微生物群落多样性测序与功能分析
基于宏基因组学的微生物多样性分类与功能分析研究
基于宏基因组学的微生物多样性分类与功能分析研究随着生物信息学技术的不断发展，基于宏基因组学的微生物多样性分类与功能分析研究越来越受到人们的关注和重视。
所谓宏基因组学，是指对整个生态系统中所有微生物群落的基因组信息进行研究。
这一技术的出现，不仅推动了微生物学的发展，也极大地促进了生态学、农业、环境科学等多个领域的研究。
一、什么是宏基因组学？传统的微生物学研究主要关注单一的菌株或者是少量的肠道微生物。
而基于宏基因组学的研究，则涉及到整个微生物群落中数以百万计的基因组。
通常来说，一个微生物群落中存在着高达10^12个细胞，而每个细胞中又拥有着数千个基因。
这些基因组成了微生物群落的宏基因组，包含有关微生物种群结构、税onomic类别、代谢路径和功能的丰富信息，是解析微生物群落结构和功能的重要依据。
与传统微生物学的研究不同，宏基因组学的分析是通过直接从样品中提取基因组DNA，并进行高通量测序分析，来获得样品中所有微生物的基因组信息。
基因组序列的测定可以为微生物丰富的基因组信息提供数据支持，更加全面和准确地揭示微生物生态系统的结构和功能。
二、微生物多样性分类分析基于宏基因组学的微生物分类可以分为两个层次：1）微生物群落组成的分析2）微生物分类和区别微生物群落组成的分析宏基因组学的核心研究是对微生物群落的组成及数量分析，常采用16S rRNA基因测序、18S rRNA、ITS测序等方法进行序列拼接、聚类、注释等步骤，目的是通过对样品中微生物序列的分类和聚类分析，快速、准确地鉴定微生物群落的组成及数量动态变化。
此外，还可以通过聚类分析、物种和功能丰度的计算等多种方法，对微生物群落的组成与相对量进行深入分析。
微生物分类和区分与传统微生物分类研究中，常使用的16S rRNA基因序列进行分类和鉴定不同，宏基因组学中微生物分类更多地利用基因组DNA序列。
根据基因组DNA序列的相似性，微生物的分类越来越细致，可以精确定位不同病原体菌株，以此进行诊断、监测和预防疾病的发生。
微生物群落结构与功能的实验与分析
微生物群落结构与功能的实验与分析在自然环境中，微生物以其数量庞大、种类繁多的优势，对环境进行着重要的作用。
微生物群落是指由同种或不同种微生物组成的群体，其种类、数量、组成结构及其功能等因素对生态系统的能量转换、物质循环和有机质降解等生态生物学过程起着至关重要的作用。
因此，研究微生物群落的结构与功能势必对环境保护、农业生产、医学健康、食品加工等诸多领域产生积极的影响。
本文主要介绍了微生物群落结构与功能的实验与分析方法。
一、采样方法采样是研究微生物群落结构与功能的第一步，其目的是得到尽可能全面、代表性的样品。
采样前应先了解研究对象所处的生态环境、分类群落组成和其生态、生理特性等，然后根据研究目的选择合适的采样位置、采样时间和采样方式。
目前常用的采样方式主要有现场采样、冷冻采样、固定液采样和滤膜采样等。
二、DNA提取和PCR扩增对于微生物群落的分析，我们需要先将样品中的微生物分离出来，并提取出其DNA信息。
DNA提取是微生物学研究中非常重要的一步，不仅要提取出微生物DNA，还需去除杂质，以保证PCR扩增的准确性和效率。
我们常用的DNA提取方法有物理法、酚氯仿法、柱式纯化法等。
而PCR技术是无论是聚合酶链式反应还是数量PCR，都是非常重要的实验步骤，可以使用多种PCR方法进行DNA扩增，扩增产品可以用于下一步的高通量测序。
三、高通量测序高通量测序技术（NGS）是近年来最为流行的一种分析微生物群落结构的方法，其根据扩增的DNA序列信息，直接采用多通道测序进行大规模的高通量测序，得到微生物群落的DNA序列信息。
高通量测序能够快速、准确地获取微生物群落序列信息，大大提高了微生物组学研究的效率。
四、生物信息学分析高通量测序获得的微生物群落数据与信息复杂、数量庞大，对于如何处理这些信息及如何进行分类、聚类与多样性分析等，需要进行生物信息学分析。
生物信息学分析可以直接或间接地揭示微生物群落的物种组成及丰度、生物学聚类关系等信息。
微生物群落分析和功能预测
微生物群落分析和功能预测微生物群落分析和功能预测是现代生态学研究中的重要分支，揭示了微生物在生态系统中的重要作用。
通过对微生物群落的组成结构、丰度分布以及功能潜力的研究，我们可以更好地理解微生物在环境中的作用和功能。
微生物群落分析是一种通过对环境样品中微生物群落的物种组成和结构进行高通量测序分析的方法。
通过测序技术，我们可以获取到数千上万个微生物序列，然后利用生物信息学方法对这些序列进行分析和解读。
微生物群落分析可以帮助我们了解微生物在特定环境中的多样性、丰度以及不同物种之间的相互作用关系。
对于微生物群落的功能预测，常用的方法是通过基于16S rRNA或整个基因组的元转录组测序。
这些技术可以预测微生物群落中所包含的代谢途径和功能模块。
功能预测可以帮助我们了解微生物在环境中的生理功能，以及其对环境的影响和适应性。
微生物群落分析和功能预测在实际应用中有着广泛的研究领域。
例如，在农业生产中，通过分析土壤微生物群落，可以评估土壤肥力、抗逆性和有害生物的发生情况，从而指导农作物种植和管理。
在环境保护方面，微生物群落分析可以帮助我们监测水体、土壤和空气中的微生物污染，评估环境健康状况。
在药物研发领域，微生物群落分析可以帮助我们研究微生物对药物代谢的影响，为新药开发提供依据。
此外，微生物群落分析还在研究人类健康与疾病之间的关系、食物微生物安全性等方面发挥着重要作用。
为了进行微生物群落分析和功能预测，研究人员通常需要使用一系列的生物信息学和统计学工具。
首先，对于微生物群落测序数据的分析，常用的工具有QIIME、Mothur和UPARSE等。
这些工具可以进行序列质控、去除噪声、去除低质量序列等预处理流程，并且进行物种丰度统计、群落结构聚类分析等。
其次，对于功能预测，可以使用MetagenomeSeq、PICRUSt等工具，通过基因家族预测、途径富集分析等方法来预测微生物群落的功能潜力。
然而，微生物群落分析和功能预测也存在一些挑战和局限性。
土壤微生物群落及其功能的高通量测序技术研究
土壤微生物群落及其功能的高通量测序技术研究土壤微生物群落是指土壤中的各种微生物（包括细菌、真菌、古菌和叶绿体、线粒体等小型生物）的总称。
它们以其丰富的分类、种群丰度和多样性，被认为是维持土壤生态系统功能和养分循环的关键因素。
因此，研究土壤微生物群落及其功能对于理解土壤生态系统功能和土壤质量的影响具有重要意义。
随着高通量测序技术的发展，特别是基于16SrRNA等功能基因的测序技术，研究土壤微生物群落及其功能的研究进展迅速。
高通量测序技术通过从土壤样品中提取DNA或RNA，利用PCR扩增目标基因片段，并通过高通量测序仪器获取海量的序列数据。
这些数据可以揭示出土壤微生物的多样性、丰度、功能以及微生物间的相互作用等信息。
研究土壤微生物群落及其功能的高通量测序技术主要包括以下几个方面：1. 多样性分析：通过对测序数据进行聚类、物种多样性指数计算和Beta多样性分析等统计方法，可以了解土壤微生物群落的物种组成、多样性和相对丰度等信息。
2.功能注释：通过比对测序数据与数据库中的功能基因序列进行比对，可以对土壤微生物的功能进行注释，如其参与的代谢途径、功能基因的存在与否等。
3.生态功能研究：通过分析测序数据中的功能基因组成和它们的相互作用网络等信息，可以预测土壤微生物群落对养分循环、有机物降解、抗性基因传播等功能的影响。
4. 基因表达研究：通过转录组测序（RNA-seq）等技术，可以研究土壤微生物群落在不同环境条件下的基因表达变化，以及参与重要生态功能的关键基因的表达情况。
5.网络分析和预测模型：通过将多个生态学和统计学方法相结合，可以构建微生物间相互作用网络，预测土壤微生物群落的养分循环、有害物分解等功能，并为土壤生态系统的管理和保护提供决策支持。
总之，高通量测序技术在研究土壤微生物群落及其功能方面具有重要的应用潜力。
通过揭示土壤微生物群落的多样性、丰度、功能以及微生物间的相互作用，可以深入理解土壤生态系统的功能和稳定性，并为保护、修复和提高土壤质量提供科学依据。
微生物群落的多样性及生态功能
微生物群落的多样性及生态功能微生物是生命中最早出现的种类，它们在地球上充当着至关重要的角色。
每个生物体内都有自己的微生物群落，不同类型的微生物可以相互作用，这种作用对宿主生物的健康和生物系统的生态平衡有着重要的影响。
因此，微生物群落多样性以及它们的生态功能是一个备受关注的研究领域。
微生物群落的多样性微生物群落多样性是指在一个生态系统中，存在的微生物群落种类的数量和种群丰度的差异。
微生物群落的多样性是生态系统最基本的特征之一，这种多样性直接反映了微生物群落在生态系统中的重要性。
目前，在研究微生物群落多样性方面，主要采用的方法是高通量测序技术。
这种技术可以分析水样、土壤、根际等环境中微生物的群落结构，对于微生物群落的多样性评估提供了重要的数据。
通过高通量测序技术的运用，研究人员可以准确地分析和比较不同环境下的微生物群落多样性。
例如，对于同一类型的土壤，通过对微生物群落多样性进行比较，可以发现不同土地不同深度、不同土地的微生物群落组成也不一样。
微生物群落的生态功能微生物群落的生态功能是指微生物群落与所生存的环境之间的相互作用和影响，以及微生物群落对宿主的健康和生态平衡的贡献。
微生物群落的生态功能是微生物在自然界中的重要表现之一。
1. 模数微生物群落中存在各种各样的生物，它们之间的相互作用和影响也是微生物群落的重要组成部分。
微生物群落中有一种生物或一种物质的作用会影响到其它生物体，调节着微生物群落的数量和特性。
具体来说，模数在微生物群落中发挥着重要的作用。
模数可以促进微生物群落之间的相互作用，限制某些微生物的生长，避免生态系统退化。
这种模数在微生物群落的多样性和生态平衡中发挥着至关重要的作用。
2. 生态系统的调控微生物群落的种类和数量会影响到生态系统的平衡和稳定。
微生物群落中的某些种类能够控制害虫、减少土壤侵蚀，并使氮、碳等营养元素循环更加稳定。
另一方面，不同的微生物群落种类也能够对不同生态系统的干旱和气候多样性进行调节。
微生物群落结构和功能的分析
微生物群落结构和功能的分析微生物群落是生物界中最为复杂且具有多样性的存在形式之一，包括了各种微生物如细菌、真菌和病毒等。
这些微生物群落在生态系统中发挥着至关重要的作用，例如参与循环和转换元素、降解有害物质等。
近些年，随着高通量测序技术的发展，对微生物群落的研究已经进入了全新的阶段，可以直接快速地获取群落的结构和功能信息。
微生物群落结构的分析主要是通过对各种微生物的数量、分布和多样性等方面的研究，来了解群落的组成和结构。
测序技术是获取微生物群落结构信息的主要手段之一，其中最常用的是16S rRNA基因测序和整个基因组测序。
16S rRNA基因测序通常用于菌群的分类及进化研究，主要依据不同微生物菌株之间的16S rRNA序列差异，划分它们所在的分类学种属。
而整个基因组测序则可获得各群落（单个生物体）的全面信息，包括菌株的基因、诱导基因、功能基因等。
基于组成和多样性的分析可以展示出微生物群落结构的复杂性和多样性，发现了可能影响群落结构的因素，如环境、时间、寄主体健康等。
微生物群落结构的另一个值得研究的方面则是微生物之间的相互作用和竞争关系，这些关系可透过特定宿主与微生物的之间互动过程展示出来。
与微生物群落结构相对应的则是群落的功能。
微生物群落的功能是指在宿主中的蒸馏和因子转换能力。
微生物群落功能的分析通常采用元转录组测序技术，可以研究群落中活跃的基因、代谢通路以及制定元件和酶的信号途径，帮助理解微生物群落对宿主的影响和调节。
在这个过程中，不仅仅是找到了细菌群落中的各类基因，同时也是有助于发现宿主与微生物之间我们未知的相互作用关系，例如有研究表明肠道微生物可影响人的神经系统功能，而口腔微生物则可能影响痴呆症的发生和发展。
在研究微生物群落结构和功能的时候，我们不仅需要了解群落存在的环境和条件，还需要进行其他多方位的研究。
例如要在样本前处理中尽量避免引入各类干扰物，以保证测序数据的准确性；同时我们也应该考虑样本的大小、采集时间点以及样品存储条件等信息向客观生物学家分享并将其记录。
土壤微生物群落组成及功能多样性分析
土壤微生物群落组成及功能多样性分析土壤微生物是生命活动中重要的一部分，在生态系统中扮演着至关重要的角色。
它们参与着土壤养分循环、有机质分解、病原菌对土壤的控制等众多生态过程，同时也与生态系统稳定性和寿命息息相关。
土壤微生物群落组成土壤微生物群落是指有机体、物理因素和生态因素的相互作用，形成的一种复杂的微生物社会。
这个社会包括细菌、真菌、放线菌、原生动物、线虫等。
不同地理位置、土壤、微生物群落组成与多样性也不相同。
美国加州与得克萨斯州的土壤微生物群落组成可大致分为两类，其中一类适合湿润土壤，另一类则适合干旱土壤。
在中国东北地区，黑土地的土壤微生物群落组成表现出更强的适应性。
这种适应性使得地区的土地和农业发展更加可持续。
土壤微生物群落多样性和功能不同的土壤微生物群落具有不同的生态作用。
土壤微生物群落多样性与生境分布和生态功能密切相关。
通过了解微生物群落多样性以及微生物群落对生态系统的作用，有助于我们对生态系统进行管理和保护。
1. 氮循环土壤中微生物对氮循环过程起着重要作用。
通过分解有机物，释放出氮，一部分通过硝酸盐还原形式进入植物生长，直接促进植物生长。
同时，微生物能够分解硝酸盐，还原成氮气，进一步释放出更多的氮气，并起到良好的调节作用。
2. 碳循环土壤中的很多微生物都可降解有机碳，将其转换为二氧化碳，进而形成相当量的碳循环。
此循环涉及到的微生物主要是细菌和真菌，它们可通过分解植物、动物或其他有机物来释放碳。
同时，生产碳酸氢根、磷酸根等化合物，参与土壤酸碱度调节和微量元素的形成。
3. 生物控制土壤中不同的微生物族群能够控制其他微生物的生长。
微生物间的竞争，有利于形成更加稳定的生态环境，保护生态系统的平衡。
例如放线菌和雷克莫西菌都有很强的生物控制能力，在土壤中能够控制一些具有病原性的微生物生长，减轻它们对植物的伤害。
4. 铁辅酶的生成铁辅酶是微生物辅助下形成的具有抗氧化功能重要的生物分子。
铁辅酶可作为一项重要的调节分子，在植物生长发育、碳和氮循环等生态系统中发挥着重要作用。
基于高通量测序技术的微生物群落结构与功能分析
基于高通量测序技术的微生物群落结构与功能分析随着科技的不断进步，高通量测序技术的发展为微生物研究提供了强有力的工具。
通过对微生物群落的测序分析，我们可以了解微生物群落的结构和功能，进而揭示微生物在各个生态系统中的作用和调控机制。
本文将对基于高通量测序技术的微生物群落结构与功能分析进行探讨。
一、高通量测序技术介绍高通量测序技术是一种能够同时对大量DNA或RNA序列进行测序的技术，其基本原理是将DNA或RNA片段在芯片或测序仪上进行并行测序。
目前常用的高通量测序技术包括 Illumina HiSeq、Ion Torrent 等。
这些技术具有高度准确性、高通量和较低的成本，成为微生物群落分析的首选方法。
二、微生物群落结构分析微生物群落结构分析主要通过16S rRNA基因测序来揭示微生物物种组成和相对丰度。
16S rRNA是微生物细菌的保守基因，在不同微生物之间具有一定的差异性。
通过测序分析16S rRNA基因，可以根据序列相似性将微生物分类为不同的OTUs（操作分类单元），并计算各OTUs的相对丰度。
此外，还可以通过构建菌群共生网络等方法揭示微生物群落中各微生物之间的相互作用关系。
三、微生物群落功能分析除了了解微生物群落的物种组成外，功能分析可以帮助我们揭示微生物群落在生态系统中的作用和功能。
功能分析常通过基因组测序等方法来预测微生物的功能潜力。
通过对微生物基因组的注释和功能预测，可以获得微生物群落在碳循环、氮循环、硫循环等生物地球化学过程中的潜在贡献。
四、高通量测序技术在微生物群落分析中的应用基于高通量测序技术的微生物群落分析在许多领域中有广泛应用。
例如，在环境微生物学研究中，可以通过分析土壤、水体、空气等中微生物群落的结构和功能，了解微生物参与物质循环和能量转化的机制。
在人体微生物组研究中，可以通过分析口腔、肠道等部位微生物群落的结构和功能，揭示微生物与宿主的相互作用关系，为疾病的诊断和治疗提供依据。
微生物群落多样性与稳定性分析
微生物群落多样性与稳定性分析微生物群落是由各种生物组成的群体，包括细菌、真菌、原生动物、病毒等。
微生物群落一般存在于土壤、水体、人体等不同环境中，是环境中生态系统的重要组成部分。
微生物群落多样性与稳定性是针对微生物群落而言的，是研究微生物群落演化、功能和生态系统稳定性的重要指标。
本文将从多样性与稳定性两个方面来阐述微生物群落的性质和研究方法。
一、微生物群落的多样性分析微生物群落多样性，即微生物群落内物种种类和数量的丰富程度。
在微生物群落研究中，多样性研究是基础性工作。
探究微生物群落多样性可以为后续的微生物群落功能和生态系统稳定性的研究奠定基础。
微生物群落的多样性可以从如下几个方面进行研究：1. 物种多样性分析物种多样性是微生物群落多样性的其中一个指标，它是指在一个生态系统中不同物种个体的数量和比例。
物种多样性的指标可以包括古马氏多样性指数、盖氏多样性指数等。
通过这些指标的计算，可以得到样本内的物种多样性丰富度状况。
2. 丰度分析微生物群落多样性的研究还可以通过对微生物群落中各个物种的丰度进行分析。
在微生物群落中，一些物种的丰度高，而另一些物种的丰度低。
通过对微生物群落中不同物种的丰度分析，研究者可以了解到不同物种在群落中的贡献，进而对该微生物群落的结构进行深入了解。
3. 遗传多样性分析微生物群落的遗传多样性是指微生物群落内微生物的基因组进行分析所得到的多样性指标。
通过对微生物群落内不同微生物的遗传多样性进行分析，可以了解到微生物群落内在生物进化过程中的多样性。
4. 功能多样性分析在微生物群落中，各种微生物具有各自的功能，不同的微生物共同协作共同完成一些代谢过程或其他生物学特性。
对微生物群落功能多样性的分析可以进一步揭示出微生物之间的相互作用方式及其在生态系统中的作用。
二、微生物群落的稳定性分析微生物群落稳定性是指微生物群落内物种丰富度、物种多样性和种群数量等的变化概率。
微生物群落稳定性研究是研究微生物群落动态变化和生态系统稳定性的重要指标。
微生物群落测序与功能分析课件
宏基因组测序
所有物种（包括病毒） 组成及丰度、基因组成、代谢
2020
谢谢观看
• 可变区可以分辨物种间的差异，而保守区则反应了物种间的亲缘关系。
• 传统方法中最常用的引物是27F和1492R，几乎能扩增出完整的16SrRNA基因全长，由于目前二代高 通量测序的读长限制，该引物不适用于高通量测序平台，但被广泛用于纯菌的分子鉴定。考虑到目前 主流高通量测序平台读长的限制，只能对16SrDNA的某一段可变区进行测序。有的文献中选择测单V 区（V3/V4/V6），有的测双V区（V3-V4区或V4-V5区），还有的选择三V区（V1-V3区、V5-V7区或 V7-V9区）进行16S rDNA测序。
的种类差异。 • ITS 测序 :内转录间隔区。是真菌核糖体RNA（rRNA）基因非转录区的一部分。 该类测序主要对环境
微生物中的真菌多样性进行分析。包含两个区域：ITS1位于真核生物核糖体rDNA序列18S和5.8S之间； ITS2位于真核生物核糖体rDNA序列5.8S和28S之间。
1、16S 是个啥？
3、16S测序区域到底该怎么选择？
• 测序平台的限制，想测的准，当然长度越长越准确嘛，但是出于经济实惠的角度考虑，其实测双V甚 至单V区也已经足够。一般而言，我们环境微生物组学常用的，也是认可度比较高的测序区域是V3-V4， V4-V5，或者单测V4区。
• 引物的偏好性，研究结果显示，V4-V5区域是最佳的测序区域，造成的基因组内异质性最小。V4-V5区 域显示了最低的高估程度（约为3.0%），而V6区域的高估程度最高（约为13%）。
• 16S rRNA 即16Sribosomal RNA，是原核核糖体30S小亚基的组成部分。16S中的'S'是一个沉降系数， 亦即反映生物大分子在离心场中向下沉降速度的一个指标，值越高，说明分子越大。16SrRNA基因是 细菌上编码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有原核微生物的基因组中。16S rRNA具有高度的保守 性和特异性以及该基因序列足够长（包含约50个功能域）。随着PCR技术的出现及核酸研究技术的不 断完善，16S rRNA基因检测技术已成为病原菌检测和鉴定的一种强有力工具。数据库的不断完善，应 用该技术可以实现对病原菌进行快速、微量、准确简便地分类鉴定和检测。该技术主要有三个步骤： 首先是基因组DNA的获得，其次是16S rRNA基因片段的获得，最后是进行16S rRNA基因序列的分析。
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微生物群落多样性测序与功能分析微生物群落测序是指对微生物群体进行高通量测序，通过分析测序序列的构成分析特定环境中微生物群体的构成情况或基因的组成以及功能。
借助不同环境下微生物群落的构成差异分析我们可以分析微生物与环境因素或宿主之间的关系，寻找标志性菌群或特定功能的基因。
对微生物群落进行测序包括两类，一类是通过16s rDNA，18s rDNA，ITS区域进行扩增测序分析微生物的群体构成和多样性；还有一类是宏基因组测序，是不经过分离培养微生物，而对所有微生物DNA进行测序，从而分析微生物群落构成，基因构成，挖掘有应用价值的基因资源。
以16s rDNA扩增进行测序分析主要用于微生物群落多样性和构成的分析，目前的生物信息学分析也可以基于16s rDNA的测序对微生物群落的基因构成和代谢途径进行预测分析，大大拓展了我们对于环境微生物的微生态认知。
目前我们根据16s的测序数据可以将微生物群落分类到种（species）（一般只能对部分菌进行种的鉴定），甚至对亚种级别进行分析，几个概念：16S rDNA（或16S rRNA）：16S rRNA基因是编码原核生物核糖体小亚基的基因，长度约为1542bp，其分子大小适中，突变率小，是细菌系统分类学研究中最常用和最有用的标志。
16S rRNA基因序列包括9个可变区和10个保守区，保守区序列反映了物种间的亲缘关系，而可变区序列则能体现物种间的差异。
16S rRNA基因测序以细菌16S rRNA基因测序为主,核心是研究样品中的物种分类、物种丰度以及系统进化。
OTU：operational taxonomic units (OTUs)在微生物的免培养分析中经常用到，通过提取样品的总基因组DNA，利用16S rRNA或ITS的通用引物进行PCR 扩增，通过测序以后就可以分析样品中的微生物多样性，那怎么区分这些不同的序列呢，这个时候就需要引入operational taxonomic units，一般情况下，如果序列之间，比如不同的 16S rRNA序列的相似性高于97%就可以把它定义为一个OTU，每个OTU对应于一个不同的16S rRNA序列，也就是每个OTU对应于一个不同的细菌（微生物）种。
通过OTU分析，就可以知道样品中的微生物多样性和不同微生物的丰度。
测序区段：由于16s rDNA较长（1.5kb），我们只能对其中经常变化的区域也就是可变区进行测序。
16s rDNA包含有9个可变区，分别是v1-v9。
一般我们对v3-v4双可变区域进行扩增和测序，也有对v1-v3区进行扩增测序。
∙16s rDNA测序首先需要提取环境样品的DNA，这些DNA可以来自土壤、粪便、空气或水体等任何来源。
∙提取DNA后需要经过质检和纯化，一般16s rDNA测序扩增对DNA的总量要求并不高，总量大于100ng，浓度大于10ng/ul一般都可以满足要求。
如果是来自和寄主共生的环境如昆虫的肠道微生物，提取时可能包括了寄主本身的大量DNA，对DNA的总量要求会提高。
微生物菌群多样性测序受DNA提取和扩增影响很大，不同的扩增区段和扩增引物甚至PCR循环数的差异都会对结果有所影响。
因而建议同一项目不同样品的都采用相同的条件和测序方法，这样相互之间才存在可比性。
∙完成PCR之后的产物一般可以直接上测序仪测序，在上机测序前我们需要对所有样本进行定量和均一化，通常要进行荧光定量PCR。
完成定量的样品混合后就可以上机测序。
∙16s rDNA测序目前可以采用多种不同的测序仪进行测序，包括罗氏的454，Illumina的MiSeq，Life的PGM或Pacbio的RSII三代测序仪。
不同的仪器各有优缺点，目前最主流的是Illumina公司的MiSeq，因为其在通量、长度和价格三者之间最为平衡。
MiSeq测序仪可以产生2x300bp的测序读长，一次可以产生15Gb的测序数据远远大于其他测序仪的测序通量。
1. 116s rDNA分析基本流程：2. 2原始数据处理：原始测序数据需要去除接头序列，并将双端测序序列进行拼接成单条序列。
根据测序barcode序列区分不同的样本序列。
过滤低质量序列和无法比对到16s rDNA数据库的序列。
3. 3OTU分类和统计：OTU(operational taxonomic units) 是在系统发生学研究或群体遗传学研究中，为了便于进行分析，人为给某一个分类单元（品系，种，属，分组等）设置的同一标志。
通常按照 97% 的相似性阈值将序列划分为不同的 OTU，每一个 OTU 通常被视为一个微生物物种。
相似性小于97%就可以认为属于不同的种，相似性小于93%-95%，可以认为属于不同的属。
样品中的微生物多样性和不同微生物的丰度都是基于对OTU的分析。
使用QIIME（version 1.8.0）工具包进行统计注释。
使用QIIME（version 1.9.0, /qiime/）的ucluster方法根据97%的序列相似度将所有序列进行同源比对并聚类成operational taxonomic units (OTUs)。
然后与数据库GreenGenes（version gg_13_8, /cgi-bin/JD_Tutorial/nph-16S.cgi）进行比对，比对方法uclust，identity 0.9 。
然后对每个OTUs进行reads数目统计。
下面的2个表，其中一个表是对每个样本的测序数量和OTU数目进行统计，并且在表栺中列出了测序覆盖的完整度（显示前10个样本）。
另一个表是对每个样本在分类字水平上的数量进行统计，并且在表栺中列出了在每个分类字水平上的物种数目（显示前10个样本）。
可以看到绝大部分的OTU都分类到了属（Genus），也有很多分类到了种（Species）。
但是仍然有很多无法完全分类到种一级，这是由于环境微生物本身存在非常丰富的多样性，还有大量的菌仍然没有被测序和发现。
测序数目统计表主要是对每个样本的测序数量和OTU数目进行统计，并且在表格中列出了测序覆盖的完整度（显示前10个样本，如果样本超过10个，请查看结果中otu_stat.txt文件）其中 SampleName表示样本名称；SampleSize表示样本序列总数；OTUsNumber表示注释上的OTU数目；OTUsSeq表示注释上OTU的样本序列总数。
Coverage是指各样品文库的覆盖率，其数值越高，则样本中序列没有被测出的概率越低。
该指数实际反映了本次测序结果是否代表样本的真实情况。
计算公式为：C=1-n1/N 其中n1 = 只含有一条序列的OTU的数目； N = 抽样中出现的总的序列数目。
分类水平统计表主要是对每个样本在分类学水平上的数量进行统计，并且在表格中列出了在每个分类学水平上的物种数目（只显示前10个样本，如果样本超过10个，请查看结果中taxon_all.txt文件）其中SampleName表示样本名称；Phylum表示分类到门的OTU数量；Class 表示分类到纲的OTU数量；Order表示分类到目的OTU数量；Family表示分类到科的OTU数量；Genus表示分类到属的OTU数量；Species表示分类到种的OTU数量。
4. 4我们还可以对这些种属的构成进行柱状图显示：横坐标中每一个条形图代表一个样本，纵坐标代表该分类层级的序列数目或比例。
同一种颜色代表相同的分类级别。
图中的每根柱子中的颜色表示该样本在不同级别（门、纲、目等）的序列数目，序列数目只计算级别最低的分类，例如在属中计算过了，则在科中则不重复计算。
Q: 为什么要选择V3-V4区的测序长度？为什么有些文献是V6区，有什么区别？A: 16S rRNA总长约1540 bp，包含 9个可变区。
由于高通量测序的测序长度的限制，不可能将16S rRNA的9个可变区全部测序，所以在PCR扩增时往往只能选择1-3个可变区作为扩增片段。
Kozich 等评估了Miseq测序仪分析的不同16S rRNA可变区的准确性发现，测定 V4 区效果最佳。
根据我们的测序长度，v3-v4区是最佳选择。
5. 5我们还需要对样本之间或分组之间的OTU进行比较获得韦恩图：注意，韦恩图目前一般最多只能显示5个样本或分组，过多的样本无法无法进行韦恩图绘制6. 6样品构成丰度：稀释曲线微生物多样性分析中需要验证测序数据量是否足以反映样品中的物种多样性，稀释曲线（丰富度曲线）可以用来检验这一指标。
稀释曲线是用来评价测序量是否足以覆盖所有类群，并间接反映样品中物种的丰富程度。
稀释曲线是利用已测得16S rDNA序列中已知的各种OTU的相对比例，来计算抽取n个（n小于测得reads序列总数）reads时出现OTU数量的期望值，然后根据一组n值（一般为一组小于总序列数的等差数列）与其相对应的OTU数量的期望值做出曲线来。
当曲线趋于平缓或者达到平台期时也就可以认为测序深度已经基本覆盖到样品中所有的物种；反之，则表示样品中物种多样性较高，还存在较多未被测序检测到的物种。
下图中的稀释曲线横坐标代表随机抽取的序列数量；纵坐标代表观测到的OTU数量。
样本曲线的延伸终点的横坐标位置为该样本的测序数量，如果曲线趋于平坦表明测序已趋于饱和，增加测序数据无法再找到更多的OTU；反之表明不饱和，增加数据量可以发现更多OTU。
7.7Shannon-Winner曲线Shannon-Wiener 曲线，是利用shannon指数来进行绘制的，反映样品中微生物多样性的指数，利用各样品的测序量在不同测序深度时的微生物多样性指数构建曲线，以此反映各样本在不同测序数量时的微生物多样性。
当曲线趋向平坦时，说明测序数据量足够大，可以反映样品中绝大多数的微生物物种信息。
与上图一样，横坐标代表随机抽取的序列数量；纵坐标代表的是反映物种多样性的Shannon指数。
样本曲线的延伸终点的横坐标位置为该样本的测序数量，如果曲线趋于平坦表明测序已趋于饱和，增加测序数据无法再找到更多的OTU；反之表明不饱和，增加数据量可以发现更多OTU。
其中曲线的最高点也就是该样本的Shannon指数，指数越高表明样品的物种多样性越高。
Q: Shannon指数怎么算的？A: Shannon指数公式：其中，Sobs= 实际测量出的OTU数目；ni= 含有i 条序列的OTU数目；N = 所有的序列数。
8.8Rank-Abundance曲线用于同时解释样品多样性的两个方面，即样品所含物种的丰富程度和均匀程度。
物种的丰富程度由曲线在横轴上的长度来反映，曲线越宽，表示物种的组成越丰富；物种组成的均匀程度由曲线的形状来反映，曲线越平坦，表示物种组成的均匀程度越高。
一般超过20个样本图就会变得非常复杂而且不美观，所以一般20个样本以下会做该图，图片保存为结果目录中rank.pdf。