柠檬酸发酵原理

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人手洗手消毒前后手部卫生状况对比
• 洗手前：1300个/cm2 • 清水洗手后：1000个/cm2 • 肥皂洗手后：80个/ cm2 • 消毒后：0个/ cm2
未洗的手
未打皂液洗过的手
洗净的手（用洗剂）
洁净的手（消毒后）
进 入 工 作 岗 位 以 后 环境卫生是实验室、发酵工 人、消毒人员及厂区工作人 员必须时刻铭记的基本常识。
黑曲霉如何积累柠檬酸
黑曲霉耐酸，耐低PH。 黑曲霉发酵柠檬过程中，在发酵初期， 发酵液中萄葡糖含量较高，而高浓度的萄 葡糖正是黑曲霉α-酮戊二酸脱氢酶合成的 抑制物，这样一来TCA循环就中断了，酸 度得到积累（注意此时积累的是酸度而不 仅是柠檬酸），但是当酸度积累到PH≤2.0 时，催化柠檬酸<>顺乌头酸<>异柠檬酸正 逆反应的顺乌头酸水合酶，不表现出活力 ，这样TCA循环在合成柠檬酸之后就不会 向后继续反应，从而达到柠檬的积累。
传播污染的四大媒介－人
第四个帮凶可能是大家都不会想 到的，它就是我们自己，人体是一个 永不休止的污染媒介。当您每天来工 厂上班时，您也许随身将几百万细菌
带入工厂。
人员污染的途径和方式
人的头发和皮肤：每分钟从人类皮肤中要散发出约10,000个微
生物
嘴巴和鼻子——水滴：呼吸、咳嗽和喷嚏将产生出大量水滴，
黑 曲 霉 生 长 周 期
发酵常见染菌及区别
一、酵母菌是一些单细胞真菌，体积较细 菌较大 ，1~5微米*5~30微米，而细菌直 径或宽度不超过1微米，长不超过5微米， 有氧无氧均可生存，低PH也可生存。
二、细菌主要由细胞膜、 细胞质、核质体等部分构 成 ，球菌、杆菌和螺形 菌 ，低PH难以存活，易 自溶。
传播污染的四大媒介－水
第二个帮凶是水，从理论上来讲，微生物在纯水中是不 能生长的。但是，所有的各类水，不管怎样仔细地蒸溜 或过滤，总会含有一定量的可溶性有机物和盐类。正是 这些可溶性的物质可被微生物利用作为它们生长的养料 源泉。
传播污染的四大媒介－表面
第三个帮凶是表面，包括：天花板、墙壁、地面、设备、 容器、工具或桌子； 由于空气中的湿度，所有表面都包上一层含水的薄膜。这 层薄膜由于静电吸引而饱含尘埃微粒，有很多时候，表面 还覆盖一层油状物质，此层油膜易受到尘粒污染。 表面因尘埃微粒和微生物由空气传播的回降而受到污染。 请记住：一个表面看起来很干净，而实际上已经被千百万 个微生物所污染，除非已经做了正确的消毒灭菌。
黑曲霉柠檬酸发酵原理
主要内容
• • • • • 黑曲霉及相关知识简介 菌种制备过程 发酵底物来源 黑曲霉发酵机制 与实际生产的联系
黑曲霉简介
黑曲霉属真菌中的一个常见种，属半知菌纲。广泛分布于 世界各地的粮食、植物性产品和土壤中。是重要的发酵工 业菌种，可生产淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶 、葡萄糖氧化酶、柠檬酸、葡糖酸和没食子酸等。 黑曲霉一般只进行无性繁殖，孢子在培养基中培养6—8h 开始萌发出芽，长出多根芽，逐步形成菌丝，菌丝不久即 出现分枝。黑曲霉菌丝是多细胞结构，有横隔，其中可育 细胞称为足细胞。由足细胞长出分生细胞梗，分生孢子梗 顶端包囊的聚集并原生质馍的融合，使顶端膨大形成顶囊 ，上面变生二层小梗，小梗上长出成链的孢子。这样一个 生活周期约50h。但黑曲霉菌丝是不断地生长延长的，孢 子也逐渐不断地产生，直到营养枯竭为止。
微生物存在的状态
多数附着 于灰尘
芽孢病毒 悬浮空气
沉积地 表、土 壤、水
1μm以下者处于悬浮状态， 10μm以上者会逐渐沉下来而形成菌尘
传播污染 四大媒介
空气
水
表面
人
传播污染的四大媒介－空气
• 传播污染的第一帮凶就是空气，空气携带着噬菌体 来污染我们的厂区。每立方米的空气中至少含有60 万颗尘粒，还存在着大量的微生物。 • 因此，要杜绝带有大量尘埃微粒和微生物的空气污 染办法是对空气采取过滤的措施，把隐藏在空气中 的敌人通通过滤掉，使空气质量达到我们的要求。 这就是要建立密闭厂房和空气净化系统的原因。 • 对空气处理，只过滤了尘粒，但还有大量微生物存 在空气中，所以采取对空气消毒的措施来消灭微生 物，例如：高温消毒的方式等杀死微生物。但是常 使用一种消毒剂会使微生物产生耐药性，因此，在 使用消毒剂时，必须定期交替使用。
酶的抑制来实现的。
（二）TCA循环的调节
•
1、TCA环的起始酶：柠檬酸合成酶是一种调节酶。但 在黑曲霉中，柠檬酸合成酶没有调节作用，这是黑曲霉 TCA环的第一个特点。耐酸性
•
顺乌头酸酶失活，阻断TCA环是柠檬酸积累的必要条件
，顺乌头酸水合酶需要Fe2＋。顺乌头酸酶、异柠檬酸酶在 pH2.0时失活，线粒体顺乌头酸酶在催化时有柠檬酸：顺 乌头酸：异柠檬酸=90：3：7的平衡，这个平衡可能就是 造成柠檬酸的最初积累而使pH值降低。
这种水滴既含有尘粒污染也含有微生物污染。咳嗽一次的发菌 量为70～700个(min· 人)，喷嚏一次的发菌量为4000～60000个 (min· 人). 衣着：洁净室内当工作人员穿无菌服时，静止时的发菌量为10 ～300个/(min· 人)，躯体一般活动时的发菌量为150～1000个 (min· 人)，快步行走时的发菌量为900～2500个(min· 人) 化妆品和珠宝手饰：发胶、气雾除臭剂、眼脸膏、香粉等，为 微生物污染提供了极好的源泉。耳环、戒指、项链、手链等首 饰，因为它们难于清洗，所以可能成为感染源或污染源。 生产过程中的人为差错：当员工没有按照SOP进行工作时， 车间的污染程度增加。
柠檬酸生物合成的代谢调节
• （一）、糖酵解及丙酮酸代谢的调节
• 1、正常情况下，柠檬酸、ATP对磷酸果糖激酶有抑 制作用，而AMP、无机磷、铵离子对该酶则有激活 作用，特别是还能解除柠檬酸、ATP对磷酸果糖激 酶的抑制作用。
• 铵离子浓度与柠檬酸生成速度有密切关系，正是由 于细胞内浓度升高，使磷酸果糖激酶对细胞内积累 的大量柠檬酸不敏感。这就是为什么种子罐不添加 硫铵，PH下降慢，酸度低。
发酵底物来源
黑曲霉生长培养基 培养基的成分对微生物发酵产物的形成有很大 的影响，必满足微生物的能量、元素和特殊养 分的需求，如下： C源+N源+矿物质+O2 新增细胞+目标产物 +CO2+H2O+△H C源：葡萄糖 N源：有机氮和无机氮
葡萄糖来源
玉米、木薯等原料 淀粉 糊精 葡萄糖
柠檬酸
黑曲霉发酵柠檬机制
小概念：三磷酸腺苷，简称为ATP，其中A表示腺苷，T表示其数量 为三个，P表示磷酸基团，即一个腺苷上连接三个磷酸基团。其结 构简式是：A—P～P～P，其相邻的两个磷酸基之间的化学键非常 活跃，水解时可释放约30.54kJ/mol的能量。
EMP途径
糖酵解特点
1、它是一个产能的过程，虽然在第1、3步中消耗了两分子ATP, 但在第7、10步中却又生成了4分子ATP,所以是一个产能过程。三 磷酸腺苷，简称为ATP，其中A表示腺苷，T表示其数量为三个， P表示磷酸基团，即一个腺苷上连接三个磷酸基团。其结构简式 是：A—P～P～P，其相邻的两个磷酸基之间的化学键非常活跃 ，水解时可释放约30.54kJ/mol的能量。2、糖酵解过程不消耗氧 分子3、与HMP途径有共同中间产物——6-磷酸葡萄糖和3-磷酸甘 油醛，HMP途径就是通过这两种物质与糖酵解互相 沟通。4、1、3、10步是不可逆反应，这就不难解释为什么不管 是EMP还是HMP途径最终都能生成丙酮酸，因为可逆反应都是朝 着浓度低的方向进行，生成丙酮酸的反应不可逆，生物体内的烯 醇式磷酸丙酮酸就会越来越少，因此第9步反应就会朝向烯醇式磷 酸丙酮酸方向进行，以此类推，在酶的活性不受干扰的情况下， 萄葡糖通过EMP和HMP途径生成丙酮酸。 丙酮酸的生成并不是柠檬酸合成专属的物质。在有分子氧存在的 情况下，才能进入三羧酸循环（TCA），而在缺氧的情况下，则 会进行乙醇、乳酸等物质的发酵。
导致侧呼吸链失活，使ATP积累，柠檬酸积累减少。
与现生产结合
• 温度影响 • 无菌生产的重要性
温度影响
微生物生长周期
介质
一般空气中 土壤 严重污水 人的头皮 人的两手 1g指甲污垢 1g粪便
微生物含量
800~3500个/m3 1~500亿个/g 107个/ml 100-150万个/cm2 4~40万个 30亿-40亿个 10~1000亿个
T C A
淀粉
葡萄糖
6-磷酸果糖
1，6-二磷酸果糖 磷酸丙糖 磷酸烯醇丙酮酸 CO2 乙酰CoA 柠檬酸 Fe 2+ 顺乌头酸 异柠檬酸
CO2 草酰乙酸 苹果酸 富马酸
丙酮酸
CO2
琥珀酸
α-酮戊二酸
• 存在两个CO2固定系统（需Mg2＋、K＋）： • 1）丙酮酸（PYR）在丙酮酸羧化酶作 用下，生成草酰乙酸（此作用更强）
了解了黑曲霉及其制备过程，了解 了发酵底物的组成及来源，那黑曲霉 是如将这些底物转变为柠檬酸的呢？ 总述：萄葡糖首先通过糖酵解（ EMP）／磷酸戊糖途径（HMP）得 到磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸，然后 经过一个不完整的三羧酸循环达到柠 檬酸的积累。
EMP（糖酵解）
• 糖酵解是生物体进行单糖的分解和利 用的主要途径之一，糖酵解总共包括 10个连续步骤，均由对应的酶催化。 • 不仅是黑曲霉，许多生命体都存这种 获取能量的方式
淀粉
葡萄糖
6-磷酸果糖
Pi AMP ATP
1，6-二磷酸果糖
+ NH4 +
磷酸丙糖 磷酸烯醇丙酮酸 CO2
K
CO2 草酰乙酸
丙酮酸
CO2
乙酰CoA 柠檬酸
• 2.比较底物锰充足、锰缺乏时分批培养物的最 大活力时发现，锰缺乏时黑曲霉的组成（合成 ）代谢受损伤，这与柠檬酸的积累有关。