黑曲霉酸性_甘露聚糖酶的纯化及部分性质研究
新型酶制剂——β-甘露聚糖酶研究进展
北京博仕奥生物技术有 限公 司
［ 文献标识码】 Ｃ
植物细胞 壁 主要 由纤维 素 、 纤维 素及 木质 素 半
甘 露 聚 糖 酶 。杨 文 博 （ ９ ５ 、 红 英 （０ ３ 、 １ ９ ）余 ２ ０ ） 吴襟 （０ ０ 分别 对地 衣 芽孢 杆 菌 Ｂ ｃｌ ｓ ｉｈｅ ｏ ｒ ｓ ２０ ） ａｉｕ ｃ ｉｎｆ ｍｉ ｌ ｌ ｏ Ｎ 一２ Ｋ ７产生 的碱 性 Ｂ 甘露 聚糖酶 、 草芽孢 杆菌 一 枯
来越 受 到重视 ， 在饲料 中添加酶 制剂 是解 决这 一 问 题 的 主要 途径 。甘露 聚 糖 的完全 酶解 需要 Ｂ 甘露 一 聚 糖 酶 （ Ｃ ．． ７ ）Ｂ 甘 露 糖 苷 酶 （Ｃ ．．． ） Ｅ ３ １ ８ 、一 ２ ． Ｅ ３２１ ５ 、 ２ Ｂ一葡 糖 苷 酶 （Ｃ ．． ２ ） 一半 乳 糖 苷 酶 Ｅ ３ １ １、 ２ ．
Ｓ 一 ２产 生 的 巾性 Ｂ 甘露 聚糖 酶 、诺 卡 氏菌 形放 Ａ ２ ～
线 菌 Ｎ ｃ ｒｉｆ ｍ ａｔ ｏ ｃｔ Ａ —５ ０ 产 生 ｏａｄｏｏ ｃｉ ｍｙｅｅ Ｎ ３ ４ Ｃ ｒ ｎ ｓ
等物 质 构成 。甘 露 聚糖 是植 物半 纤 维 素 的重 要 组 分， 由 Ｂ １ 一 一 是 一 ， Ｄ 甘露 糖 连接 而成 的线 状 多聚 体 ． ４
维普资讯
广东饲 料 第 １ ６卷第 ６期 ２ ０ ０ ７年 １ ２月
新型酶制剂
［ 中图分类号】 ９ ３７ Ｓ ６．
Ｉ ３ 一甘露聚糖酶研究进展
［ ３ ￣ ］ ０ — ６ ３ ２ ０ ）６ ０ ２— ３ １ ５ ８ １ （０ ７ ０ — ０ １０ ０
等） 发芽 的种子 中 以及 天南 星科 植物魔 芋 萌发 的球 茎 中都发 现 了 Ｂ 甘 露 聚糖 酶酶 活 的存在 。而 微 生 一
β-甘露聚糖酶产生菌的鉴定及其粗酶性质的研究
湖北大学学报（ 自然 科 学 版 ）
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文 章编 号 ：０ ０ ３ ５ ２ １ ）２— ２４— ３ １０ —２ ７ （０ ０ ０ ０ １ ０
１ 材 料 和 方 法
１１ 材 料 ． 土样采 自湖北 大 学沙 湖 荒地 ； ４连接 酶 、 ａ Ｔ Ｔ ｑ酶 、 ＮＴ ｄ Ｐ和 Ｄ ＮＡ ｒ ｅ 购 自 Ｔａ Ｒ ｍａｋ ｒ Ｋａ ａ公 司， 其他 生化试 剂均 为 国产分 析纯 ； Ｍ９ 本培 养基 、 Ｂ培养 基见 分 子克 隆［ 筛选 培 养基 ： 基 本 培 基 Ｌ ； Ｍ９
养基 中以 １ 魔芋 粉 为 唯 一碳 源再 加 入 ０ ０ 曲利 本 蓝 ， 酵 培 养 基 见 文献 Ｅ］ １ＳＤＮＡ 引 物 ５ ．５ 发 Ｔ ；６ ｒ ’
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１２ 环境 中产 酶菌株 的分 离 ．
取 ５ｇ土样加 入 到 １ ０ｍＬ无 菌水 中混 匀 浸 泡 １ｈ左 右 ， ０ 取适 量 土样 悬
液 稀释 ， 有水 解圈 的单 菌 落 ， 并接 种于 Ｌ Ｂ液体
培 养基 ，７℃振摇 富集培养 过夜 ． ３ １３ 基 因组 总 Ｄ Ａ的提 取和 质粒 的分 离 纯化 ． Ｎ 参 考分 子克 隆Ｌ ． ６ ］ １ ４ １ Ｓ Ｄ Ａ的 Ｐ Ｒ扩增 以提取基 因组 Ｄ ． ６ ｒ Ｎ Ｃ ＮＡ 为模板 ， １ Ｓ Ｄ 用 ６ ｒ ＮＡ 引物 进行 Ｐ Ｒ扩增 ， 环参 数 Ｃ 循
甘露聚糖酶的酶学性质研究
甘露聚糖酶的酶学性质研究甘露聚糖酶是一种半纤维素水解酶，以内切方式降解β-1，4糖苷键，降解产物的非还原末端为甘露糖，其作用底物包括葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖及β-甘露聚糖等。
它不仅能够降解肠道粘度，促进营养物质的消化和吸收，而且还可消除豆类中富含的β-甘露聚糖对葡萄糖吸收的干扰，极大提高饼粕尤其是豆粕的能量消化率；同时，添加了甘露聚糖酶后动物的抵抗力及整齐度都有提高。
甘露聚糖类物质作为半纤维素的第二大组分，广泛分布于自然界中。
它是所有豆科植物细胞壁的主要组成成分，在其他植物性饲料原料中含量也很高，如豆粕、小麦、菜籽粕、麸皮中半乳甘露聚糖占非淀粉多糖的含量分别为22.7％，11.9％，19.6％和33.7％。
我国猪、鸡的主要日粮是玉米／豆粕型日粮，尽管猪、鸡等单胃动物对玉米的消化率较高，但对豆粕的能量利用率仅为50％～60％。
单胃动物对豆粕能量的利用率如此低的原因可能是豆粕中含有22.7％左右的半纤维素是不能被单胃动物消化的非淀粉多糖。
饲料中添加甘露聚糖酶可以降解甘露聚糖、降低消化道内容物黏度，破坏植物性饲料细胞壁结构，使营养物质能与消化酶充分接触，提高内源酶的活性，改善肠道微生物菌群和提高肠粘膜的完整性等功能。
本文旨在通过对康地恩甘露聚糖酶的酶学性质研究，掌握有关数据，为实际应用提供理论依据和指导。
1材料与方法1.1 材料与试剂康地恩甘露聚糖酶；甘露聚糖（Sigma公司）；3,5—二硝基水杨酸（DNS）；甘露糖（Sigma公司）。
1.2 主要实验仪器 722型分光光度计；电子分析天平；可调恒温水浴锅；精密pH计等。
1.3 酶活力测定1.3.1酶活测定方法。
采用还原糖法（DNS）测定。
1.3.2 酶活力单位定义。
在40℃、pH4.5的条件下，每分钟从甘露聚糖（Sigma G0753）溶液中降解释放1 μg还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位U。
1.3.3甘露糖标准曲线的绘制。
配制10mg/mL的甘露糖溶液100mL，吸取上述溶液分别配制成浓度为0.10～0.70 mg/mL的甘露糖标准溶液。
产甘露聚糖酶细菌的分离鉴定、酶的部分纯化及酶学性质研究
酶的菌株袁经摇瓶培养后其酶活力达到 员园员 哉 辕 皂蕴遥 经形态观察及 员远杂 则阅晕粤 序列分析袁鉴定为枯草芽孢
பைடு நூலகம்
杆菌渊月葬糟蚤造造怎泽 泽怎遭贼蚤造蚤泽冤遥 利用硫酸铵分级沉淀尧阴离子交换层析和疏水层析对酶进行了部分纯化遥 对酶的
酶学性质研究发现袁该酶的最适反应温度为 缘园 益袁最适反应 责匀 为 缘援园曰在 源缘耀缘缘 益时酶的稳定性较好袁
在自然界中袁半纤维素的含量仅低于纤维素的 含量袁约占植物干重的 圆缘豫耀猿园豫袁是重要的可再生 资源咱员暂遥 如果将半纤维素进行生物转化生成简单的 糖类袁再转化成饲料尧燃料尧食品和化学制品等袁对 缓解全球的能源和食品危机尧环境污染及饲料短缺 等有极大意义咱圆暂遥 茁原甘露聚糖酶是属于半纤维素水 解酶类袁是一种广谱诱导型多功能酶袁因其能够以 内切的方式降解甘露聚糖尧葡甘露聚糖和半乳甘露 聚糖等中的 茁原员袁源 糖苷键而广泛应用于食品尧医
肥咱愿暂尧工厂废液咱怨暂尧植物内生菌咱员园暂和海洋环境咱员员暂等筛 选到产酶菌株遥 随着对该酶研究的深入袁研究重点 已经从最初的产酶菌株筛选尧发酵条件优化和酶的 性质等方面转移到产酶基因的克隆和异源表达等 方面咱员圆暂遥 目前袁已有多个微生物来源的 茁原甘露聚糖 酶实现了异源表达咱员袁源袁员猿暂遥 本试验从玉米地尧水稻地尧 棉花地表层土壤中分离产 茁原甘露糖酶的菌株袁对菌 株进行了鉴定袁然后初步纯化该酶袁并对其酶学性 质进行分析袁以期对该酶的工业化生产及应用提供 理论依据遥
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β-甘露聚糖酶研究进展
霉 菌 及链 霉菌 等 。 目前 ， 应用 于 工业生 产 甘 露 聚
糖酶 的菌 种也 多 为芽孢 杆菌 、 曲霉 、 酵母等 。微 生物 来 源 的 一甘 露聚糖 酶 具有许 多优 点 ，如酶 活性 高 、 生产 成本低 、 提取 方便 ， 具有 ｐ 温度作 用 范 围广 以 Ｈ、
杆 菌 Ｔ ｅｍ ｔ ａｎ ａｏｉ ｎ ０ ８中稳 定 的 一半 乳 ｈ ｒ ｏ ｇ ｅｐ ｌａａ５ ６ ｏ ｔ
糖苷 酶 和 一甘露 聚糖 酶则 是通 过离 子交 换 、 疏水 相
放线 菌 中的链 霉菌 等Ｉ。对 于合 成 一甘 露 聚糖酶 的 ２ ｌ
微 生物研 究较 多 的是枯 草芽 孢杆 菌 、 曲霉 菌 、 氏木 里
收稿 日 ：００ 叭一 ５ 修回 日 ：０ ０ ０ — ４ 期 ２１一 １； 期 ２ １ — ５ １
资助项 目： 育部新世纪优 秀人才支持计 划（ Ｃ Ｔ ０ — ８ ７ 教 Ｎ Ｅ 一 ７００ ） 作者简介 ： 崔栩 （ ９ ５ ） 男 ， １８ 一 ， 山东潍坊 人 ， 士 硕 通讯作者
要介 绍。
关键 词 ：－甘 露聚糖酶 ； 学性质 ／ ３ 酶
中 图 分 类 号 ： ８６７ １５ Ｓ １． ． ０ 文献标 识码 ： Ａ 文 章 编 号 ： ２ ８ ７ ３ （ ０ ０）５ ０ ６ － ４ ０ ５ — ０ ３ ２ １ １－ ０ ９ ０
甘 露 聚 糖 是 由 ／ １ 一 一吡 喃 甘 露 糖 连 接 而 成 ３ ，Ｄ －４ 的线 状 多聚体 ， 半纤 维素 的第 二大 组分 ， 是 广泛存 在
２ ｌ年 第 ４ 卷 篱 嬲 ００ 垂 ５
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黑曲霉酸性β-甘露聚糖酶的酶学特性
第２ ６卷 第 ２期 ２０ ０ ７年 ３月
食 品 与 生 物 技 术 学 报
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甘 露 聚 糖 酶 （－ ， 一 — ｎ ａ ｎ ｏ ｙ ｒ— ６１ ４Ｄ ｍａ ｎ ｎ ｍａ ｎ ｈ ｄ ｏ ｌｓ ，Ｅ ． ． ． ８ 是一 种 能 降 解 甘 露 聚 糖 、 萄 ａｅ Ｃ ３ ２ １ ７ ） 葡 甘 露聚糖 和半 乳甘露 聚糖 的主链 ｆ１ ４【 甘露糖 苷 ｝ ，一） ＿ ＿
ｃ ｒ ｏ ｙ ｒ ｔ ． Ｔｈ ｃ ｉ ｉｙ ｏ ｈ ｎ ｙ ｓ ｓ ｉ ｕ ａ ｅ ｙ Ｍ ｇ ＋、 Ｌ ＋、 ＋、 ａｂ ｈ ｄ ａｅ ｅ ａ ｔｖ ｔ ｆ ｔ ｅ ｅ ｚ ｍｅ ｗａ ｔ ｍ ｌｔ ｄ ｂ Ｃａ ＋、 ｉ Ｎａ Ｋ＋ ， ｕ ｂ ｔ
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文章 编 号 ：６ ３１８ （０ ７０ —０ １０ １ ７—６ ９２ ０ ）２０ ２ —５
饲用β-甘露聚糖酶的作用机理及其酶学性质研究
饲用β-甘露聚糖酶的作用机理及其酶学性质研究
罗长财;冯国华
【期刊名称】《中国饲料添加剂》
【年(卷),期】2009(000)011
【摘要】β-甘露聚糖酶作为一种新型饲用酶制剂，本文对其作用机理进行了阐述，并对黑曲霉产的β-甘露聚糖酶的酶学性质进行了系列研究。
研究结果表明：该酶
在最适反应温度、稳定性能等方面表现优良，适于作为饲用添加剂．
【总页数】4页(P21-24)
【作者】罗长财;冯国华
【作者单位】广东省溢多利生物科技股份有限公司研发中心,珠海519060
【正文语种】中文
【中图分类】S816.7
【相关文献】
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2.产甘露聚糖酶细菌的分离鉴定、酶的部分纯化及酶学性质研究 [J], 吴华伟;蔚鑫鑫;陈雪秋
3.饲用耐酸抗蛋白酶β-甘露聚糖酶的筛选分离及酶学性质 [J], 张文会;孙同韦;张
会图;王海宽;王洪彬;路福平
4.高产β-甘露聚糖酶菌株的分离鉴定及酶学性质研究 [J], 陈晓飞;李珊珊;刁文涛;
徐紫瑜;刘德海
5.2种水产饲用蛋白酶的主要酶学性质研究 [J], 齐莉莉;王进波
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黑曲霉生产糖化酶及酶活测定
第19卷 第7期 牡丹江大学学报 Vol.19 No.7 2010年7月 Journal of Mudanjiang University Jul. 201092 文章编号：1008-8717（2010）07-0092-03黑曲霉生产糖化酶及酶活测定单 海 艳（牡丹江大学，黑龙江 牡丹江 157000）摘 要：本文对黑曲霉突变株Uv11－48生产糖化酶液体深层发酵进行了全程生产工艺的研究，证实了黑曲霉突变株是一种产孢力强、抗污染能力强、易培养的糖化酶生产菌，经液体深层通风发酵可得出：只要充分利用突变株的有利条件，掌握好菌种特性，合理配制营养，控制好发酵条件，便可获得高酶活力的高产糖化酶。
本实验还运用了几种酶活力测定方法，以资进行优劣探讨。
关键词：黑曲霉；液体通风发酵；糖化酶；酶活力 中图分类号：Q-331 文献标识码：B 一、前言（一）黑曲霉菌种特性 1．黑曲霉的分类地位黑曲霉在分类学上处于：真菌门、半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、丛梗孢科、曲霉属、黑曲霉群，拉丁学名：Aspergillus niger 。
2．黑曲霉形态、生理、生态特性孢子头呈暗黑色，菌丝体由具横隔的分枝菌丝构成，菌丝黑褐色，顶囊球形，小梗双层，分生孢子球形，平滑或粗糙。
一般进行无性生殖，其可育细胞称足细胞。
3．黑曲霉突变株的形态、生理、生态、特征 在查氏培养基上菌落曲型为炭黑色，有辐射沟纹，从菌落边缘向中心，分化为伸长部位，活性部位，成熟部位，老化部位几个区域即孢子萌发最早出现于中心部位是伸展部位，并逐渐形成密生部位，分生孢子部位，最后在中心出现的是成熟部位，菌落背面无色或稍黄。
（二）糖化酶的分类、地位、性质及用途 1．糖化酶在国际酶学委员会，在系统命名法中的地位糖化酶是淀粉酶，在系统命名法中属水解酶类。
2．糖化酶的性质糖化酶（glucamylase ）又名糖化型淀粉酶（glueoamylase ）或淀粉葡萄糖苷酶。
其系统名称为淀粉α1.4-葡萄聚糖水解酶。
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文章编号:1000-1573(2007)01-0055-05黑曲霉酸性β2甘露聚糖酶的纯化及部分性质研究朱 1, 李剑芳2, 邬敏辰1(1.江南大学医学系,江苏无锡214064;2.江南大学食品学院,江苏无锡214064)摘 要:黑曲霉(Aspergillus niger )WM20-11固态发酵成熟曲,经磷酸缓冲液浸提、硫酸铵分步盐析、DEAE -Sepharose fast flow 阴离子交换层析、Sephadex G -100凝胶过滤层析等分离纯化手段,最终获得了Native -PA GE 、SDS -PA GE 纯的酸性β2甘露聚糖酶组分,其纯化倍数为25108,收率为511%。
Sephadex G -100凝胶过滤层析和SDS -PA GE 测得纯酶的相对分子质量分别为39kD 和40kD ,表明该酶以单体形式存在;IEF -PA GE 测得该酶的等电点为4.0;含糖量测定为1916%;酶蛋白氨基酸组成中(Asp +G lu )/(Lys +Arg )为3174。
关 键 词:酸性β-甘露聚糖酶;黑曲霉;纯化;性质中图分类号:Q 556.2 文献标识码:AStudies on purif ication and some properties of the acidicβ2m annanase from Aspergillus nigerZH U Jie 1,LI Jian 2fang 2,WU Min 2chen 1(1.Department of Medicine ,S outhern Y angtze University ,Wuxi 214064,China ;2.School of Food Science ,S outhern Y angtze University ,Wuxi 214064,China )Abstract :The acidic β2mannanase from Aspergill us niger WM20211was purified by buffer extrac 2tion ,ammonium sulfate precipitation ,DEAE 2Sepharose fast flow and Sephadex G 2100column chromatographies.The purified enzyme was homogeneous on Native 2PA GE and SDS 2PA GE.After these steps the enzyme was purified by 251082fold with a recovery of 511%.Molecular weight of the β2mannanase was determined as 39kD on Sephadex G 2100gel filtration and 40kD on SDS 2PA GE ,which indicated that the β2mannanase was a monomer.The isoelectric point was estimated to be 410by IEF 2PA GE.Its carbohydrate content was 1916%.The ratio of (Asp +G lu )/(L ys +Arg )was 3174.K ey w ords :acidic β2mannanase ;Aspergill us niger ;purification ;propertiesβ2甘露聚糖酶(β2mannanases )通常指β2D 21,42内切甘露聚糖酶(EC 31211178),能特异性水解均一甘露聚糖和非均一甘露聚糖主链内部的β21,42D 2甘露糖苷键,广泛存在于微生物和动植物中[1]。
β2甘露聚糖酶可降解魔芋粉、角豆胶和瓜儿豆胶等可食性植物胶为甘露低聚糖,后者能显著促进人体肠道内以双歧杆菌和乳酸菌为代表的有益菌群的增殖,提高机体抗氧化能力[2],降低血糖和改善血液成分[3],以及降低血清总胆固醇和甘油三酯水平等[4]。
在饲料工业中,β2甘露聚糖酶可用作饲料添加剂,提高饲料的消化利用率及促进动物的生产性能。
在造纸、纺织、洗涤、石油开采和生物技术研究收稿日期:2006-06-20基金项目:江南大学校级科研项目(210000-52212052)作者简介:朱 (1969-),女,江苏无锡人,硕士,讲师,主要从事生物化学与分子生物学研究.通讯作者:邬敏辰(1962-),男,江苏无锡人,博士,副教授,硕士生导师,主要从事发酵工程与分子生物学研究.E 2mail :bioch @第30卷第1期2007年1月河北农业大学学报JOURNAL OF AGRICUL TURAL UNIVERSITY OF HEBEIVol.30No.1Jan .2007等诸多领域,β2甘露聚糖酶也有广泛的应用[5]。
本课题组从众多丝状真菌中选育了1株宇佐美曲霉和1株黑曲霉酸性β2甘露聚糖酶高产菌株,对其固态发酵条件进行了探索[1,6]。
本研究进一步分离纯化了黑曲霉WM20211固态发酵曲中的β2甘露聚糖酶组分,拟测定该纯酶的某些基本性质和化学组成,为该酶蛋白N末端氨基酸残基的测定、酶基因的克隆和高效表达奠定基础。
1 材料和方法1.1 菌株黑曲霉(Aspergill us niger)WM20-11酸性β2甘露聚糖酶高产菌株,由江南大学医学系分子生物学研究室选育和保存。
1.2 主要试剂DEAE2Sepharose fast flow,Sephadex G2100购自Pharmacia公司;SDS2PA GE低分子量标准蛋白,丙烯酰胺,N,N′2甲叉双丙烯酰胺,N,N,N′,N′2四甲基乙二胺,十二烷基磺酸钠,过硫酸铵均购自上海华美公司(进口分装);牛血清白蛋白,鸡卵白蛋白,胰蛋白酶购自上海伯奥公司;Ampholine(p H315～1010)为Amersham Bio2Sciences公司产品;角豆胶,甘露糖和细胞色素C购自Sigma公司;其他试剂均为国产分析纯。
1.3 主要仪器冷冻离心机(IEC MUL TI2RF);层析系统;分光光度计(WFZ8002D3B);垂直蛋白电泳系统(Mini2 PRO TEAN II);等电聚焦电泳仪(D YY212C);凝胶成像系统(Touching995);氨基酸自动分析仪(A GI2 L EN T1100)。
1.4 分离纯化步骤除特别注明外,分离纯化过程均在10℃以下进行;所用缓冲液均为pH710、0102m ol/L的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液(以下简称磷酸缓冲液)。
1.4.1 粗酶液制备 固态发酵曲用6倍体积磷酸缓冲液40℃振荡浸提30min,过滤收集第1次滤液;再用4倍体积缓冲液洗涤滤渣,过滤收集第2次滤液。
将第1、2次滤液合并,即为β2甘露聚糖酶粗酶液。
1.4.2 硫酸铵盐析 采用分步盐析法。
粗酶液中添加(N H4)2SO4至50%饱和度,4℃静置过夜,离心(4℃,8000r/min,20min),弃沉淀;上清液继续添加(N H4)2SO4至80%饱和度,4℃静置过夜,离心,沉淀备用。
1.4.3 第1次阴离子交换层析 将沉淀溶解、脱盐,对磷酸缓冲液透析,上样至已用磷酸缓冲液平衡的DEAE2Sepharose fast flow阴离子层析柱(116cm×30cm)上,阶段洗脱。
洗脱方式为:依次用含0115、0130和0145mol/L NaCl的磷酸缓冲液洗脱,流速014mL/min,部分收集(4mL/管),测定各管的β2甘露聚糖酶活性。
合并较高酶活性的收集液,透析,聚乙二醇20000浓缩。
1.4.4 第2次阴离子交换层析 将第1次阴离子分离的浓缩酶液再次上样至同一层析柱上。
洗脱方式为:依次用含0117、0125和0133mol/L NaCl的磷酸缓冲液洗脱,流速012mL/min,部分收集(2 mL/管),测定各管的β2甘露聚糖酶活性。
合并较高酶活性的收集液,透析,浓缩。
1.4.5 凝胶过滤层析 将第2次阴离子分离的浓缩酶上样至已用磷酸缓冲液平衡的Sephadex G2100凝胶层析柱(116cm×100cm)上,同一缓冲液洗脱,流速012mL/min,部分收集(2mL/管)。
合并较高酶活性的收集液,脱盐,浓缩或冷冻干燥。
获得的纯β2甘露聚糖酶样品,用于酶学性质、化学组成及N末端氨基酸残基的测定。
1.5 测定方法1.5.1 β2甘露聚糖酶活性测定 按文献[7]并略作改动。
于210mL510g/L角豆胶底物溶液(p H 418、011mol/L醋酸缓冲液配制)中加入015mL适当稀释的酶液,60℃反应10min;3,5-二硝基水杨酸显色法(DNS法)测定还原糖。
在上述条件下,以每分钟水解底物产生1μmol还原糖(以甘露糖计)的酶量为1个β2甘露聚糖酶单位(IU);比酶活性定义为每mL样品液或每mg蛋白中含有的酶活性单位数(IU/mL或IU/mg)。
1.5.2 蛋白质量浓度测定 参照Lowry等[8]的方法进行,以牛血清白蛋白为标准蛋白;在酶的分离纯化过程中,蛋白质量浓度以OD280值表示。
1.5.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳 Native2PAGE采用不连续垂直板电泳系统[8],分离胶和浓缩胶浓度分别为75g/L和30g/L;SDS2PAGE也采用不连续垂直板电泳系统[10],分离胶和浓缩胶浓度分别为120g/L和30g/L。
1.5.4 等电聚焦电泳 参照文献[11]的方法进行,等电聚焦电泳(IEF-PAGE)采用进口Ampholine(pH 315～1010)为两性电解质载体,胶浓度为54g/L。
电泳结束后,顺电场方向切下1～2道空白泳道,再按泳道垂直方向切成510mm等距离的小块,捣碎,用2mL三蒸水浸泡20min后测定p H值,绘制p H-距离(mm,离正极)标准曲线。
1.5.5 相对分子质量测定 分别采用Sephadex G2 100凝胶过滤和SDS-PA GE两种不同的相对分子质量测定体系。
前者测定的是全酶蛋白的相对分子质量,后者是酶蛋白亚基的相对分子质量。
65 河北农业大学学报第30卷1.5.6 糖含量测定 采用苯酚-硫酸法。
取1mL酶液置于具塞试管中,加入015mL 、体积分数6%的重蒸酚溶液,混匀后再加入316mL 浓硫酸,迅速混匀,室温放置20min ,于490nm 处测定吸光度,利用葡萄糖标准曲线查出相对应的糖量(以葡萄糖计),并折算成纯酶蛋白的糖含量(mg/mg )。
2 结果与分析2.1 分离纯化过程2.1.1 阴离子交换层析 2次阴离子交换层析的洗脱和酶活性分布曲线分别见图1和图2。