免疫血清学检验技术
免疫血清学技术
直接凝集试验： 玻片法：鸡白痢玻片凝集 试管法：布氏杆菌试管凝集 间接凝集试验：
间接血凝试验：猪瘟间接血凝试验
乳胶凝集试验：猪伪狂犬病乳胶凝集试验 协同凝集试验：
SPA +
Ab
SPA-Ab +
Ag
SPA-Ab-Ag
2. 沉淀试验：
可溶性抗原（毒素、病毒、细菌裂解液）与相应抗体结合, 在电解质 存 在情况下，产生可见的沉淀物。
补体结合反应的基本原理
Ag + Ab
Ag Ab +
C
Ag Ab C
Ag?
Ab
Ag+ Ab
C C
E E H
+ 不溶血
H
Ag-
Ab
Ag-
Ab 溶血
C
C
E H
E
H
五、
中和试验
抗原和相应抗血清按适当比例混合作用后可被中和而失去
毒力，接种实验动物、组织细胞、鸡胚而不出现致病作用。
1. 终点法中和试验（End-point neutralizing test）:
Reed 法Muench 计算半数致死量（LD50）。
2. 空班减少试验 ( Plague reduction test)：
应用空斑技术使空斑数减少50%的血清量作为中和滴度。
将已知空斑单位（PFU）的病毒稀释成每一接种剂量含 100 PFU，加等量递进稀释的血清，37 ℃ 1h 。接种细胞后， 覆盖琼脂，培养数天后，计算空斑数，计算血清的中和滴度。
（3）免疫电泳技术 琼脂双扩散与电泳技术结合而成。
包括：免疫电泳
对流免疫电泳 火箭电泳
+
Ag Ab
Ag
Ab
血清学试验的种类及应用
血清学试验的种类及应用血清学试验是一种常见的医学检验方法，通过检测患者的血液中的抗体或抗原等物质来诊断和监测疾病的发生和发展情况。
血清学试验可以分为多个种类，包括免疫荧光试验、酶联免疫吸附测定法（ELISA）、中和试验、补体结合试验、放射性免疫测定等。
免疫荧光试验是通过将荧光标记的抗体与患者血清中的特定抗原结合来进行检测。
这种试验通过荧光显微镜观察，能够快速、准确地确定特定抗原的存在。
免疫荧光试验常用于检测自身免疫性疾病（如系统性红斑狼疮、类风湿关节炎等）、传染病（如流感、结核等）以及其他感染性疾病。
酶联免疫吸附测定法（ELISA）是一种常用的血清学试验方法，通过特定抗原与特异性抗体的结合反应，利用酶标记进行检测。
这种试验可以快速、高效地检测出特定抗原或抗体的存在，并且具有较高的灵敏度和特异性。
ELISA广泛应用于病毒、细菌、肿瘤和药物等领域的疾病诊断、防控和治疗监测。
中和试验是一种用于检验抗体对病原体的中和作用的方法。
病原体感染机体后，机体产生相应的抗体，通过中和试验可以评估抗体对病原体的中和能力。
这种试验广泛应用于检测病毒感染，如乙型流感病毒、登革热病毒等。
补体结合试验是一种通过观察抗体与特定抗原结合而激活补体的反应，来检测体内特定抗体的存在与水平。
这种试验可以用于包括传染病、自身免疫性疾病、过敏反应等多种疾病的诊断和监测。
放射免疫测定是利用放射性同位素标记的抗体对抗原或抗体进行测定的方法。
这种试验具有高灵敏度和高特异性特点，可以用于检测病毒感染、肿瘤标志物、免疫系统疾病、肝肾功能等疾病的诊断、治疗和监测。
除了上述几种常见的血清学试验，还有其他一些血清学试验，如凝集试验、间接血凝试验、免疫电泳等。
这些方法在不同的疾病诊断和监测中具有重要的应用价值。
总之，血清学试验是一种重要的医学检验方法，通过检测患者血液中的抗体或抗原来诊断和监测疾病的发生和发展情况。
根据不同的疾病类型和检测目的，可以选择合适的血清学试验方法，以提供准确的诊断结果，并指导临床治疗和预后评估。
免疫血清学技术
荧光色素
是能够产生明显荧光，并能作为染料使用 的有机化学物称为荧光色素或荧光染料。
可用于标记的荧光素有异硫氰酸荧光素 (FITC)、四乙基罗丹明(RB 200)和四甲基 异硫氰酸罗丹明(TRITC)
染色原理及方法
FITC含有异硫氰基，能与IgG分子自由基 结合，形成FITC-IgG复合物，且不影响结 合抗原的能力和特异性，因此，当荧光抗 体与抗原结合后形成有荧光性的抗原抗体 复合物
高敏感性的标记分子
荧光素 酶分子 放射性同位素
荧光抗体技术 酶标抗体技术 同位素标记技术
（一）荧光抗体标记技术
fluorescent-labelled antibody technique
是指用荧光素对抗体或抗原进行标记，然 后用荧光显微镜观察所标记的荧光以分析 示踪相应的抗原或抗体的方法。
抗原可以是多糖、蛋白质、类脂等，抗原分 子较小，单位体积内所含的量多，与抗体结 合的总面积大，故在作定量试验时，为了不 使过剩，通常稀释抗原，并以抗原稀释度作 为沉淀试验效价。
参加沉淀试验的抗原称沉淀原，抗体称为沉 淀素。
环状沉淀试验
在小口径试管内先加入已知抗血清，然后小心沿管壁 加入待检抗原于血清表面，使之成为分界清晰的两层
SPA与IgG结合后，其Fab片暴露于外，并保持其抗体 活性。
当此被覆着特异性抗体的葡萄球菌与相应的抗原结合 时，就可互相连结引起协同凝集反应，简称COAG。
（二）沉淀试验
可溶性抗原(如细菌的外毒素、内毒素、菌 体裂解液，病毒的可溶性抗原、血清、组 织浸出液等)与相应抗体结合，在适量电解 质存在下，形成肉眼可见的白色沉淀，称 为沉淀试验(precipitation test)。
用于标记的酶
用于标记的酶有辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP)、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶
血清学原理
血清学原理
血清学原理是一种用于检测人体血清中特定抗体和抗原的方法。
它基于免疫学原理，即人体对入侵病原体产生特异性的免疫应答。
当病原体侵入人体后，免疫系统会产生相应的抗体来抵御病原体的进一步感染。
血清学原理中常用的方法是血清中特定抗体与抗原结合的反应。
抗体是免疫系统产生的一种蛋白质，具有特异性，可以识别并结合特定的抗原。
当特定抗原存在于血清中时，与之相应的抗体会结合在一起形成抗原-抗体复合物。
这种结合反应可以通
过使用不同的实验技术来进行检测。
常见的血清学实验技术包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、间
接免疫荧光试验（IFA）和凝集反应。
这些方法可以用于检测
多种病原体，如细菌、病毒和寄生虫等。
通过测量抗原-抗体
复合物的形成或凝集反应的程度，可以确定血清中是否存在特定的抗体和抗原。
这可以用于诊断疾病、监测免疫应答、评估免疫状态以及筛查疫苗的有效性。
血清学原理在医学和流行病学研究中具有重要的应用价值。
它不仅能够帮助医生确定疾病的类型和严重程度，还可以追踪病原体的传播途径和感染人群的免疫状况。
此外，血清学原理还可以用于血型鉴定、移植匹配和妊娠筛查等领域。
总之，血清学原理是一种重要的免疫学方法，通过检测血清中的特定抗体和抗原，可以为疾病诊断、流行病学研究和其他医学应用提供有价值的信息。
免疫学课件：免疫血清学技术
抗体的生物学功能
抗体具有中和毒素、调理吞噬、介导炎症反应等 多种生物学功能。
抗原抗体结合机制
锁钥学说
ห้องสมุดไป่ตู้01
抗原与抗体结合就像锁和钥匙一样，具有高度的特异性和互补
性。
诱导契合学说
02
抗原与抗体在结合过程中，会发生构象变化，使得两者更加紧
力。
抗原的特异性
抗原与相应抗体或致敏淋巴细胞发 生特异性结合的物质基础。
抗原的分类
根据抗原性质不同，可分为完全抗 原和不完全抗原。完全抗原具有免 疫原性和特异性，而不完全抗原仅 具有特异性。
抗体结构与功能
1 2 3
抗体的基本结构
由四条多肽链组成，包括两条重链和两条轻链， 通过二硫键连接。
抗体的功能区域
密地结合在一起。
多重识别机制
03
抗原抗体结合不仅依赖于锁钥关系或诱导契合，还涉及到电荷、
疏水作用等多重因素。
03 免疫血清制备技术
动物选择与免疫方案
动物选择
选用健康、适龄、免疫原性强的实验动物，如兔、马、羊等 。
免疫方案
根据实验需求和免疫原性质，制定合适的免疫程序，包括免 疫剂量、免疫途径、免疫次数和间隔时间等。
补体结合实验方法
补体结合试验（CFT）
在补体参与下，用已知抗原或抗体检测未知抗体或抗原的方法。该方法具有较高的敏感性和特异性。
间接补体结合试验
先用已知抗原致敏红细胞，再加入待检血清中的相应抗体，最后加入补体，观察红细胞是否溶解来判 断结果。该方法常用于检测某些病毒、立克次体等微生物的抗体。
血清学试验方法
血清学试验方法
血清学试验是检测正常与异常血清中各种物质含量的一种快速、有效、简便可靠的实
验技术。
该技术应用于实验室免疫学、血液学诊断等多个领域，提供了有效的检测方法。
下面就血清学实验方法给出介绍。
血清学实验的基本步骤是以下几方面：
1.采集样本。
血清的实验首先要求从血液或淋巴液中采集标本，以获得质量合格的血清。
2.血液凝固剂的使用。
凝固剂的选择主要有EDTA，但也可以使用不同的凝固剂，以获得有效的凝固液。
3.血清分离。
血清分离可以使用重力离心分离法，也可以以压力法等不同方法进行。
4.血清实验。
血清学实验检测方法有标准曲线法、测定法、免疫分析仪等。
5.结果分析。
完成实验后应对结果进行批判性评价，以确定是否有致病和疾病发生的
可能性，并给出临床决策的依据。
1.标本的正确采集。
准确的标本采集，是影响血清实验结果真实性的关键因素。
2.标本有效保存和运输。
标本在运输过程中未受到影响，实验结果才是可靠的。
3.标本清洗。
标本清洗是影响分离血清中固体颗粒和杂质的关键步骤。
4.分离血清。
血清的有效分离是血清学实验的基础。
5.实验检测方法的确定。
选择正确的实验检测方法，是保证实验质量可靠的关键因素。
6.实验结果的数据处理。
对实验结果的数据处理是对实验结果的成败关键。
7.结果报告的审核签发。
审核签发表明结果的可信度，保障研究成果的准确性。
临床分析中的血清学检测与自身免疫疾病诊断
临床分析中的血清学检测与自身免疫疾病诊断在临床医学领域中，血清学检测在自身免疫疾病诊断中扮演着至关重要的角色。
通过检测血清中的特定抗体、免疫球蛋白、自身抗体等指标，可以帮助医生确定患者是否存在自身免疫疾病，并辅助制定诊断和治疗方案。
一、自身免疫疾病概述自身免疫疾病是免疫系统异常激活导致的一类疾病，其特点是机体免疫系统攻击自身正常组织、器官和细胞，导致炎症、损伤和功能异常。
常见的自身免疫疾病包括类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、自身免疫性甲状腺疾病等。
二、血清学检测的优点血清学检测作为一种无创的检测方法，具有以下优点：1. 高度敏感性：血清学检测可以提供非常低浓度的抗体或自身抗体的检测结果，帮助医生发现疾病早期的免疫异常。
2. 高度特异性：血清学检测可以检测特定的抗体、免疫球蛋白或自身抗体，对于不同的自身免疫疾病具有较高的特异性。
3. 可重复性：血清学检测结果可以进行重复性验证，提高了结果的可信度和准确性。
4. 非侵入性：血清学检测只需要抽取少量的血液样本，不需要进行组织取样或手术，对患者较为温和。
三、常用的血清学检测指标1. 抗体水平：通过检测特定抗体的水平，可以确定某些自身免疫疾病的诊断。
例如，类风湿因子（RF）是类风湿关节炎的标志性抗体，其水平可以用于诊断和监测该疾病。
2. 免疫球蛋白：血清中的免疫球蛋白，如免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白A（IgA）等，其水平的变化可以反映免疫系统的异常激活和炎症状态，对自身免疫疾病的诊断和监测具有重要意义。
3. 自身抗体：某些自身免疫疾病特有的自身抗体，如抗核抗体（ANA）在系统性红斑狼疮中的诊断有重要意义。
检测这些自身抗体的阳性结果可以帮助医生更好地判断疾病类型和严重程度。
四、血清学检测在自身免疫疾病诊断中的应用1. 早期诊断：血清学检测可以帮助医生在自身免疫疾病的早期发现和诊断中起到关键作用。
通过检测特定抗体或自身抗体的存在与水平，可以帮助医生尽早判断疾病患病情况，从而采取相应治疗措施。
检验科常见免疫血清学检测方法与解读
检验科常见免疫血清学检测方法与解读【检验科常见免疫血清学检测方法与解读】免疫血清学检测是一种通过检测血液中的抗体和抗原来诊断疾病的方法，广泛应用于临床实践中。
本文将针对检验科常见的免疫血清学检测方法进行介绍，并解读其结果。
一、酶联免疫吸附试验（ELISA）酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）是目前应用最为广泛的免疫血清学检测方法之一。
ELISA通过将待检测的抗体或抗原与酶标记的二抗结合，通过酶的催化作用得到显色反应来分析样本中的抗体或抗原含量。
在进行ELISA检测时，首先需要将样本与特异性抗体或抗原进行反应，随后进行多个洗涤步骤来去除非特异性结合的物质。
然后，加入酶标记的二抗与待测样本中的特异性抗原或抗体进行结合。
最后，加入底物，通过酶的催化作用使底物发生显色反应。
二、免疫荧光分析（IFA）免疫荧光分析（ImmunoFluorescence Assay，IFA）是一种通过使用荧光标记的抗体或抗原来检测目标物质的方法。
根据检测物质的不同，可以分为直接免疫荧光分析和间接免疫荧光分析。
直接免疫荧光分析是将荧光标记的抗体直接与待检测样本中的抗原发生特异性结合，然后使用荧光显微镜观察是否有荧光信号产生。
而间接免疫荧光分析则是先使用未标记的特异性抗体与待测样本中的抗原结合，随后再加入荧光标记的二抗与第一抗体发生结合，从而观察是否有荧光信号产生。
三、免疫印迹分析（Western Blot）免疫印迹分析（Western Blot）是一种用于检测抗体和抗原之间的特异性结合的方法。
在进行免疫印迹分析时，首先将待检测样本中的蛋白质经过电泳分离，然后转移到膜上。
随后，将荧光标记的抗体与待测样本中的抗原进行特异性结合，通过荧光显影或其他检测方法观察是否有特异性的蛋白带出现，从而判断抗体和抗原的结合情况。
四、血凝试验（Coagulation Test）血凝试验是一种通过检测血液中凝血因子的活性来评估凝血功能的方法。
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高，约为10μg／ml。
（四）火箭电泳 Rocket Electrophoresis
又称免疫扩散，是把单向免疫扩散同电 泳结合在一起的方法。抗原在含有定量抗体 的琼脂中泳动，两者比例适宜时，在较短时 间内生成锥形的沉淀峰。在一定浓度范围内， 沉淀峰的高度与抗原含量成正比。此法的特 点是需时较短，故可用于快速沉淀标本中抗 原的含量。
SPA--(Fc)IgG(Fab)--Ab
SPA：staphylococcal protein A
（二）正向间接血凝试验
血凝试验强度
Patient
1 2 3 4 5 6 7 8
正向间接血凝试验
1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 Pos. Neg.
第五章 免疫血清学 检验技术
第一节 凝集与沉淀反应 第二节 放射免疫测定技术 第三节 免疫荧光技术 第四节 酶免疫测定 第五节 固相膜免疫测定
第一节 凝集与沉淀反应
一、 凝集反应及其特点
凝集反应： 细菌、螺旋体、红细胞或细胞性抗原等
颗粒性抗原，或可溶性抗原（或抗体）与 载体颗粒结合成致敏颗粒后，它们与相应 抗体（或抗原）发生特异性反应，在适当 电解质存在下，形成肉眼可见的凝集现象。
凝胶沉淀反应
双向琼脂 扩散试验
琼脂扩散试验
单向琼脂 扩散试验
对流免疫 电泳试验
（一）单向琼脂扩散试验
制成含有适宜抗体浓度的琼脂凝胶板。 以适当距离打孔，孔中加入可溶性抗原。抗 原向周围扩散，当抗原与抗体比例适宜时， 在琼脂中形成抗原－抗体复合物的晶格和沉 淀。沉淀环的直径与抗原浓度呈正相关。
扩散圈出现呈两重沉淀环的双环现象， 表明存在但抗原性相同，而扩散率不同的两 种组分。
检测细菌、病毒、寄生虫等感染后产 生的抗体。
四、自身红细胞凝集试验
未经致敏的受检 者新鲜红细胞 试剂：抗人O型 红细胞的单克隆 抗体 临床应用：HIV 检测、HBV检测
五、 抗球蛋白试验（Coombs试验）
（一）直接Coombs试验 检测红细胞上的不完全抗体
（二）间接Coombs试验 检测血清中的不完全抗体
临床应用： 肥达氏试验：伤寒副伤寒 外裴二氏试验：斑疹伤寒 Wright test:布鲁菌病 交叉配血试验
三、 间接凝集反应
间接凝集反应(indirect agglutination)： 将可溶性抗原或抗体吸附于颗粒性载体
表面，然后与相Leabharlann 的抗体或抗原反应，在电 解质的作用下，出现肉眼可见的凝集现象。 载体种类： RBC（醛化）；聚苯乙烯胶乳颗粒（羧化）； 金黄色葡萄球菌。
凝集反应过程： 抗原抗体的特异性结合 出现肉眼可见的凝集现象
凝集反应特点： IgM的作用比IgG大数百倍 IgG与抗原结合后，常不出现凝集现象， 称不完全抗体
临床意义： 进行细菌的抗原分析、鉴定及分型，也 可应用已知细菌检查未知血清的抗体。
多克隆抗体
肌红蛋白
单克隆抗体
上清液
肉眼可见的凝集现象
二、 直接凝集反应
Titer
64 8
512 <2 32 128 32
4
（三）反向胶乳凝集试验
（四）明胶凝集试验
将病毒抗原或重组抗原吸附于粉红色 明胶颗粒上，当致敏颗粒与样品血清作用 时，若血清含有抗病毒抗体则可形成肉眼 可见的粉红色凝集
（五）间接凝集反应的应用
抗原的检测 反向间接凝集试验可用于检测病原体
的可溶性抗原，也可用于检测各种蛋白质 成分。 抗体的检测
（一）间接凝集反应的类型 1、正向间接凝集试验
用抗原致敏载体--检测抗体
2、反向间接凝集试验
用抗体致敏载体----检测抗原
3、间接凝集抑制试验
用抗原致敏载体--检测抗原
4、协同凝集试验 coagglutination test：以金黄色葡萄球菌 菌体为反应的载体。人及多种哺乳动物（猪、 兔、豚鼠等）血清中IgG抗体的FC段与菌体 表面的A蛋白（SPA）非特异性结合后，IgG 的两个Fab段仍然暴露在菌体表面，保持着 结合抗原的活性和特异性。当与特异性抗原 相遇时，能出现特异的凝集现象。
三孔型双向免疫扩散可能的结果
（三）对流免疫电泳试验
概念: 在电场中进行的双向免疫扩散。 原理: 将抗原加至近阴极孔内，抗体加至
近阳极孔内。抗原与抗体在pH 8.6的缓冲 液中均带负电荷，通电后，抗原因带负电 荷向阳极泳动，而抗体球蛋白等电点高， 所带负电荷少，加之分子量较大，向阳极 的位移小于受电渗作用向阴极的位移，形 成抗原抗体相向移动。二者结合，在比例 适宜处形成白色沉淀线。
六、沉淀反应 precipitation reaction
可溶性抗原(如细菌、外毒素、血清 蛋白等)与相应抗体特异性结合后，在一 定条件(适量的电解质、合适的酸碱度和 温度)下，经一定时间，于比例合适处形 成肉眼可见的沉淀现象。
环状沉淀反应
液体内沉淀反应 絮状沉淀反应
沉
淀
免疫浊度测定
反
应
免疫电泳
火箭电泳示意图
第二节 放射免疫测定技术
早期的放射免疫技术是基于竞争性结合反应 原理的放射免疫分析(RIA)，稍后又发展了 非竞争性结合的免疫放射分析(IRMA)。该类 技术具有灵敏度高、特异性强、重复性好、 样品及试剂用量少、操作简便且易于标准化 等优点，广泛应用于生物医学研究和临床诊 断领域中各种微量蛋白质、激素、小分子药 物和肿瘤标志物的定量分析。
直接凝集反应(direct agglutination)： 颗粒性抗原直接与抗体结合，在电解
质的作用下，出现肉眼可见的凝集现象。
（一）玻片凝集试验
+
方法评价: 定性试验 简便和快速 敏感度低
临床应用: 菌种鉴定 血清学分型 血型鉴定
（二）试管凝集试验
方法评价： 半定量试验 简便、快速 敏感度低 可有假阳性
大分子抗原和长时间扩散（＞48h）：C=k×d2 小分子抗原和较短时间（24h）：logC=k×d
（二）双向琼脂扩散试验
可溶性抗原与相应抗体在含适量电解 质的琼脂凝胶板的对应孔中，各自向四周 扩散，若两者分子比例适当，则在扩散的 一定时间后在两孔之间相遇并生成白色沉 淀线。
加入定量的抗体在中间孔，按一定距离在 四周打数个小孔，分别加入不同稀释度的 抗原可见粗细不等的沉淀线，从而可判定 抗原的效价。