黑曲霉酸性蛋白酶液态发酵实验
新型黑曲霉液体发酵及对黄曲霉毒素B1的脱除
新型黑曲霉液体发酵及对黄曲霉毒素B1的脱除张晓雪;孙秀兰;张银志【期刊名称】《食品与生物技术学报》【年(卷),期】2017(036)003【摘要】对经紫外照射诱变制备的新型黑曲霉FS-UV1在马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)中的pH、蛋白质质量浓度、蛋白酶活性变化以及脱除机制进行了研究.在发酵过程中,pH值不断下降,由初始pH 5.9下降为1.83.蛋白质质量浓度在发酵48 h后达到最大,为10.07 g/L,而酸性蛋白酶活性则在72 h达到最高,为0.98 U/mL.新型黑曲霉FS-UV1孢子悬液对AFB1无脱除效果,而菌丝体对AFB1具有吸附作用,发酵液则对AFB1具有降解作用,其中发挥降解作用的可能是蛋白质.对FS-UV1在pH 7的模拟肠道环境中脱除黄曲霉毒素B1(AFB1)的效果进行了评价.脱除48 h 时,在pH 7的模拟肠道环境中对AFB1的脱除率为87.3％.【总页数】5页(P266-270)【作者】张晓雪;孙秀兰;张银志【作者单位】江南大学食品学院,江苏无锡214122;江南大学食品学院,江苏无锡214122;食品科学与技术国家重点实验室,江南大学,江苏无锡214122【正文语种】中文【中图分类】IS201.3【相关文献】1.发酵工艺条件对黑曲霉产黄曲霉毒素B1降解酶的影响 [J], 雷娇;宋宏新;李鹏娟;薛海燕;肖瑜;徐丹2.黑曲霉菌降解黄曲霉毒素B1的影响因素的研究 [J], 陈志辉;徐馨;李仲玉;程宝晶3.饲料发酵耦合黄曲霉毒素B1的生物脱除方法研究 [J], 李加友;褚云峰;陆筑凤;苗圣威;李俊峰;杨青4.响应面优化黑曲霉生物发酵花生粕脱除黄曲霉毒素研究 [J], 邱天宇;王海鸣;朱瑜;杨阳;纪剑;孙秀兰5.黑曲霉降解黄曲霉毒素B1的研究及转录组分析 [J], 杨阳;邱天宇;袁晓;孙嘉笛;张银志;孙秀兰;纪剑因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
黑曲霉产糖化酶液态发酵条件研究
黑曲霉产糖化酶液态发酵条件研究孙继祥【摘要】The effects of additives,feeding time and feeding quantity on Saccharifying enzyme production by Aspergillus niger fermentation were investigated throug single factor test with the activity of Saccharifying enzyme as indicator.Then the effects of fermentation conditions on Saccharifying enzyme production were investigated by orthogonal experiments.The results suggested that the addition of（NH4） 2SO4 could enhance 17 % enzyme activity,the optimum feeding time was 48h,the best feeding quantity was 6 mL,feeding could prolong fermenting cycle from previous 96 h to 120 h,and the optimum fermentation conditions were 15 % inoculating quantity,50 mL liquid-filling in 250 mL triangle flask,and initial pH value as 4.5.%以糖化酶活力为指标,通过单因素实验,分别考察了添加物、补料时间和补料量对黑曲霉发酵产糖化酶的影响。
通过正交实验,考察了发酵条件对黑曲霉发酵产酶的影响。
1 冯东阳 黑曲霉的培养
黑曲霉的培养一、实验简介黑曲霉广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中。
是重要的发酵工业菌种，可生产淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、葡糖酸和没食子酸等。
生长适温37℃，最低相对湿度为88%。
从土壤中获取菌种，接种到查氏培养基中进行培养。
二、实验试剂和材料1、试剂碳酸钠3g磷酸二氢钾硫酸镁1g氯化钾0.5g硫酸亚铁0.01g蔗糖30g蒸馏水1000ml2、器材培养皿、试管、灭菌锅、三角瓶三、实验过程和步骤（一）、查氏培养基配制1 称量：按照培养基配方，依次准确地称取药品，放入搪瓷杯中。
2 熔化：量取自来水，加入所需水量的一部分至上述搪瓷杯中，用玻璃棒搅拌，待药品溶解后，加入琼脂，倒入余下的水，在电热板上加热熔化。
3定容：将加热后的培养基导入量筒中，用自来水进行定容，至1000ml。
4 调pH：待培养基稍冷却后，用精密pH试纸测量培养基的原始pH，若偏酸，用1mol/L NaOH边滴加边搅拌，使之达到pH5.0-6.0。
若偏碱，则用1mol/L HCl调节。
5 分装：用分装装置将培养基装入试管，高度为试管总长的1/5，共20支。
余下培养基转入三角瓶中，培养基的量为三角瓶容量的1/3-1/2。
6 加塞、包扎、标记：试管加棉花塞，5支一捆包扎好，棉塞外加一层报纸防灭菌时冷凝水湿润棉塞，在外用线绳扎成活结，；三角瓶用纱布塞住瓶口，并用牛皮纸的线绳包扎好。
用记号笔注明培养基名称、班级、组别、配制日期。
7 灭菌：0.1MPa，121℃，20min高压蒸汽灭菌。
8 搁置斜面：待已灭菌的试管培养基冷却至50℃左右，将试管口端搁置在有合适高度的器具上，使培养基斜面长度不超过试管总长的一半为宜。
9 倒平板：待三角瓶中培养基冷却至50℃左右，倒平板。
10 无菌检查：灭菌培养基放入37℃培养箱中一天，若无细菌污染则说明灭菌彻底。
（三）、接种培养将配置好的土壤悬液10ml接种到装有查氏培养基60ml的锥形瓶中，在恒温培养箱中静置培养6-7天（23～28℃培养），观察培养结果。
一株高产酸性蛋白酶的黑曲霉菌株及其液体发酵产酶方法[发明专利]
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(10)申请公布号(43)申请公布日 (21)申请号 201510677600.6(22)申请日 2015.10.19CGMCC No.10789 2015.05.07C12N 1/14(2006.01)C12N 9/62(2006.01)C12R 1/685(2006.01)(71)申请人山东隆科特酶制剂有限公司地址276499 山东省临沂市沂水县城北工业园(72)发明人王兴吉 韩龙 张杰(54)发明名称一株高产酸性蛋白酶的黑曲霉菌株及其液体发酵产酶方法(57)摘要本发明公布了一株高产酸性蛋白酶的黑曲霉突变株及其液体发酵方法，所述黑曲霉突变菌株为黑曲霉(Aspergillus niger)TP-235，保藏编号为CGMCC 10789，该菌株通过液体深层发酵在50L发酵罐上经补料发酵培养100-120h，产酶水平为21852u/mL。
本发明建立的液态发酵酸性蛋白酶的方法，生产的酸性蛋白酶最适pH 范围为2.5-3.5，最适作用温度范围为55℃-65℃，在60℃保温1h后剩余酶活为78％，80℃保温2h 后剩余酶活为58.4％，具有良好的耐酸性和耐热性，可广泛应用于酿酒、食品、饲料以及皮革加工等行业。
(83)生物保藏信息(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书6页 附图1页CN 105199969 A 2015.12.30C N 105199969A1.一株高产酸性蛋白酶的黑曲霉突变菌株，其特征在于，所述菌株具体为黑曲霉(Aspergillus niger)TP-235，菌株保藏号为CGMCC 10789。
2.如权利要求1所述的一株高产酸性蛋白酶的黑曲霉突变菌株，其特征在于，所述菌株液体发酵平均产酸性蛋白酶活为21800u/mL-21900u/ml。
3.如权利要求1所述的一株高产酸性蛋白酶的黑曲霉突变菌株，其特征在于，所述菌株液体发酵产酸性蛋白酶最适作用pH范围为2.5-3.5，最适作用温度范围为55℃-65℃。
黑曲霉植酸酶液体发酵工艺研究
第14卷第3期武汉科技学院学报Vo1.14No.3 2001年9月JOURNAL OF WUHAN INS TITUTE OF SCIE NCE AND TECHNOLOGY Sep.2001黑曲霉植酸酶液体发酵工艺研究王亚林严建芳(武汉工业学院生物与化学工程系武汉430022)摘要研究了黑曲霉液体培养生产植酸酶的发酵工艺,研究了培养基碳源、诱导物、表面活性剂等因素对产酶的影响,对发酵时间、p H变化规律等进行了研究和分析。
关键词植酸酶黑曲霉发酵X中图分类号Q815;Q814.9植酸酶作为一种饲料和食品添加剂,在国内外已开始得到广泛应用,特别是由于其在改善环境方面的作用,更是受到人们的极大关注。
植酸酶主要存在于植物及微生物中,由于在微生物中含量较高而具有较大的开发价值。
目前,美国、荷兰和丹麦等国已先后运用发酵法生产植酸酶,我国也已在进行这方面的研究开发。
可以预计,植酸酶制剂将有良好的市场前景。
1材料与方法1.1菌种黑曲霉(Aspergillus niger)W S201,武汉工业学院微生物室保存。
1.2培养基1.2.1种子培养基:豆芽汁蔗糖培养基。
1.2.2摇瓶发酵培养基(%):葡萄糖3.0,淀粉7.0,NH4NO30.5,蛋白胨0.2,CaCl20.2,MgSO4# 7H2O0.05,KCl0.05,MnSO4.4;H2O0.03,pH值5.5。
1.3培养方法配制培养基时适当加热、摇动或搅拌,使淀粉溶解成液态或胶状,121e灭菌20min。
在30?1e下摇床培养3~5d(转速220~250r/min)。
1.4植酸酶的测定植酸酶活力的定义:37e,pH5.5条件下每分钟从植酸钠中释放出1L mol无机磷所需的酶为1u。
酶活测定方法:取0.1ml含酶液加至一洁净试管中;加入0.9ml反应液,反应液为含0.5%植酸钠的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH5.5),在37e恒温反应30min;加入1ml10%三氯醋酸终止反应;加入2ml显色液,摇匀后静置15~30min显色,显色液由1%钼酸铵50ml与3.66X收稿日期:2001-06-26作者简介:王亚林,男,副教授,在读博士生;研究方向:发酵工程、生化工程32武汉科技学院学报2001年g FeSO4#7H2O混合配制。
泸型大曲黑曲霉产酸性蛋白酶条件的优化及其酶学性质的研究
ａ ｉ ｒ ｔａ ｅ ｒ ａ ｈ ｄ ｔ ４ ５ Ｕ ｇ ．ｗｈ ｃ ｓ ｉ ｃ ｅ ｓ ｄ ｂ ．％ ａ ｅ ｐ ｉ ｚ ｄ Ｔ ｅ ｅ ｚ ｍａ ｉ ｐ ｏ ｅ ｉ ｓ ｗａ ｌｏ ｃ ｄ ｐ ｏｅ ｓ ｅ ｃ ｅ ｏ ２ ３ ０ ／ ｉ ｈ ｗａ ｎ ｒ ａ ｅ ｙ ６ ６ ４ ｔ ｆ ｒｏ ｔ ｍｉｅ ． ｈ ｎ ｙ ｔ ｒｐ ｒ ｅ ｓ ａ ｓ ｃ ｔ ｓ ｄ ｅ ．ｈ ｎ ｙ ｃｅ ｐ ｉ ｌ ｔ ５ ， Ｈ３ ５， ｎ ｓｓａ ｌ ｅｏ ０ ． ， ， ａ Ｆ ｉ ｃ ｅ ｓ ｄ ｔ ｅ ａ ｔ ｉ ｏ ｔ ｉ ｄＴ ｅ ｅ ｚ ｍｅ ａ ｔ ｄ ｏ ｔ ｕ ｍａｌ ａ ％ ｐ ． ａ ｄ ｗａ ｔ ｂ ｅ ｂ ｌｗ ５ ％ Ｃｕ Ｋ Ｃ ， ｅ ｎ ｒ ａ ｅ ｈ ｃ ｉ ｔ ｔ ｙ ５ ｖｙ ｓ ｍｅ ｅ ｔｎ ｈ ｎ ｃ ｎ ｅ ｔ ｔ ｎ ｉ ２ ｏ ｘｅ ｔｗ ｅ ｏ ｃ ｎ ｒ ｉ ｓ ｍｍｏ ／Ｌ， ｉ ｈ ｃ ｉｉ ｆ ａ ｉ ｒ ｔａ ｅ ｗａ ｅ ｒ ａ ｅ ｆ ｒ ａ ｄ ｎ ｅ ， ｅ ， ａｏ Ｌ ｗｈｌ ｔ ｅ ａ ｔ ｔ ｏ ｃｄ ｐ ｏｅ ｓ ｓ ｄ ｃ ｅ ｓ ｄ ａ ｔ ｄ ｉ ｇ Ｆ “ Ｆ “ ｅ ｖｙ ｅ
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黑曲霉的紫外诱变及酸性蛋白酶缺陷株的选育
１３ 培养条件 ．
将孢子菌悬液按体积分数 ０ １ ．０的接种量 ， 接种到发酵培养基中，Ｏ℃转速为 １０ｒｍｎ ３ ５ ｉ 的条件下 ／ 培养 ７ｄ 离心收集上清液 ， ， 既为粗酶液 。
基金项 目： 秦皇岛市科学技术研究与发展计划项目（ 项目编号： １０Ａ ７ ） ２ １１ １６ 。 ０
中图分类号 ： ９ ３ Ｑ ３ 文献标志码 ： Ａ 文章编号 ：６２７ ８ （ ０ ２ ０ －０２０ １７ － ３ ２ １ ） １ ７ － ９ ０ ５
黑曲霉产酶发酵的历史十分悠久 ， 可用于生产淀粉酶 、 眭蛋 白酶、 酸 纤维素酶、 果胶酶 、 柠檬酸、 没食 子酸等多种酶制剂和食用酸， 是公认的可用于食品生产的高安全 性真菌 【 。此外 ， 曲霉在生物工程 ｌ 】 黑
，
要作用 。目前 ， Ｊ 已采用基 因重组技术从 大肠杆菌 中提取该 酶 ， 由于大肠杆菌表达水平低、 但 提取 困 难， 使其实际应用受到限制 。而黑 曲霉 的 ｐ葡萄糖苷酶基 因表达水平较高 ， 一 利用黑 曲霉作为其生产
菌株有突出优势。研究表 明， 黑曲霉产生的胞外蛋白酶能降解外源基因所表 达的蛋 白， 使表达产物不能 积 累。为使黑曲霉表达异源 ｐ葡萄糖苷酶的效果更好 ， － 必须在不改变蛋 白质外泌能力 的前提下 ， 使其 胞外蛋 白酶活性缺失 【 。本实验 旨在通过紫外诱变方法筛选酸性蛋白酶缺失 ， Ｂ葡萄糖苷酶活性基 ８ Ｊ 而 －
收稿 日期 ： ０ ２Ｏ －９ ２ １－２０
１ 期
刘 畅等
黑 曲霉 的紫外诱 变及酸性蛋 白酶缺陷株 的选育
１ ４ 紫外 诱变 条 件 的筛 选 ．
黑 曲霉经固体斜面培养后 ， 用无菌水洗下新鲜孢子 ， 制成孢子悬浮液 ， 用灭菌吸管吸取 １ Ｌ 孢子 ０ｍ （ 数量为 １ １ｍ Ｌ 于培养皿中， １ 紫外灯下照射 ， Ｏ ～ Ｏ 个／ ） 于 ５ｗ 停止照射后涂布平板 ， 用锡箔纸包裹平板 ， 完全避光 ２ ， ４ｈ 后拆开锡箔纸再培养 ４ ， ８ｈ 计算致死率 。通过改变紫外照射时间、 Ｊ 照射距离和孢子悬 液的浓度 ， 选择最适 的诱变条件 。 １ ５ 酸 性 蛋 白酶缺 陷菌 株 的筛选 ． １５ １ 平板初筛 将诱变后 的黑 曲霉孢子涂布于酪蛋 白平板和 ｐ葡萄糖苷酶筛选平板 ， ．． － ３ Ｏ℃培养 ４ ８
酸性蛋白酶实验方案
酸性蛋白酶降解猪瘦肉肉实验方案一、实验目的①购得黑曲霉发酵生产的酸性蛋白酶，并在其最适条件下进行研究②研究该酸性蛋白酶降解瘦肉的降解肉类效果、对酵母生长的影响。
③根据实验前后的含氮量，研究该酸性蛋白酶对瘦肉的降解度二、实验原理①酸性蛋白酶特性：活力定义：一个酶活力指1g酶粉成1ml酶液在40℃.PH3.0条件下，1分钟水解酪素产生1ug酪氨酸为一个活力单位（u/g或u/ml）pH范围：2.5～4.0（最适PH3.5）最适温度：55℃，低于40℃稳定性状：褐色或灰色粉末，由黑曲霉经发酵提炼而成而成，易溶于水用途：生化研究。
水解蛋白, 具有较强的水解能力能力，能将大分子的蛋白质水解成氨基酸等②水解度(DH)的计算公式:DH( %)) =水解液中总氨基态氮/原料中总氮含量[1]③凯氏定氮法测总氮：凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。
即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气馏出并为过量的酸液吸收，再以标准碱滴定，就可计算出样品中的氮量。
三、实验试剂和仪器①实验试剂：新鲜瘦猪肉(市售) ；酸性蛋白酶(5. 0×105IU/ g) (广州市凯升生物有限公司)、凯氏定氮法相关试剂②实验仪器：凯氏定氮蒸馏装置,雷磁酸度计,恒温水浴锅,电子天平、电磁炉四、实验方法①新鲜猪瘦肉预处理从市场上购得猪肉，清水洗净后，用小刀精心除去脂肪，将猪肉用自来水冲洗，去血1h后，冷冻保藏，一段时间后取出并切成块状，然后经高压灭菌灭菌，用无菌水冲洗，放置冰箱冷冻备用[3]。
②猪肉酶解工艺流程猪肉糜(经预处理) →配制pH3.5的柠檬酸缓冲液→按固液比（m/V）1：1匀浆[1、3]→加酶保温酶解→100℃灭酶15min→4500r/min离心 15min→上清液过滤→猪肉蛋白酶解液[3]③单因素实验组别设置在酶解时间5h、 pH3.5条件下实验，设置一个不加入酶的空白对照，每组设置3组平行对照：＊温度条件：55℃、30℃＊酶液加入量：按3%（M/M）（酶：底物）加入量[1]＊酵母培养：加入蛋白酶按6.5U/mL（酶：培养基）比例、不加蛋白酶对照进行液体培养猪瘦肉用量：每组15g，共8组，共120g。
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2014级生物工程专业实验(II)
黑曲霉液态发酵生产酸性蛋白酶
一、实验目的
掌握液态耗氧发酵的一般工艺，熟悉机械搅拌发酵罐及相关设备的原理和使用。
二、实验材料
2.1菌株
黑曲霉Aspergillus niger SZ-357，由发酵与酶工程研究室分离。
2.2 实验试剂
糊精、酵母膏、氯化铵、磷酸二氢钾、CaCl2、酪蛋白、酪氨酸、20%三氯乙酸，3,5-二硝基水杨酸(DNS)。
2.3实验设备
DHP-9082电热恒温培养箱；2112型恒温摇床；GL-20G-II高速冷冻离心机；BIOTECH-5BG发酵罐，静音无油空气压缩机、BILON-T-501低温冷却液循环系统；722S型分光光度仪；SW-CJ-2FD型净化工作台；HZS-H 超级恒温水浴锅；Sartorius分析天平。
三、角蛋白酶液态发酵实验
3.1工艺流程
3.2培养基及培养条件
3.2.1种子培养基及培养条件
（1）液体种子培养基及培养条件：糊精1%，酵母膏4%，氯化铵3%，KH2PO4 0.03%，CaCl2 0.5%，pH7.0，121o C灭菌15 min。
将斜面菌种接种于含有100 mL 种子培养液的500 mL三角摇瓶中，在34o C，180r/min的恒温摇床中振荡培养24 h。
(2)麸皮固体种子培养基及培养条件：将斜面菌种接种于含水90%的麸皮固体培养基中，34o C，静置培养72 h，取出麸皮种子40 o C烘干备用。
3.2.2发酵培养基及培养方法
发酵培养基：糊精1%，酵母膏4%，氯化铵3%，KH2PO40.03%，CaCl2 0.5%，pH7.0。
培养基121o C灭菌20 min，将种子液按5%（麸皮种子按3‰）的接种量接种于发酵罐中，在34o C，500 r/min的条件下发酵72 h。
3.3 检测方法
3.3.1菌体浓度的测定
干重法。
3.3.2还原糖的测定
采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定发酵液中还原糖含量。
(1) 标准曲线的绘制：配制1.0 mg/mL葡萄糖标准溶液，取9支洁净的25 mL比色管编号，按表1加入试剂。
向9支比色管中加入0.5 mL DNS，摇匀，于沸水浴中加热5 min，取出置于自来水中冷却，加入4 mL蒸馏水，以管“1”为空白在540 nm波长处测定OD值。
以浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线。
(2)发酵液中还原糖含量的测定：取0.5 mL 待测样于比色管中，再加入0.5 mL DNS；在沸水浴中加热5 min，然后冷却；最后加入4 mL蒸馏水，540 nm下测定OD值。
结合标准曲线计算发酵液中还原糖含量。
表1 葡萄糖标准曲线的制作
管号葡萄糖溶液/mL 蒸馏水/mL 最终浓度/(mg/mL)
1 0 0.5 0
2 0.05 0.45 0.1
3 0.1 0.
4 0.2
4 0.1
5 0.35 0.3
5 0.2 0.3 0.4
6 0.25 0.25 0.5
7 0.3 0.2 0.6
8 0.35 0.15 0.7
9 0.4 0.1 0.8
3.3.3酸性蛋白酶活力的测定
Folin-酚法。
16周实验日程安排
1、6.11日（周日）
种子培养基的准备
（1）固体麸皮种子：实验室研究生事先准备
（2）液体种子：周日9:00接种，研究生事先准备。
2、6.12日（周一）
（1）下午14:30：实验准备、种子培养基、发酵培养基的配制
（2）发酵罐操作、电极校正现场培训(第一组15:30；第二组16:30)
3、6.13 日（周二）
（1）9:00 发酵罐接种培养(两组同时进行)
（2）安排同学值班，每8 h取样一次
（3）大肠杆菌质粒提取、酶切、电泳
3、6.14日（周三）
（1）取样分析检测各项指标
（2）安排同学值班
4、6.15日（周四）
（1）取样分析检测各项指标
（2）安排同学值班、测酶活试剂准备
5、6.16日（周五）
（1）9:00 上罐结束，完成清洁卫生
（2）完成发酵各项参数的测定
需要准备的材料：
1.种子培养基：液体，4瓶（50mL/500mL）；固体，25g(干重)
2.发酵培养基：
3.5 L
3.发酵罐灭菌、电极校正：牛皮纸、棉线、无水亚硫酸钠、pH缓冲液、打火机、
酒精、相关药品试剂等。
组长：联系电话：小组成员：
4
组长：联系电话：小组成员：
5。