、观察酶与底物间的亲和力大小、鉴定酶的种类及纯度、区分竞争性抑制与非竞争性抑制作用等中均具有重要意义。
当环境温度、pH值和酶的浓度等条件相对恒定时，酶促反应的初速度v随底物浓度[S]增大而增大，直至酶全部被底物所饱和达到最大速度V。
反应初速度与底物浓度之间的关系经推导可用下式来表示，即米氏方程式：对于K m值的测定，我们通常采用Lineweaver-Burk作图法，即双倒数作图法。
具体做法为：取米氏方程式倒数形式。
若以1/v对1/[S]作图，即可得下图中的曲线，通过计算横轴截距的负倒数，就可以很方便地求得K m值。
本实验从大豆中提取脲酶，脲酶催化尿素分解产生碳酸铵，碳酸铵在碱性溶液中与纳氏试剂作用，产生橙黄色的碘化双汞铵。
在一定范围内，呈色深浅与碳酸铵的产量成正比。
通过分光光度计所得到的光吸收值可代表酶促反应的初速度（单位时间所产生的碳酸铵含量与光吸收值成正比）。
具体反应如下:(1)酶促反应(2）呈色反应通过本实验学习大豆脲酶的提取方法；掌握脲酶米氏常数Km的测定方法。
二、[仪器与试剂]1. 仪器(1) 721型分光光度计 (2) 恒温水浴锅2.试剂(1) 0.05mol/L尿素溶液(2) 0.1mol/LpH=7.0Tris-HCl缓冲液(3) 10%ZnSO4溶液(4) 0.5mol/LNaOH溶液(5) 10%酒石酸钾钠溶液(6) 奈氏试剂三 [实验方法]1. 脲酶提取液的制备（由老师准备）2. 取5支试管编号,按下表加入试剂和操作,加入试剂量单位为mL25℃恒温水浴，预温5min25℃恒温水浴，准确作用10min充分混匀，过滤另取5支试管，与上述离心管对应编号，如下操作混合均匀，以对照管调零，在480nm处，读取各管的A480nm值以酶促反应初速度的倒数为纵坐标（以1/ A480nm代替），以保温混合液中脲酶提取液浓度，以mol数计的倒数为横坐标，按双倒数作图法，求得K m值*[S]=每管中尿素的mol数/4.1mL×10-3（4.1mL为酶促反应总体积）五、[注意事项]（1）米氏方程系线性方程，酶促反应初速度v与光吸收值A成正比，所以用1/A代表1/v 作图求K m值，方法简便，且结果不受影响。
脲酶Km值测定
实验十脲酶Km值测定一、目的脲酶是氮素循环的一种关键性酶，它催化尿素与水作用生成碳酸铵，在促进土壤和植物体内尿素的利用上起有重要作用。
对其进行多方面研究，早已引起人们重视。
通过本实验，学习脲酶Km值的测定方法。
二、原理脲酶催化下列反应：在碱性条件下，碳酸铵与奈氏试剂作用产生橙黄色的碘化双汞铵。
在一定范围内，呈色深浅与碳酸铵量成正比。
故可用比色法测定单位时间内酶促反应所产生的碳酸铵量，从而求得酶促反应速度。
在保持恒定的最适条件下，用相同浓度的脲酶催化不同浓度的尿素发生水合反应。
在一定限度内，酶促反应速度与脲浓度成正比。
用双倒数作图法可求得脲酶的Km值。
三、仪器、试剂和材料1．仪器（1）试管16 ×160mm 21支（2）吸管0.5ml×15，lml×1，Zml×1，10ml×1（3）漏斗5个（4）721型分光光度计（5）电热恒温水浴（6）离心机（7）康氏振荡机2．试剂（1）1／10 mol／L脲15.015g，水溶后定容至250ml。
（2）不同浓度脲液用1／10 mol／L 脲稀释成1／20、1／30、1／40、l／50 mol／L的脲液。
（3）1 ／15 mo／L pH7．0磷酸盐缓冲液Na2HPO4 5.969g，水溶后定容至250ml。
NaH2PO4 2.268g，水溶后定容至250ml。
取Na2HPO4溶液60ml，NaH2PO4溶液40ml混匀，即为1／15 mol／L pH7.0磷酸盐缓冲液。
（4）10％硫酸锌20g ZnSO4溶于200ml蒸馏水中。
（5）0.5 mol／L氢氧化钠5g NaOH，水溶后定容至250ml。
（6）10％酒石酸钾钠20g酒石酸钾钠溶于200ml蒸馏水中。
（7）0.005 mol／L硫酸铵标准液准确称取0.6610g硫酸铵，水溶后定客至1000ml。
（8）30％乙醇60ml 95％乙醇，加水130ml，摇匀。
脲酶Km值的简易测定(精)
实验九脲酶Km值的简易测定目的和要求掌握测定米氏常数的原理和方法，学习并掌握一般的数据处理方法原理O CNH2NH2+脲酶(NH4)2CO3(NH4)2CO3+ NaOH + ( KI )2HgI OHgHgNH2I (橙黄色)步骤1脲酶的提取：称取大豆粉1克，加入30%的乙醇25mL，充分摇匀后，置于冰箱中过夜，次日用2000rpm离心3分钟，取上清液备用。
2标准曲线的制作：按下表加入各种试单位：mL管号硫酸氨蒸馏水氢氧化钠酒石酸钾钠奈氏试剂1 2 3 4 5 60.10.150.200.250.305.85.75.655.65.555.50.20.20.20.20.20.20.50.50.50.50.50.51.01.01.01.01.01.0立即摇匀各管，于460nm下比色，1号管为参比。
3酶促反应速度的测定：按下表操作单位：mL管号尿素浓度尿素加入量磷酸缓冲液保温时间脲酶加入量煮沸脲酶保温时间硫酸锌蒸馏水氢氧化钠1 2 3 4 5 0.0500.0330.0250.0200.0200.200.200.200.200.200.600.600.600.600.6037度水浴保温5分钟0.200.200.200.20/////0.2037度水浴保温10分钟0.500.500.500.500.503.0 0.53.0 0.53.0 0.53.0 0.53.0 0.5摇匀，静置5分钟后，于3000rpm离心5分钟，取上清液，供下步使用。
4从标准曲线方程中脲酶作用于不同浓度尿素生成碳酸铵的量，然后以取单位时间碳酸铵生成量的倒数即1/V为纵坐标，以对应的尿素浓度的倒数即1/[S]为横坐标，应用最小二乘法公式，求出方程，计算Km值。
思考题Km值的物理意义是什么？为什么要用酶反应的初速度计算Km值？本实验的关键是什么？。
脲酶km值的测定实验报告
脲酶km值的测定实验报告脲酶KM值的测定实验报告引言：脲酶是一种重要的酶类，广泛存在于生物体内，参与尿素代谢等关键生物化学反应。
了解和测定脲酶的KM值对于研究其催化活性和酶动力学特性具有重要意义。
本实验旨在通过测定脲酶对底物浓度的依赖关系，确定其KM值，并探讨其对底物亲和力的影响。
材料与方法：1. 实验仪器：分光光度计、试管、移液器等。
2. 实验试剂：脲酶提取液、尿素底物溶液、缓冲液等。
3. 实验步骤：a. 制备一系列尿素底物溶液，浓度分别为0.1 M、0.05 M、0.025 M、0.0125 M、0.00625 M。
b. 取一定体积的脲酶提取液，加入不同浓度的尿素底物溶液，使得最终反应体系中脲酶浓度一定。
c. 在一定温度下，将反应体系放置一段时间，使反应达到平衡。
d. 用分光光度计测定反应体系中底物的浓度变化，记录吸光度值。
e. 根据吸光度值和标准曲线，计算不同浓度底物的浓度。
f. 绘制脲酶底物浓度与吸光度值的曲线，并根据曲线拟合计算KM值。
结果与讨论：根据实验数据，我们绘制了脲酶底物浓度与吸光度值的曲线，并进行了拟合计算。
通过分析曲线，我们得到了脲酶的KM值为0.025 M。
这意味着在该浓度下，脲酶对底物的亲和力最强，催化效率最高。
脲酶的KM值是衡量酶与底物结合亲和力的重要参数。
KM值越小，表示酶对底物的亲和力越强，催化效率越高。
反之，KM值越大，表示酶对底物的亲和力越弱，催化效率越低。
在本实验中，我们选择了尿素作为脲酶的底物，并通过测定不同浓度底物的反应体系中底物浓度的变化，得到了一系列吸光度值。
通过计算和拟合，我们得到了脲酶的KM值。
脲酶的KM值的测定对于研究酶的催化机制和酶动力学特性具有重要意义。
通过测定不同条件下的KM值，我们可以了解到脲酶对底物的亲和力如何受到温度、pH值等环境因素的影响。
同时，通过比较不同酶的KM值，可以揭示不同酶的催化机制和底物特异性。
然而，本实验还存在一些限制。
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脲酶试验标准操作规程
1．目的
规范脲酶试验标准操作规程。
2．原理
某些细菌具有脲酶，能分解尿素生成氨，使培养基变碱，酚红指示剂随之变红色。
3．试剂
3.1 尿素氮培养基成分
蛋白胨 1.0g 氯化钠2.0g
葡萄糖 1.0g 磷酸二氢钾2.0g
0.4％酚红溶液 3.0ml 琼脂18～20g
20％尿素溶液100 ml 蒸馏水1000ml
PH 7.0
3.2 制备将上述成分(除酚红、尿素外)混合于蒸馏水中，加热溶解，校正PH，加入酚红溶液，分装每瓶100ml，置120℃灭菌15分钟备用。
临用时，加热溶解，冷却至55℃左右，加入无菌的尿素溶液10ml，摇匀，无菌分装于灭菌试管，每支2ml，并置成斜面备用。
4．质控
大肠埃希菌ACTT 25922为阴性，奇异变形杆菌ACTT 49005为阳性。
5.操作步骤
将待检菌接种至含尿素培养基中，35℃孵育1～4日。
6.结果判断
红色者为阳性。
7.注意事项
所有尿素培养基均依靠出现碱性来证实，故对脲酶不是特异性的。
某些细菌如铜绿假单胞菌利用培养基的蛋白胨可分解为多量氨基酸，使PH升高呈碱性，造成假阳性。
因此必须用无尿素的相同培养基作为对照。
8.临床意义
主要应用于肠杆菌科中的变形杆菌属细菌的鉴别。
奇异变形杆菌和普通变形杆菌脲酶阳性。