细胞凋亡的流式细胞术检测
检测细胞凋亡的三种流式方法
检测细胞凋亡的三种流式方法细胞凋亡（apoptosis）是细胞自主性死亡的过程，是正常细胞发育和组织调控的重要途径。
为了研究细胞凋亡的机制和调控，科学家们发展出了许多方法来检测和定量细胞凋亡的发生。
其中流式细胞术（flow cytometry）是最常用的方法之一，根据不同的细胞特征和所需信息，可以有多种方法用于检测细胞凋亡。
下面将介绍三种常用的流式细胞术方法。
1. 荧光标记的Annexin V/PI双染法：Annexin V是一种细胞外结合蛋白，具有高度特异性结合细胞凋亡的特点。
当细胞凋亡发生时，磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞内翻转至细胞外，而Annexin V能够结合在PS上。
Propidium Iodide（PI）能够穿过损伤的细胞膜，结合到细胞核内的DNA分子上。
通过将Annexin V标记为绿色荧光染料，将PI标记为红色荧光染料，通过流式细胞术定量测量荧光信号的强度，可以区分出未凋亡细胞（Annexin V和PI双阴性），早期凋亡细胞（Annexin V阳性，PI阴性），晚期凋亡和坏死细胞（Annexin V和PI双阳性）等不同状态的细胞。
2.荧光标记的DNA碎片染色法：3. 荧光标记的Caspase活性检测法：Caspases是细胞凋亡过程中的关键酶，它们在给定的信号下被激活并参与调节细胞凋亡的执行阶段。
通过使用荧光标记的Caspase底物，如FLICA系列（Fluorochrome Inhibitor of Caspases）、CaspGLOW系列（Caspase-Glo Kits），可以测量细胞中Caspase的活性。
这些底物在被Caspase酶剪切后会释放出荧光信号，通过流式细胞技术可以测量荧光信号的强度。
由于Caspase活性与细胞凋亡过程密切相关，因此可以利用这些荧光标记底物来定量测量细胞凋亡的发生。
总结起来，流式细胞术是一种非常有效的方法用于检测细胞凋亡的发生。
Annexin V/PI双染法可以定量测量不同状态的细胞，DNA碎片染色法可以测量细胞凋亡的程度，荧光标记的Caspase活性检测法可以测量细胞中Caspase的活性。
细胞凋亡检测技术
细胞凋亡检测技术嘿，朋友们！今天咱来聊聊细胞凋亡检测技术。
这玩意儿啊，就好像是细胞世界里的“侦探”，专门去探寻那些凋亡的细胞呢！你想想看，细胞们就像一个小小的社会，有生老病死。
而细胞凋亡呢，就是这个社会里的一种自然现象，就如同我们人类会衰老死亡一样。
那怎么才能知道哪些细胞凋亡了呢？这就需要我们的细胞凋亡检测技术出马啦！比如说有一种检测方法叫流式细胞术，它就像一个超级敏锐的“眼睛”，能快速地把凋亡的细胞给识别出来。
它通过给细胞们染上特定的颜色，然后根据细胞发出的信号来判断它们的状态。
是不是很神奇呢？这就好比在一群人里，一下子就能找出那些身体不舒服的人。
还有啊，TUNEL 法也很厉害呢！它就像是一个精准的“定位仪”，能专门找到那些已经开始凋亡的细胞的 DNA 断裂点。
这就像是能在茫茫人海中，准确找到那个掉了东西的人一样。
那这些检测技术有啥用呢？用处可大啦！医生们可以用它们来诊断疾病呢。
比如说癌症，癌细胞有时候会通过凋亡来逃避治疗，那如果我们能早早地检测到这些凋亡的癌细胞，不就能更好地制定治疗方案了吗？这就好像我们知道了小偷会从哪个地方逃走，提前在那里设下陷阱一样。
而且啊，在科学研究中，细胞凋亡检测技术也是不可或缺的呢！研究人员可以通过它来了解细胞的生命活动规律，探索各种药物对细胞的影响。
这就像是在探索一个神秘的世界，一点点地揭开它的面纱。
你说，要是没有这些检测技术，我们对细胞的了解岂不是会少很多？那我们怎么能更好地保护我们自己的身体，怎么能更好地治疗那些可怕的疾病呢？总之啊，细胞凋亡检测技术就像是一把打开细胞奥秘之门的钥匙，让我们能更深入地了解细胞的世界。
它让我们知道，每一个小小的细胞都有着自己的故事，都值得我们去探索和研究。
所以啊，可别小看了这些技术哦，它们可是在默默地为我们的健康和科学进步做着巨大的贡献呢！。
《细胞实验》13 流式细胞仪检测细胞凋亡操作流程
流式检测细胞凋亡Annexin V 检测细胞凋亡 (2)实验原理 (2)实验用品 (2)操作步骤 (3)Annexin V Blocking (5)凋亡细胞的DNA 断裂片段分析 (7)实验原理 (7)实验用品 (8)操作步骤 (9)BrdU Flow Kits 检测细胞增殖 (12)实验原理 (12)BrdU Flow Kits 试剂盒 (12)结果分析 (17)流式仪器设置指南 (18)线粒体膜电位变化检测细胞凋亡 (22)实验原理 (22)实验用品 (22)样本制备 (23)结果分析 (24)注意事项 (24)Active Caspase-3 检测细胞凋亡 (26)实验原理 (26)实验步骤 (27)结果分析 (28)Annexin V 检测细胞凋亡实验原理Annexin V 是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。
它是一种磷脂结合蛋白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。
在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸(PS) 由质膜内侧翻向外侧。
Annexin V 与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。
由于在发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变，因此，与DNA 碎片检测比较，使用Annexin V 可以更早地检测到凋亡细胞。
因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻，所以Annexin V 常与鉴定细胞死活的核酸染料(如PI 或7-AAD)合并使用，来区分凋亡细胞(Annexin V+/核酸染料-)与死亡细胞(Annexin V+/核酸染料+)。
实验用品1. 一次性12×75mm Falcon试管。
2. PBS缓冲液：含0.1%NaN ，过滤后2-8°C保存。
33. 微量加样器和加样头。
4. Annexin V Binding Buffer缓冲液（Cat. No. 66121E）：浓度为10×，使用时，用稀释为1×浓度的应用液。
实验九流式细胞术分析细胞凋亡和细胞周期时相
发光源，激发波长为488nm，测定数据输入计算机，用Multicycle软件分析细 胞DNA含量。
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五、实验结果
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五、实验结果
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五、实验结果
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二、实验原理（continued）
● 流式细胞术（FCM，Flow Cytometry）：是对单个 细胞或其他生物微粒进行快速定性, 定量分析与分选 的一门技术。
● FCM是利用流式细胞仪(Flow Cytometer)分析在高压 高速下通过样品孔径的单个细胞, 在激光束的照射下 的发出的散射光和与细胞表面结合的荧光标记的单抗 的荧光信号。
实验九 流式细胞术分析细胞凋亡和 细胞周期时相
杭州师范大学 刘姬艳
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一、实验目的
1、了解流式细胞术（FCM，Flow 了解流式细胞术分析细胞凋亡的检测方法。 3、了解流式细胞术分析细胞群体DNA含量分布
的基本方法。
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二、实验原理
● 细胞凋亡(Apoptosis)是指细胞基因调控的一种自主性 的自杀现象。或者说在一定的生理或病理条件下，细 胞遵循自身的程序，自我结束生命的死亡方式。由于 这种死亡方式是由基因调控的死亡过程，因此又称之 为程序性细胞死亡(Programmed Cell Death)。
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二、实验原理（continued）
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二、实验原理（continued）
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二、实验原理（continued）
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二、实验原理（continued）
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二、实验原理（continued）
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凋亡流式检测步骤
凋亡流式检测步骤凋亡是细胞生命的一个重要过程，它在生物体的正常发育和维持内稳态中起着关键作用。
凋亡的流式检测是一种常用的实验方法，通过分析细胞的染色性质和形态特征，可以快速准确地检测细胞的凋亡状态。
下面将介绍凋亡流式检测的具体步骤。
一、细胞样本的准备1. 收集需要检测的细胞样本，可以是细胞培养物或组织样本。
2. 用无菌PBS缓冲液洗涤细胞样本，去除培养基或组织液中的杂质。
3. 用离心机将细胞沉淀下来，去除上清液。
二、细胞的染色1. 用无菌PBS缓冲液重新悬浮细胞，使细胞浓度达到合适的浓度。
2. 加入适量的凋亡检测染料，常用的染料有Annexin V和PI。
3. 在室温下孵育一定时间，使染色剂与细胞充分反应。
三、流式细胞仪的设置1. 打开流式细胞仪，进行仪器的预热和校准。
2. 根据染色的荧光信号选择相应的检测通道，并设置适当的增益和门控。
3. 将已染色的细胞样本加入流式细胞仪的样本管中。
四、数据采集与分析1. 开始流式细胞仪的运行，以恒定的速度将细胞样本通过激光束。
2. 细胞在激光束中逐个通过，激光照射下的细胞会发出特定的荧光信号。
3. 流式细胞仪会记录下每个细胞的荧光信号，并将其转化为数字信号。
4. 利用流式细胞仪软件对采集到的数据进行分析和统计。
5. 根据细胞的荧光强度和染色的特征，可以判断细胞的凋亡状态。
通过以上步骤，我们可以快速准确地检测细胞的凋亡状态。
凋亡流式检测的优点是可以同时检测大量的细胞，具有高通量和高灵敏度的特点。
它在细胞生物学、免疫学和药物研发等领域都有广泛的应用。
值得注意的是，凋亡流式检测中的染色剂选择和流式细胞仪的设置对结果的准确性和可靠性有重要影响。
因此，在进行凋亡流式检测之前，需要仔细选择适合的染色剂和校准流式细胞仪。
同时，对于不同类型的细胞和凋亡机制，可能需要针对性地进行优化和调整。
凋亡流式检测是一种重要的实验方法，可以快速准确地检测细胞的凋亡状态。
通过合理的样本准备、细胞染色、仪器设置和数据分析，可以获得可靠的实验结果。
凋亡细胞线粒体膜电位的流式细胞术分析
凋亡细胞线粒体膜电位的流式细胞术分析细胞的凋亡是一个复杂的过程，由多种信号通路和调控机制共同参与控制和调节。
细胞凋亡过程可以在细胞内部可见到，特别是细胞膜电位变化。
因此，通过细胞膜电位变化分析凋亡细胞是非常重要的。
研究表明，在细胞凋亡过程中，线粒体膜电位的变化是最具代表性的指标。
线粒体膜电位的变化是细胞凋亡的重要指标，但是由于耗时且复杂的实验操作，传统的细胞膜电位测定方法很难满足测量细胞凋亡的高精度需求。
因此，开发出高精度定量分析凋亡细胞线粒体膜电位的快速有效的细胞测定方法，具有重要的意义。
随着流式细胞术在生物医学研究中的广泛应用，它被用于在线监测细胞凋亡，特别是线粒体膜电位的变化，这受到了研究者的欢迎。
在流式细胞术检测凋亡细胞的线粒体膜电位变化，可以帮助研究者快速、高准确度的定量分析测定凋亡细胞的线粒体膜电位变化，以更深入地了解凋亡细胞的特性和分子机制。
流式细胞术指的是一种在一个流程中对活细胞进行定量分析的技术，其基本原理是通过使用流体力学和电磁学原理，在特定流动媒介中利用物理和化学效应引起细胞分散和微粒聚集，从而使细胞形成信号模板和聚集，最终实现细胞的定量分析。
在分析凋亡细胞线粒体膜电位变化的过程中，研究者可以采用流式细胞术分析细胞凋亡线粒体膜电位变化的程度。
流式细胞术分析凋亡细胞线粒体膜电位变化的具体过程是这样的：首先，样本中的细胞被收集到流式细胞检测仪中，然后将细胞悬浮液以规定的流量经芯片中的微管流动。
当细胞在芯片上流动时，不同类型的钠离子对细胞的线粒体膜电位产生影响，从而形成不同的悬浮液浓度和电阻模式，研究者可以通过流式细胞检测仪中的电阻模式识别凋亡细胞，定量分析凋亡细胞的线粒体膜电位变化。
在流式细胞术分析凋亡细胞线粒体膜电位变化时，可以用到更加先进技术，如利用标记技术对凋亡细胞中特定蛋白质的表达水平进行检测，从而更好地理解凋亡细胞的特性。
此外，研究者还可以利用其他细胞定量分析技术，例如荧光素酶报告技术，以及改良的激光共聚焦显微镜和细胞免疫荧光技术，进一步深入研究凋亡细胞的分子机制。
annexin v-fitc细胞凋亡检测原理
annexin v-fitc细胞凋亡检测原理Annexin V-FITC（荧光素I同型体）细胞凋亡检测是一种常用的流式细胞术，用于检测细胞凋亡的早期事件。
该方法基于细胞表面的磷脂酰丝氨酸（PS）的外露，这是许多凋亡细胞的特征之一。
Annexin V是一种结合于PS上的蛋白质，它与FITC标记结合后，可以通过流式细胞仪检测到荧光信号。
以下是Annexin V-FITC细胞凋亡检测的基本原理：1.PS外露：在细胞凋亡过程中，磷脂酰丝氨酸（PS）会从细胞内层翻转到胞外层，暴露在细胞表面。
这一步骤是凋亡的早期事件之一，通常在细胞膜破裂之前发生。
2.Annexin V的结合：Annexin V是一种蛋白质，具有高亲和力与PS结合。
在细胞表面的PS外露后，Annexin V能够结合到PS上形成Annexin V-PS复合物。
3.FITC标记：Annexin V-FITC是一种带有荧光素I同型体（FITC）标记的Annexin V。
FITC是一种荧光标记，可以通过流式细胞仪检测。
4.流式细胞仪检测：经过Annexin V-FITC标记的细胞在流式细胞仪中被激发，FITC会发出荧光信号。
通过检测FITC的荧光信号，可以识别PS外露的细胞，从而确定细胞是否经历了凋亡。
通过Annexin V-FITC细胞凋亡检测，可以将细胞分为四个主要类别：活细胞（Annexin V-FITC和PI均阴性）、早期凋亡细胞（Annexin V-FITC阳性、PI阴性）、晚期凋亡细胞（Annexin V-FITC和PI均阳性）和坏死细胞（Annexin V-FITC阴性、PI阳性）。
这种方法常用于研究药物诱导的细胞凋亡、细胞毒性等生物学过程。
细胞凋亡流式细胞术检测
该法简单、快速，但不适于常规多功能流式细胞仪 (不具备紫外光源)的检测。 主要有Caspases-3流式细胞检测试剂盒，Caspases-
2/ Caspases-4/Caspases-6/Caspases-7/Caspases-9等抗
体
2.6 DNA 碎片分析：Apo-BrdU
核酸内切酶活化使核小体内DNA断裂为50~300kb片段，裂解为200bp
通透性和对称性均会改变。
解决方法： 形态学特征是区分凋亡和坏死的“金标准”。
3.3 样本制备过程中凋亡细胞的选择性丢失：
贴壁培养细胞的分离
凋亡早期，细胞即脱离培养瓶表面并悬浮在培养液中。因此去除培养液， 然后加胰酶或EDTA消化的方法不可避免的会失去很多凋亡细胞。 ---将培养液和消化下来的细胞合在一起 胰酶消化本身就倾向于破坏细胞膜已破损的晚期凋亡和坏死细胞，导致 丢失。
2 细胞凋亡的流式检测方法
利用流式仪测定细胞光散射可对凋亡细胞进行分析 凋亡早期细胞因体积减小，胞浆及染色质固缩，FSC变 小，SSC增大 凋亡晚期细胞FSC、SSC均变小 坏死细胞则因细胞膜通透性改变，细胞肿胀， FSC 、 SSC 变大，胞膜破裂，胞内含物释出后 FSC 、 SSC 均变 小。
此法简单、可靠，由于凋亡时 细胞膜的改变大大早于DNA 的 改变，因此Annexin V/PI(或7-
AAD )双染色是检测早期凋亡
细胞的敏感方法。 由于该法必须用活细胞，因此 检测时间受到限制，且对凋亡 晚期细胞和坏死细胞无法准确 区分。
2.3 细胞内钙离子测定
Fluo-3-Am为新型的高度特异性Ca2+荧光指示剂，进入细胞后
2.1 PI单染检测
与细胞周期相同，利用PI染色，通过检测DNA含量来 同时判定细胞周期和凋亡。 凋亡过程中，细胞内核酸酶释放，细胞DNA发生有序
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2.1 PI单染检测
✓ 与细胞周期相同，利用PI染色，通过检测DNA含量来同时判定细胞周 期和凋亡。
✓ 凋亡过程中，细胞内核酸酶释放，细胞DNA发生有序降解，被降解的 低分子量DNA片段从变性细胞膜（经乙醇及透膜剂处理）漏出细胞外 ，使得凋亡细胞内的DNA含量减低，在流式细胞仪测定细胞DNA含量 直方图中G0/G1峰前可出现亚二倍体峰，即凋亡峰
入细胞后会被胞内酯酶所水解，产生的Fluo-4随后会和钙离子结合并发出荧光。
2.4 线粒体膜电位检测
✓ JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential) ΔΨm 的理想荧光探针。
✓ 线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质(matrix)中，形成聚合物(Jaggregates)，可以产生红色荧光……正常细胞
裂，胞内含物释出后FSC、SSC均变小。
2 细胞凋亡的流式检测方法
➢ 2.1 PI单染检测 ➢ 2.2 Annexin V/PI(7-AAD)双染检测 ➢ 2.3 细胞内钙离子测定 ➢ 2.4 线粒体膜电位检测 ➢ 2.5 Caspases细胞酶的检测 ➢ 2.6 DNA 碎片分析：Apo-BrdU ➢ 2.7 凋亡相关蛋白：Fas、Bcl-2、P53
✓ Fluo-4 将Fluo-3结构中的Cl替换成F ， 荧光强度比Fluo-3强1倍 ✓ Fluo-4与钙离子的亲和力和Fluo-3近似，使用上和Fluo-3也基本相同，可以使用流
式细胞仪检测细胞内钙离子浓度的变化。 ✓ Fluo-4-AM是Fluo-4的乙酰甲酯衍生物，通过培养，能够轻易进入细胞中。AM进
目录
1
细胞凋亡与细胞坏死
2
细胞凋亡的流式检测方法
3
流式检测细胞凋亡面临的问题
1.1 细胞凋亡
➢ 细胞凋亡(Apoptosis)是指细胞基因调控的一种自主性的自杀现象。或者说在一 定的生理或病理条件下，细胞遵循自身的程序，自我结束生命的死亡方式。
➢ 程序性细胞死亡(Programmed Cell Death, PCD) ➢ 细胞凋亡同细胞分裂、细胞分化一样，是机体生存和发育离不开的最基本生
细胞凋亡与细胞坏死的区别
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坏死
凋亡
———————————————————
1.性质
病理性，非特异性
生理性或病理性，特异性
2.诱导因素 强烈刺激，随机发生
较弱刺激，非随机发生
3.生化特点 被动过程，无新蛋白合成，不耗能 主动过程，有新蛋白合成，耗能
4.形态变化 5.炎症反应
➢ 凋亡小体的形成。核膜核仁破碎，核染色质断裂为大小不等的片段，与某些 细胞器如线粒体一起聚集，为反折的细胞膜所包围；
➢凋 亡 小 体 逐 渐 被 周 围 专 职 或 非 专 职 吞 噬 细 胞 吞 噬 。
1.2 细胞坏死
➢ 是细胞受到严重损伤或大剂量细胞毒药物作用后出现的反应。 ➢ 早期表现为细胞膜破坏，线粒体肿胀。 ➢ 继而溶酶体破裂,细胞内容物流出, 引起炎症。
✓ 通过峰下的面积值可得出凋亡细胞在所测细胞群中所占的比率。
✓ PI单染色法的最大优点在于获得凋亡细胞百分数的 同时可以与细胞周期中其 他时相的细胞进行比较
✓ 该法简便、标本制备容易、检测费用低
✓ 缺点：PI单染色法无法确认来自哪一时相的凋亡，对于S 期和G2/M 期的细胞 发生凋亡时，凋亡峰有时与G1 峰或S 峰相互重叠，导致G1 峰或S 峰增宽而无 典型的sub-G1 峰出现，所以无法分析来自S 期或G2/M 期细胞的凋亡，应借 助其他方法进行检测
物现象，通过凋亡可以平衡机体内细胞的数目，清除衰老、过剩、有害的细胞 。
与细胞凋亡有关的疾病
细胞凋亡的形态特征
➢ 凋亡的起始：微绒毛消失，细胞间接触消失，与周围细胞脱离，细胞质中线 粒体大体完整，染色质固缩；
➢ 细胞质密度增加，线粒体膜电位消失，通透性改变，释放细胞色素C到胞浆， 膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面；
✓ PI(7-AAD)可以染色坏死细胞或凋亡晚期丧失细胞膜完整性的细胞，呈现 红色荧光。对于坏死细胞，由于细胞膜的完整性已经丧失， Annexin V可以 进入到细胞浆内，与位于细胞膜内侧的磷酯酰丝氨酸结合，从而也使坏死 细胞呈现绿色荧光。
✓ 此法简单、可靠，由于xin V/PI(或7- AAD )双染色是检测 早期凋亡细胞的敏感方法。
✓ 由于该法必须用活细胞，因此检测时间 受到限制，且对凋亡晚期细胞和坏死细 胞无法准确区分。
2.3 细胞内钙离子测定
✓ Fluo-3-Am为新型的高度特异性Ca2+荧光指示剂，进入细胞后经非特异性酯酶脱 去Am酯，成为脂溶Fluo-3留在细胞内，当Fluo-3与胞内游离钙结合后，其荧光强 度是Fluo-3本身的40倍以上，当用480nm波长激发时，其荧光强度与游离钙离子浓 度成正比。
✓ 线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单体 (monomer)，可以产生绿色荧光……凋亡细胞
细胞结构全面溶解、破坏、细胞肿胀 溶酶体破裂，局部炎症反应
胞膜及细胞器相对完整细胞 皱缩，核固缩
溶酶体相对完整，局部无炎症反 应
6.DNA电泳 弥散性降解，电泳呈均一DNA片 状
7.凋亡小体
无
8.基因调控
无
DNA片段化（180-200bp），电泳呈 “梯”状条带
有
有
2 细胞凋亡的流式检测方法
➢ 利用流式仪测定细胞光散射可对凋亡细胞进行分析 ✓ 凋亡早期细胞因体积减小，胞浆及染色质固缩，FSC变小，SSC增大 ✓ 凋亡晚期细胞FSC、SSC均变小 ✓ 坏死细胞则因细胞膜通透性改变，细胞肿胀，FSC、SSC变大，胞膜破
2.2 Annexin V/PI(7-AAD)双染检测
✓ 磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine,PS）异位：正常情况下，PS位于细胞膜内 层，细胞发生凋亡时PS从细胞膜内翻转并暴露在细胞膜外层，是细胞发生凋 亡的早期事件。
✓ Annexin V选择性结合PS 。用带有荧光标记的Annexin V，就可以用流式细 胞仪非常简单而直接地检测到磷酯酰丝氨酸的外翻这一细胞凋亡的重要特 征。