磷脂脂肪酸法分析野山参根区土壤微生物群落多样性_张亚玉
磷脂脂肪酸plfa测定方法
磷脂脂肪酸（PLFA）是一种生物标志物，可以用于指示土壤微生物群落的结构和功能。
PLFA 测定方法通常包括以下步骤：
1. 样品采集：采集土壤样品，并将其保存在适当的条件下。
2. 提取：使用适当的有机溶剂（如氯仿、甲醇等）从土壤样品中提取磷脂脂肪酸。
3. 净化：使用硅胶柱或其他适当的方法对提取物进行净化，以去除杂质。
4. 分离：使用气相色谱或液相色谱等技术对磷脂脂肪酸进行分离。
5. 鉴定：使用质谱或其他适当的技术对分离出的磷脂脂肪酸进行鉴定。
6. 数据分析：对鉴定出的磷脂脂肪酸进行数据分析，以确定土壤微生物群落的结构和功能。
需要注意的是，PLFA 测定方法的具体步骤可能因不同的实验条件和设备而有所不同。
因此，在进行 PLFA 测定之前，需要仔细阅读相关的实验手册和文献，并根据实际情况进行适当的调整。
磷脂脂肪酸分析方法及其在土壤微生物多样性研究中的应用_颜慧
*土壤与农业可持续发展国家重点实验室基金(055122)资助通讯作者,E -mai l:zhongwenhui@作者简介:颜 慧(1982~),女,汉族,江苏淮安人,硕士研究生,主要从事土壤微生物学和生物化学研究。
E -mail:hui xiaoyan@hotmai l.c om 收稿日期:2005-10-31;收到修改稿日期:2006-03-22磷脂脂肪酸分析方法及其在土壤微生物多样性研究中的应用*颜 慧1 蔡祖聪2 钟文辉1,2(1南京师范大学化学与环境科学学院,南京 210097)(2土壤与农业可持续发展国家重点实验室(中国科学院南京土壤研究所),南京 210008)摘 要 磷脂脂肪酸(PLFA)是活体微生物细胞膜的重要组分,不同类群的微生物可通过不同的生化途径合成不同的PLFA 。
一些PLFA 可作为分析微生物量和微生物群落结构变化的/生物标记0。
在土壤微生物分析中,越来越多地采用了PLFA 方法。
本文介绍了表征微生物的一些PLFA 、从土壤中提取PLFA 的方法以及用GC -MS 分析PLFA 的原理。
本文还将常用的研究微生物多样性的几种方法进行了比较。
传统的分析土壤微生物群落的方法依赖于培养技术,只能培养和分离出一小部分微生物群落;Biolog 方法可用于研究土壤微生物群落生理多样性,即可反映微生物群落如何利用各种碳源底物,但对快速生长和适合在Biolog 实验条件下生长的小部分群落成员有强烈的选择性;核酸分析方法的主要缺点是不能对土壤微生物进行定量分析;而PLFA 方法相对于上述几种方法有诸多优势。
本文通过一些实例证明PLFA 方法的特色或独到之处,也分析了其缺点。
采用PLFA 方法并结合其他方法有助于获取土壤微生物群落多样性的更多和更全面而完整的信息。
关键词 土壤微生物;磷脂脂肪酸;生物量;群落结构;GC -MS(气相色谱-质谱);多样性中图分类号 X172 文献标识码 A土壤微生物参数很可能最早被用于表征土壤质量[1]。
土壤微生物多样性研究方法1
1 土壤微生物多样性研究进展土壤微生物多样性又称微生物群落结构，是指生命体在遗传、种类和生态系统层次的变化。
它代表着微生物群落的稳定性，也反映土壤生态机制和土壤胁迫对群落的影响。
生物多样性还可以定义为生命的丰富度( richness of life)，通常以土壤生物区系的变化和生物化学过程间的相互贡献来反映。
由于它能较早地预测土壤养分及环境质量的变化过程，被认为是最有潜力的敏感性生物指标之一。
生物多样性作为指标在监测土壤变化和对胁迫的反映方面是重要的，同时对进一步了解土壤微生物群落状态也十分有用。
随着人们对环境资源保护意识的逐步加强和因人类影响而造成的多样性损失的客观存在，目前学术界对多样性问题倍加关注。
在微生物群落研究中，微生物的均衡性、丰富性和多样性是常用的指标。
2.1 土壤微生物多样性的测试方法研究进展2.1.1 常规微生物多样性研究方法(1) 传统的微生物培养法微生物平板培养方法是一种传统的实验方法。
这种方法主要使用不同营养成分的固体培养基对土壤中可培养的微生物进行分离培养，然后根据微生物的菌落形态及其菌落数来计测微生物的数量及其类型。
平板计数法被认为是监测特殊微生物群变化的非常有效的方法；由于这种方法人为限定了一些培养条件，常常造成某些微生物的富集生长，而另一些微生物缺失。
(2) PLFA 谱图分析法磷脂脂肪酸（Phospholipid FattyAcid ，PLFA)谱图分析方法、脂肪酸（FattyAcid)和脂肪酸甲醋（Fatty Acid Methyl Ester, FAME）谱图分析方法等早己应用于对感染致病微生物以及人类和动物体内微生物卫生的研究方面。
近些年来，磷脂脂肪酸分析方法也逐渐被应用于土壤微生物多样性的研究中来，并作为土壤微生物种群变化的监测指标。
颜慧等对中国科学院红壤生态实验站长期定位试验中不同施肥处理红壤水稻土的磷脂脂肪酸( PLFA)特性及酶活性进行了分析。
结果表明：不同施肥处理的土壤酶活性、养分、微生物生物量及微生物群落多样性差异较大；施肥处理增加了PLFA 的种类和微生物量；施肥土壤的真菌 PLFA 量大于不施肥土壤，细菌 PLFA 量小于不施肥土壤，说明真菌较细菌更能适应养分贫瘠的条件。
土壤微生物生物量及多样性测定方法评述
基 金 项 目 ：国家重 点基 础研 究发 展计 划 项 目 （ ０ ７ Ｂ ０２ ０５ ；国家 “ ２ ０Ｃ ４ ７０ — ） 十一 五’ 技 支撑 计划 资 助项 目 （ ０ ６ Ａ ０ Ａ １ 科 ２０Ｂ Ｃ １０ ） 作者 简介 ：胡 婵娟 （ ９ １ 生 ） １８ 年 ，女 ，博士 ，主 要进 行景 观生 态学 和 士壤 生态 学 的研究 。Ｅｍａｌｈｃ ａｊａ１８ ＠１６ｔｏｍ － ｉ ｕｈｎｕｎ９ １ ２ ：
２ 土壤 微 生物 多样性 的研 究方法 ． ２
土壤微生物多样性测试的传统方法为分离法 ， 该方法获得 的数据在一定程度上决定 于提取 的方 法和培养基类型。并且绝大部分土壤微生物无法用 现有 的分离 方法 进行 培养 。因此 ，该 方法 有很 大 的 局 限性 。在过 去 十几年 的时 间里 ，随着测 试技术 的 进步 ，土壤微 生物群 落结 构 的测 定方 法也 得到 了迅 速地 发展 ，新 的测定 方法 的 出现 如生 物标 志物法 、 磷酯脂肪酸分析法 、 核酸分析法及碳素利用法使人 们能够更好的评价土壤微生物群落结构和多样性 。 如图 １ 示。 所 ２２１ 基 于培 养 的微 生物群 落的测 定方 法 ． ． １ 微 生物平 板 培养法 ） 微生物平板培养方法是一种传统的实验方法。 这种方法主要使用不 同营养成分 的固体培养基对 土壤中可培养的微生物进行分离培养 ， 然后根据微 生物 的菌落形态及其 菌落数来计测微生物的数量 及其类型。平板培养法是进行土壤微生物分离培养 的常用方法 ，一般分为稀释 、 接种、培养和计数等 几个步骤，该方法简便易行 ， 一直以来 ， 被广泛应 用。这种方法在土壤健康的研究中应用较多 ， 许多 研 究 表 明利 用 该 方 法 得 到 的 土壤 微 生 物 的多 样 性 与土壤 的病害控制、有机质的分解等方面存在一定 的关系【 ｏ 但是有关研究表明与其他非培养方式 ３。 ］
土壤论文微生物论文微生物元素论文
土壤与环境微生物研究类论文摘要从传统污染物和新型污染物等方面介绍了我国土壤污染的现状,进而分析了土壤环境因子包括土壤微生物、土壤温度、pH值、土壤水分、土壤机械组成、气候及二氧化碳含量等对有机污染物降解和转化的影响。
针对长期施用化学肥料,土壤微生物体系受到不同程度破坏的现状,结合多年的试验与研究,总结了微生物肥料作用与安全施用技术,以期促进微生物肥料的推广应用。
目录1. 微生物对土壤和沉积物吸附多环芳烃动力学的影响2. 影响根际土壤微生物多样性的因素研究3. 重金属污染土壤的微生物多样性研究进展4. 食用菌菌渣循环利用对农田生态环境的影响与评价指标5. 不同桉树土壤微生物数量的比较6. 微生物肥料的发展现状及展望7. 石油污染土壤植物根际微生态环境与降解效应8. 修复受损土壤的良药9. 松嫩平原盐碱化草原土壤微生物的分布及其与土壤因子间的关系10. 微生物肥料及其应用推广分析11. 多环芳烃对土壤线虫和微生物生物量的影响12. 微生物肥料的作用与安全施用13. 微生物肥料的作用效果与广阔前景14. 微生物培养技术初探15. 土壤环境因子对有机污染物迁移转化的影响16. 重金属污染的微生物修复技术17. 土壤污染及其防治措施18. 浅谈土壤石油污染及其治理对策19. 蒙顶山茶园土壤微生物区系和酶活性研究20. 土壤重金属污染修复技术及应用展望21. 生物肥防治香蕉枯萎病及对土壤微生物多样性的影响22. 蚯蚓在土壤生态系统中的重要作用研究23. 农药的微生物降解研究进展24. 果树生长与土壤条件的关系探析25. 转基因番茄栽培对土壤生物学特性的影响26. 土壤化学的研究进展及其在现代农业生产中的地位27. 试论植物与微生物的互作28. 地下耕耘者29. 土壤微生物的宏基因组学及其研究进展30. 黄绿木霉T1010对不同土壤层微生物群落的影响微生物对土壤和沉积物吸附多环芳烃动力学的影响摘要以枯草芽孢杆菌为接种微生物，研究微生物对沉积物和湿地土壤吸附菲和苯并[a]芘(BaP)吸附动力学的影响。
磷脂脂肪酸（PLFAs）谱图分析技术
磷脂脂肪酸（PLFAs）谱图分析技术微生物生态学的研究方法——磷脂脂肪酸分析（PLFA）【内容摘要】定量描述微生物群落是微生物生态学的难题之一。
应用传统的微生物培养方法和显微技术, 需要在选择性培养基上培养微生物, 即首先从环境样品中分离出纯菌株, 再对该菌株进行一系列的生理生化分析。
文章综述了磷脂脂肪酸谱图分析法在微生物生态研究中的应用，包括估算微生物生物量、确定群落结构、指示特定微生物，指示生理和营养状况等，并指出此种方法存在的问题及改进方法。
【关键词】磷酸脂肪酸微生物生态学应用及发展一、引言：环境中微生物的种类和数量是及其丰富的[1]，微生物能把有机质作为营养源转化为组成物质和能量，它们在环境治理过程中扮演着极其重要的作用。
分离和鉴定处理系统中的优势菌，了解特定环境下微生物群落的种群分布、遗传多样性及其动态变化规律和认识微生物群落的稳定性及功能菌的作用，是环境微生物学研究的重要内容。
传统的微生物鉴定和群分析方法建立在微生物纯种培养分离基础上，但自然环境中有99%以上的微生物还不能通过人工培养，在微生物的分析和研究工作中具有很大的局限性。
二、正文：1．磷脂脂肪酸(PLFAs)谱图分析技术概述1.1 PLFA 概念、分类和命名磷脂是含有磷酸基团的脂质，目前已发现了1000多种磷脂类物质。
磷脂作为微生物细胞膜主要成分，是甘油分子的第3位羟基被磷酸或其他羟基所酯化形成的。
其结构特点是：具有由磷酸相连的取代基团（含氨碱或醇类）构成的亲水头（hydrophilic head）和由脂肪酸链构成的疏水尾（hydrophobictail）。
PLFAs(磷脂脂肪酸，phosphohpids fattyacids)谱图分析方法的原理是基于磷脂——几乎是所有生物细胞膜的重要组成部分，细胞中磷脂的含量在自然条件下(正常的生理条件下)恒定[ 2 ]，其长链脂肪酸的形式——磷脂脂肪酸PLFAs 可作为微生物群落的标记物。
【国家自然科学基金】_细菌群落多样性_基金支持热词逐年推荐_【万方软件创新助手】_20140730
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科研热词 细菌多样性 多样性 群落结构 16srdna 细菌 变性梯度凝胶电泳 pcr-dgge 沉积物 水稻土 微生物群落结构 rflp分析 rflp biolog 16s rdna 零价铁 群落多样性 细菌群落 磷脂脂肪酸 石油污染 微生物多样性 微生物共作 限制性内切酶长度多态性 附着细菌 长期施肥 链霉菌 铬污染 重金属 酸性矿区 酶活性 鄱阳湖 逐步回归法 进化 西太平洋 菌种资源 荧光原位杂交 茄子植株 苯酚 肠道微生物 细菌组成 纳米颗粒 系统发育分析 稻田 种系发育 种植模式
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施肥对土壤微生物多样性的影响
微 生 物 是 生 物 圈 的 三 大成 员 之 一 ， 是 土 壤 斟 、 也 水
圈的 活 跃 成 员 。微 生 物 生 物量 是 指 土 壤 有 机 质 中有 生
护 生态 平 衡 等 方 面 具 有 重 要 作 用 。据 研 究 测 定 ： 被 地
植 物 减 尘 率 为 ｌ ． ～ ３ ． 。所 以 建 议 考 虑 用 ： ６０ Ａ ０ ９３ 二
的估 计 Ｊ 。俞 慎 等 认 为 土 壤 微 生 物 多 样 性 与 微 生 物 生 物量相结合 ， 可在 土壤 微 生物 生 物 总量 、 壤 微 生 物组 土
成 或 区系 上 全 面 地 反 映 土壤 质 量 的生 物 活性 。 土 壤 是 一 个 充 满 生 机 的 生 态 系 统 ， 壤 微 生 物 是 土 土 壤 生 态 系 统 中极 其 重 要 和 最 为 活 跃 的 部 分 ， 土 壤 在
ｉｓ ｍ ｅ ｈａ ｉ ｍ ． ｎ ｏ ｉ ｅ ｒ ｆ ｒ ｎ ｅ ｂ ｓｓ ｆ ｒ Ｓ ｉ ｆ ｒ ｉ ｔ ｖ ｌ ａ ｉ ｎ ａ ｅ ｔｌｚ ｔｏ ａ ｇ ｍ ｅ ． ｔ ｃ ｎ ｓ ａ ｄ ｐｒ ｖ ｄ ｅ ｅ ｅ ｃ ａ ｉ ｏ ｏ １ ｅ ｔｌ ｙ ｅ ａ ｕ ｔｏ ｎｄ ｆ ｒ ｉ ａ ｉ ｎ ｍ ｎａ ｅ ｎｔ ｉ ｉ Ｋｅ ｒ ｓ Ｓ ｌ ｍ ｉｒ ｂ ； ｍ ｍ ｕ ｉｙ； ｖ ｒ ｉｙ； ｒ ｉ ｚ ｔｏ ｙ ｗｏ ｄ ： ｏ １ ｃ ｏ ｅ Ｃｏ ｎ ｔ Ｄｉ ｅ ｓ ｔ Ｆｅ ｔｌ ａ ｉ ｎ ｉ
进行 系统 调 查 ， 据 调 查 结 果 ， 证 确 定 适 宜 于 全 市 不 依 论
同 区域 的 园林 绿 化 的乡 土 植 物 种 类 。
月蓝、 花地丁 、 覆花 、 钱 草 、 公 英 、 黄 、 肤 、 紫 旋 连 蒲 地 地 蛇莓 、 野 菊 、 前 等 。 甘 车
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磷脂脂肪酸法分析野山参根区土壤微生物群落多样性收稿日期：2010-03-26基金项目：国家科技支撑计划（2007BAI38B01）；吉林省科技厅计划项目（20090573）作者简介：张亚玉（1968-），女，研究员，博士，研究方向为人参、西洋参等药用植物栽培。
E-mail:zyy1966999@张亚玉1，宋晓霞1，孙海1，汪景宽2，于树2*（1.中国农业科学院特产研究所，吉林吉林132109；2.沈阳农业大学土壤与环境学院，沈阳110161）摘要：应用磷脂脂肪酸法（PLFA ）分析了野山参根区土壤及对照土壤微生物群落结构特征。
结果表明，野山参生长的根区土壤与对照土壤相比，微生物总量发生了明显的变化，均有减少的趋势；野山参根区中代表有致病特征的真菌种类18 2w9，18 1w9c ，18 1w9t 的总量没有增加反而减少，这与以往的研究结果相反。
应用主成分分析法从PLFAs 中提出3个主成分，2个样品分别代表81.03%和85.44%的变异信息，主成分一（PC1）分别解释了36.54%和39.09%的变异，主成分二（PC2）分别解释了28.65%和29.91%的变异，主成分三（PC3）分别解释了15.83%和16.44%的变异，在测试的野山参根区土壤样品中，PC1得分均比对照低。
而且从主成分得分图上可以很明显区分根区土壤与对照土壤。
从微生物群落结构上揭示了野山参在一地健康生长的主要原因。
关键词：土壤微生物；群落多样性；磷脂脂肪酸；主成分分析；野山参中图分类号：S151.9＋4文献标志码：A 文章编号：1005-9369（2011）02-0092-05Analysis of soil microbial diversity in wild ginseng with phospholipid fat ⁃ty acid method/ZHANG Yayu 1,SONG Xiaoxia 1,SUN Hai 1,WANG Jingkuan 2,YU Shu 2(1.Insti-tute of Special Wild Economic Animal and Plant Science,CAAS,Jilin 132109,China;2.College of Soil and Environment,Shenyang Agricultural University,Shenyang 110161,China)Abstract:The ester-linked phospholipid fatty acid (PLFA)method was used to evaluate the soilmicrobial community diversity in two wild ginseng root zone and corresponding control.The results showed that root zone campar with control,the total soil microbial biomass in root zone changed obviously and all depressed trend presented a tendency of decrease compared with that of control;the total represent fungi with the pathogenic efficacy 18:2w9,18:1w9c,18:1w9t in No.1wild ginseng root zone was not increased and was decreased.The experiment result was different from all the results of the previous.Three principal components were screened out with the principal component analysis,represented 81.03%and 85.44%of the information of diversity.Among the three,PC1explained 36.54%and 39.09%of the variation,PC2explained 28.65%and 29.91%,PC3explained 15.83%and 16.44%,which helped successfully distinguish root zone from control in the principal components scores charts.This was probably the reason why the wild ginseng could grow health long term.Key words:soil microbial;community diversity;PLFA;principal component analysis;wildginseng野山参（Wild ginseng ）为五加科人参属多年生草本植物，其根为道地中草药，吉林省东部山区被认为是人参最适宜的生长区，而抚松县被誉为“人参之乡”，自古就是人参的主产区，出产优质野山参。
野山参是指自然生长在原始森林中，没有人为因素影响的一类人参。
野山参的药用价值极高，第42卷第2期东北农业大学学报42(2):92~962011年2月Journal of Northeast Agricultural UniversityFeb.2011早在2000年前，《神农本草经》中对野山参的药用价值就有了详细的记载，《本草纲目》中称野山参为“神草”，列为药中上品，具有生津安神、补虚固脱、大补元气、强精健身益寿延年之功效[1]。
但随着对野山参无度采挖，导致目前野山参资源濒于灭绝的地步。
而林下参和农田栽参的发展既是对山参资源的保护，又可满足人们对人参产品的需求，也为参农提供了治富之路，为农村产业结构调整提供了新的思路。
但在林下参发展过程中由于选地不当，林下参的存苗率低，形体变劣的现象时有发生；农田栽参过程中由于改土不当，存在产量低、病害重，且存在严重的连作障碍，限制了参业的发展，而上述问题的产生均与土壤的物理、化学及微生物特性等关系密切[2-4]。
通过对栽参土壤和老参地土壤的微生物及酶活性的研究，多数专家提出土壤微生物群落的改变可能是人参连作障碍的根源。
野山参在深山密林中生长十年、几十年甚至上百年，其能够安然无恙，与其特有的土壤微生物群落特性直接相关。
前人对于人参土壤微生物的研究多采用传统的培养法，由于可培养的微生物种类仅占土壤微生物的1%左右，所以对于微生物的真实性存在一定的误差，而磷脂脂肪酸PLFA方法是一种快速、重现性好的分析土壤微生物群落结构多样性的方法，可以分析所有活体微生物（包括可培养和不可培养的微生物）。
而且，信息准确度高，应用范围广，操作简便，可以同时处理大量的样品，是对土壤中活体微生物的真实反映[5-8]。
本文利用磷脂脂肪酸法通过对野山参根区土壤微生物结构特性与非根区土壤微生物群落的对比分析，明确山参根区土壤的微生物结构特征，期望能在农田栽参土壤改良和林下参护育选地方面提供帮助，为人参产业的健康发展提供指导。
1材料与方法1.1试验材料土壤样品采自吉林省人参之乡的抚松县露水河镇楞场村，离村5km的黑熊沟山上，1号（大约12年生）野山参土壤位于东经127°44′、北纬42°47′、海拔（780±9）m，2号（大约25年生）野山参位于东经127°57′、北纬42°33′、海拔（650±5）m，采集地土壤类型为暗棕壤，该区是野山参经常被发现的地域。
1.2采样方法首先除去表面的枯枝落叶层后，边抬参边取土，由于野山参生长的特殊性，每年在生长期其须根周围均长出许多营养吸收根，枯萎期时有的脱落，有的在须根上形成珍珠点，使野山参根圈土壤可以扩展到须根周围2cm左右的范围，对照为非根区土壤，在附近采集，采集深度与参层土壤样品相对应。
取回的新鲜土样放入4℃的冰箱贮存待测。
野山参根区土壤的基本性质见表1。
表1供试土壤基本性质Table1Some basic properties of tested soil编号No.1号2号pH6.195.57有机质（g·kg-1）OM226.87196.22全氮（g·kg-1）Total N11.289.29全钾（g·kg-1）Total K10.157.93全磷（g·kg-1）Total P0.160.24碱解氮（mg·kg-1）Alkal N63.1869.18速效钾（mg·kg-1）Avail K690.70614.24有效磷（mg·kg-1）Avail P7.0711.641.3测试方法土壤微生物磷脂脂肪酸的测定在White的方法[9]上加以改进。
①鲜土加入柠檬酸缓冲液 氯仿 甲醇=0.8 1 2，25℃避光震荡，离心。
再加入柠檬酸缓冲液 氯仿 甲醇=0.9 1 1，震荡，避光保存，经18h分离后，用吸管把上层液吸走，保留底层氯仿相在氮气流下吹干。
②用柱层析硅胶0.8g（在120℃下烘干2h）填充玻璃管柱（直径6mm），依次分别加10mL氯仿、10mL丙酮、10mL甲醇，收集到的磷脂脂肪酸在甲醇相中，在氮气流下吹干样品。
③向干样品中加入1mL甲醇 甲苯（1 1）混合液和1mL0.2mol·L-1KOH甲醇溶液，37℃水浴15min后，冷却至室温，依次加入2mL去离子水，0.3mL1mol·L-1HAc，2mL正张亚玉等：磷脂脂肪酸法分析野山参根区土壤微生物群落多样性第2期·93·己烷，震荡，离心，甲酯化的C19：0为内标，氮气流下吹干，-20℃下保存。
外标为Supelco TM37Component FAME Mix和Bacterial Acid Methl Esters Mix。
检测部分由安捷伦GC-MS（6890N-5973N）完成。
色谱柱为hp5-MS（30m×250um×0.25um）石英毛细管柱。
GC-MS分析条件：升温程序：进样后在70℃保持5min，之后以20℃·min-1的速率升至190℃，保持1min，以5℃·min-1的速率上升到200℃，停留2min，以10℃·min-1的速率上升到280℃，保留8min。