聚氨酯泡沫固定产脂肪酶粗状假丝酵母_CandidavalidaT2_细胞的研究
假丝酵母99-125脂肪酶喷雾干燥工艺及催化性质的研究
Ａｂｓｒ ｔ Ｔｈ ｒ ｃ ｓ ｏ ｄｔｏ ｏ ｐ ａ ｒｉ ｇ ｏ ｎ ｉ ａ ｓ ９ ～１ ５ ｉａ ｅ ｗａ ｐ ｉ ｚ ｄ ｂ ｅ ｔ ａｃ ： ｅ ｐ ｏ ｅ ｓ ｃ ｎ ｉ ｎ ｆ ｒｓ ｒ ｙ ｄ ｙｎ ｆ Ｃａ ｄ ｄ ｐ． ９ ｉ ２ ｌ ｓ ｓ ｏ ｔ ｐ ｍｉｅ ｙ ａ ｒ —
Ｐ ＡＮ ｅ，ＴＡＮ ａ ｗｅ Ｘｕ Ｔｉｎ— ｉ
（ ｅ ｉ ｅ ａ ｏａ ｒ ｏ Ｂ ｏ ｒｃｓ ， ｏ ｅｅｏ ｉ ｃ ｎ ｅａ ｄＴ ｃ ｎ ｌｇ ， ｅ ｉ ｎｖ ｒ ｔ ｏ Ｃ ｅ ｉ ｌ Ｂ ｉｎ Ｋ ｙＬ ｂ ｒ ｏ ｆ ｉ ｏｅ ｓ Ｃ ｌ ｇ ｆ ｆ Ｓ ｉ ｃ ｎ ｅ ｈ ｏ ｙ Ｂ ｉｎ Ｕ ｉ ｓ ｙ ｆ ｈ ｍ ｃ ｊｇ ｔｙ ｐ ｌ Ｌｅ ｅ ｏ ｊｇ ｅ ｉ ａ Ｔ ｃ ｎ ｌｇ ， ｅ ｉｇ１ ０ ２ ， ｈｎ ） ｅ ｈ ｏ ｙ Ｂ ｉｎ ０ ０ ９ Ｃ ｉ ｏ ｊ ａ
肪 酶 活 力 收 率 的 影 响 。确 定 了 最佳 啧 雾条 件 ： 护 剂为 １ 保 ０～ｌ Ｌ的 阿拉 伯 胶 ， 口温 度 ｌ５～１０ｏ 雾 化 速 度 ５ 进 １ ２ Ｃ， ０ ４Ｌ ｈ 可得 到 收 率 最 高为 ６ ． ％ 的脂 肪 酶 酶 粉 。 制 得 的 固 定 化 酶 用 于手 性 拆 分 （ ， ） 一 乙醇 ， 学 产 率 最 ． ／ ， ０５ Ｓ 一１ 苯 光 高可 达 到 ５ ． ％ ； 于催 化 合 成 生物 柴 油 ， ３６ 用 转化 率 最 高 可 达 到 ９ ． ％ 。 在 ４ ３ ℃ 下 密 封 保 存 ， 衰期 可 分 别 达 到 ０２ 、Ｏ 半
第 ８卷 第 ２期 ２１ ００年 ３月
生
物
加
工
过
程
Ｖｏ Ｎｏ． Ｌ８ ２
酶工程第三章酶的生物合成法生产2013-2
的pH值往往会发生变化。
糖代谢
pH下降：糖分解为小分子酸、醇 pH上升：糖缺乏
基质的代谢
氮代谢
pH下降：氨基酸中的-NH2被利用 pH上升：尿素被分解成NH3
硫酸铵 尿素 磷酸盐
pH下降：铵离子被利用，硫酸根积累 pH上升后下降：尿素→氨→ 氨被同化 对pH有缓冲作用
产物形成：氧不足时，代谢积累有机酸，使pH下降。
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2、 细胞产酶最适pH值与生长最适pH值往往不同。 细胞生产某种酶的最适pH值通常接近于该酶催化反应 的最适pH值。 碱性蛋白酶：碱性（pH 8.5~9.0） 中性蛋白酶：中性或微酸性（pH 6.0~7.0）， 酸性蛋白酶：酸性（pH 4~6）
例外：有些酶在其催化反应的最适条件下，产酶细胞的生 长和代谢可能受到影响 如枯草杆菌碱性磷酸酶，其催化反应的最适pH值为 9.5，而其产酶的最适pH值为7.4
酶、纤维素酶和木聚糖酶
7
二、植物细胞
主要用于色素、药物、香精和酶等初级代谢产物的生产。
酶
产酶植物细胞 年份
酶
产酶植物细胞 年份
糖苷酶
胡萝卜细胞 1981
糖化酶
甜菜细胞 1989
半乳糖苷酶 紫苜蓿细胞 1982 苯丙氨酸裂合酶 花生细胞 1990
漆酶
假挪威械细胞 1983
大豆细胞
过氧化物酶 甜菜细胞 1983 木瓜蛋白酶
55
三、温度的调节控制
1、温度确定原则
细胞生长的最适温度
细菌37℃
霉菌和放线菌28-30℃
嗜热微生物40-50℃
提高mRNA的稳定性
细胞产酶最适温度 往往低于细胞生长最适温度
增加酶的产量和酶的稳定性
温度不能过低，否则生化反应速度慢， 降低酶的产量
蜡样芽孢杆菌发酵产脂肪酶的分批发酵动力学
蜡样芽孢杆菌发酵产脂肪酶的分批发酵动力学欧志敏;马兰【摘要】对蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus CGMCC No.12336发酵生产脂肪酶的动力学模型进行了研究.分别测定了B.cereus CGMCC No.12336发酵过程中菌体细胞质量浓度、脂肪酶的活性浓度和还原糖的质量浓度,运用Logistic,Luedeking-Piret等方程对实验数据进行了非线性拟合,阐明了B.cereus CGMCC No.12336分批发酵过程中菌体细胞生长、产物合成和基质消耗的动力学模型并拟合得到了动力学参数.为检验动力学模型的可靠性,对得到的模型进行了实验验证.结果表明:动力学模型与实验数据拟合良好,能较好地描述B.cereus CGMCC No.12336分批发酵过程的动力学特征.【期刊名称】《发酵科技通讯》【年(卷),期】2017(046)001【总页数】5页(P1-5)【关键词】蜡样芽孢杆菌;脂肪酶;分批发酵;动力学模型【作者】欧志敏;马兰【作者单位】浙江工业大学药学院,浙江杭州310014;浙江工业大学药学院,浙江杭州310014【正文语种】中文【中图分类】TQ92微生物脂肪酶作为有机合成中一种重要的生物催化剂,可以用来催化水解、氨解和醇解等反应[1],且具有区域选择性、底物专一性、成本低、反应条件温和[2]、环境友好、对映选择性高以及不需要辅酶等优点[3],在手性药物的合成、生物传感器和食品加工等领域具有广泛的应用[4].来源于微生物的脂肪酶一般为胞外酶,并且具有相对比较广泛的温度和pH作用范围[5],因此微生物脂肪酶更适用于工业生产和应用,随着非水相酶学、固定化技术[6]和界面酶学等生物技术的发展[7],微生物脂肪酶被越来越广泛地应用.目前对微生物发酵产脂肪酶的研究多在菌种筛选、发酵条件优化和脂肪酶的分离纯化等方面,而对脂肪酶发酵动力学的研究较少.以从土壤中筛选到的B. cereus CGMCC No.12336作为出发菌株,在优化该菌株发酵条件的基础上,研究其动力学特征.运用Logistic,Luedeking-Piret等方程,用软件模拟动力学方程,获得了菌体细胞生长、脂肪酶的生成和基质消耗的动力学模型曲线及动力学参数,为以后放大实验、工业化生产的优化与控制提供了可靠的实践基础和理论依据[8].1.1 菌种浙江工业大学校园土壤中筛选得到的B. cereus CGMCC No.12336,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心.1.2 材料斜面固体培养基(g/L):酵母粉5,蛋白胨2,葡萄糖9,琼脂20.发酵培养基(g/L):酵母粉5,蛋白胨2,氯化钠2,硫酸镁0.5,葡萄糖9,磷酸二氢钾2,磷酸氢二钾2.主要化学试剂:(R)-(-)-扁桃酸、(R)-(-)-扁桃酸乙酯,上海笛柏化学品技术有限公司.1.3 培养条件发酵培养:250 mL的锥形瓶中含有发酵培养基100 mL,培养获得的种子液按体积分数10%的接种量接种至锥形瓶中,然后置于温度30 ℃和转速180 r/min的恒温摇床上培养38 h.1.4 分析方法1) 菌体质量浓度的测定:发酵液8 000 r/min离心10 min,离心得到的湿菌体用蒸馏水洗两次,然后置于已称重的坩埚中,于80 ℃的恒温干燥箱中烘干至恒重,称重[9].细胞质量浓度以细胞干重计算.2) 酶活测定:取1 mL发酵液,加入20 mmol/L(R)-(-)-扁桃酸乙酯,于30 ℃,180r/min恒温摇床上反应4 h后,高效液相色谱(HPLC)分析测定其转化率[10].色谱条件为:色谱柱是反相C18柱(0.46 mm×250 mm),流动相是由水(含有3.0 mmol/L CuSO4和6.0 mmol/L L-苯丙氨酸)和甲醇构成,体积比为90∶10,流速是0.5mL/min,UV检测波长是300 nm[11].本研究中单位酶活定义为每小时转化1 mmol(R)-(-)-扁桃酸乙酯生成相应的(R)-(-)-扁桃酸所需要的酶量为l U.3) 还原糖含量测定:DNS法[12].4) 试验数据的获得:摇瓶中发酵培养B. cereus CGMCC No.12336,每2 h取一次样,测定菌体细胞干重、脂肪酶活性浓度和还原糖质量浓度在不同时间段的数据,每组都做3次平行实验,求平均值.1.5 数据处理采用Origin 8.0软件对实验获得的数据进行非线性拟合,得出发酵动力学模型及动力学参数[13].1.6 构建发酵动力学模型的理论1.6.1 菌体生长模型用Monod方程可以描述菌体细胞的生长,但Monod方程所描述的是均衡生长的模型,实际上分批发酵的过程比较复杂,不能将菌体质量浓度及底物对生长的限制忽略,所以菌体细胞生长模型用Monod方程来表述并不适合[14].在发酵过程中,随着菌体质量浓度的不断增加,会抑制菌体细胞的生长,对此有较好描述的是Logistic方程[15],所以拟合菌体细胞生长过程使用的是Logistic方程[16].Logistic方程为以t=0时,X=X0为初始条件,式(1)积分后,可得式中:X为细胞质量浓度(干重);X0为初始细胞质量浓度(干重);Xm为最大细胞质量浓度(干重);μm为最大比生长速率;t为发酵时间.求得参数X0,Xm,μm值即可完成上述模型.1.6.2 产物生成动力学模型在发酵过程中,基于菌体生长与产物生成的关系,Gaden将产物的生成分为三类[17]:1) 产物的生成和菌体细胞的生长是相耦联的,即两者之间存在直接相关的关系;2) 产物的生成和菌体细胞生长的关系是部分耦联的,即两者存在的仅仅是间接的关系;3) 产物的生成与菌体细胞的生长无联系,即两者不相关.从图1中得出:脂肪酶的活性浓度是随着菌体细胞质量浓度的增加而增加的,但在发酵末期菌体细胞的生长进入了稳定期,菌体细胞的质量浓度基本上是不变的,但脂肪酶活性浓度还是在继续上升的,由此可以得出脂肪酶的产生过程是生长部分耦联型.Leudeking-Piret方程用来表述产物合成过程[18],即式中:α≠0,β≠0表示的是生长部分耦联;α≠0,β=0表示的是生长耦联;α=0,β≠0表示的是非生长耦联.将式(1)代入式(3),以t=0时,P=0为初始条件,积分后得式中:α是和生长有关的产物合成参数;β是和生长无关的产物合成参数.求参数α,β的值即可建立产物生成动力学模型.1.6.3 基质消耗动力学模型在分批发酵过程中,底物为葡萄糖,主要用于菌体细胞的生长,菌体细胞维持生命的能量消耗和产物的合成[19].由于产物的合成与菌体生长存在关系是呈部分相关的,因此可以使用类似于Leudeking-Piret的方程来表述基质消耗的模型[20],即分批发酵过程中,由于产物的生成和菌体细胞的生长是部分相关的关系,即底物的消耗和产物的生成相关关系是间接的,因此可以假设很小的一部分基质是用于产物合成的,是可以忽略的,即葡萄糖主要用于菌体细胞代谢的维持和菌体细胞生长[21].式(5)可以写为将式(1)代入式(6)积分后得式中:S为基质质量浓度;S0为发酵初始葡萄糖质量浓度;m为细胞的维持系数;YX/S 表示菌体对底物的得率系数;YP/S表示产物对底物的得率系数.求得参数S0,YX/S,m的值即建立基质消耗动力学模型.2.1 脂肪酶发酵过程代谢变化特征由图1可知:0～6 h是菌体细胞生长的适应阶段,菌体生长缓慢,耗糖量较少,脂肪酶活性浓度也很低;6～18 h菌体细胞快速增长,菌体生长处于对数生长期,耗糖量明显上升,脂肪酶活性浓度也随着菌体量增加而快速上升;18～30 h菌体量继续增加,并在30 h时达到最高值5.21 g/L,发酵液中葡萄糖质量浓度下降减慢且处于较低水平,但脂肪酶活性浓度持续增加;30 h后细胞生长进入稳定期,发酵液中菌体和葡萄糖质量浓度几乎不变,但脂肪酶活性浓度还继续升高,于38 h达到峰值为767 U/L.并由图可知：细胞生长曲线大致为S形,葡萄糖消耗曲线则是反S形,脂肪酶的合成与菌体细胞的生长呈部分耦联的关系.2.2 菌体生长动力学模型在菌体细胞生长动力学研究过程中发现,菌体细胞在经过短暂的迟缓期后,进入对数生长期,之后趋于稳定(图1).用Logistic方程描述菌体细胞生长过程,用origin软件对实验所得的数据进行非线性拟合,得到了模型和参数值(表1).图2为菌体生长动力学模型拟合结果(R2=0.994),由拟合结果可知：B. cereus CGMCC No.12336的生长发酵过程可以用该模型进行较好地表述[22],即菌体细胞生长速率模型为2.3 脂肪酶合成动力学模型脂肪酶合成过程用Leudeking-Piret方程来描述,使用origin软件对实验数据进行非线性拟合,得到了模型和参数值(表1).图3为产物合成模型拟合结果(R2=0.998),由此可知模型能较好地描述产物合成过程,即脂肪酶合成速率模型为2.4 基质消耗动力学模型在发酵过程中,葡萄糖主要用于细胞生长和代谢的维持,用origin软件对其进行非线性拟合,得到了模型和参数值(表1),图4为基质消耗模型拟合结果(R2=0.997).由此可知葡萄糖消耗情况可以用该基质消耗模型较好地表述,即基质消耗速率模型为2.5 拟合曲线分析为检验模型的可靠性,在相同发酵条件下进行3次重复实验,对比实验的平均值与模型预测值[23],表2为比较结果.由表2可以看出:实验平均值与模型预测值两者之间的相对误差大部分都是在±10%以下,但在菌体细胞生长的迟缓期、脂肪酶合成的初期和基质消耗的末期相对误差已大于10%,可能是因为菌体发酵过程复杂,难以控制发酵初期菌体细胞质量浓度和发酵末期葡萄糖的质量浓度,导致低浓度区域相对误差较大,但总体上对发酵结果的影响不大,拟合结果较好.由验证结果可知,B. cereus CGMCC No.12336的分批发酵的过程能很好地用该发酵动力学模型来描述.运用非线性拟合得到了B. cereus CGMCC No.12336分批发酵过程中菌体细胞生长、脂肪酶的生成和基质消耗的动力学模型.脂肪酶发酵过程用该模型能够较好地描述,模型的预测值能够较好地拟合实验值.因此,该模型可以用来预测脂肪酶在发酵过程中浓度变化,优化控制发酵过程,为进一步放大实验和规模化生产奠定基础.【相关文献】[1] 兰立新,肖怀秋.微生物脂肪酶应用研究进展[J].安徽农业科学,2010,38(14):7547-7548.[2] 林春绵,杨浩,魏敏,等.丙烯腈降解菌的筛选及应用研究[J].浙江工业大学学报,2015,43(5):527-531.[3] 张开平,惠明,田青,等.微生物脂肪酶的应用领域及研究进展[J].河南工业大学学报,2012,33(1):90-94.[4] 李宇辉,刘成江,王俊钢,等.微生物脂肪酶的性质及应用研究现状[J].食品工业,2013,34(9):162-165.[5] 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聚氨酯组成及结构的分析方法
1.1 异氰酸酯结构分析 最常应用的异氰酸酯为 TDI、MDI 等芳香族
异氰酸酯，但要避免黄变问题则用 HDI 等脂肪族 异氰酸酯、IPDI 等脂环族异氰酸酯。异氰酸酯的 反应活性极高，因为容易和空气及溶剂中的水分 反应而自己固化，所以检测时通常用脱水甲醇等 氨酯化，变成安定的化合物后用 IR(红外光谱)， 1H–NMR、13C–NMR(核 磁 共 振)，GC(气 相 色 谱) 或 GC–MS(色质联用)等方法测定。
决定聚氨酯亲水性/疏水性的主链中 EO 的含 量可用 1H–NMR、NIR(近红外光谱) 法定量。用 NIR 法，有报道可同时测定 EO 含量、羟值、伯 羟基/仲羟基比例。
Mr 分 布 可 用 GPC 测 定。 但 Mr ＜2 000 的 PPG 系聚醚多元醇，可用 MS 测定，因为其能测 定每个分子的 Mr，所以可解析起始剂的种类和 PO、EO 独特的分布。
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化学推进剂与高分子材料 Chemical Propellants & Polymeric Materials
2011年第 9 卷第 3 期
微生物脂肪酶的纯化方法概述
微生物脂肪酶的纯化方法概述摘要：脂肪酶是一种重要的工业用酶，广泛应用于食品、精细化工、医药和能源等领域。
脂肪酶最主要的来源是通过微生物发酵生产。
本文综述了脂肪酶性质及应用，微生物脂肪酶的常规纯化方法和新型纯化方法，并展望了脂肪酶分离纯化的研究方向及前景。
关键词：微生物脂肪酶；纯化；常规分离纯化技术；新型分离纯化技术1.脂肪酶概述脂肪酶是一类特殊的酞基水解酶，其天然底物是油脂，主要水解由甘油和12碳原子以上的不溶性长链脂肪酸形成的甘油三酯，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。
同时还催化其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、氨解、酯化、转酯化以及酯类逆向合成反应。
1.1脂肪酶的结构与性质在现代生物工程技术的参与下，人们对脂肪酶的结构研究也不断深入。
研究表明，脂肪酶是一种“丝氨水解酶”。
其活性中心都存在His-X-Y-Gly-Z-Ser-W-Gl或Y-Gly-His-Ser-W-Gly(W、X、Y、Z指非特异性氨基酸)相同或相似的一级结构氨基酸序列，在此基础上，His、Ser与另一种氨基酸残基(如CCL和GCL的Glu、RML和hPL的Asp等)一起构成脂肪酶催化活性中心的三元组；从结构功能的角度，脂肪酶中的丝氨酸-OH基既具有底物结合作用，又具有催化作用。
与大多数酶一样，脂肪酶的本质仍然是蛋白质，其氨基酸组成数目从270-641kd 不等，分子量处于25一100kd之间，等电点(Pl)在4-5之间不等。
脂肪酶的催化性质主要表现在催化甘油三酯的水解、催化酯交换和催化拆分手性化合物三个方面。
在催化油脂水解的反应中，脂肪酶表现出一定的脂肪酸特异性，其主要催化带12个碳原子以上的长链脂肪酸的甘油三酷，该反应可逆。
此外，来源不同的脂肪酶在催化油脂水解时还具有明显的轻基位置特异性。
1.2产脂肪酶微生物微生物脂肪酶的发现是在20世纪初，而国内直到60年代才开始了这方面的研究与开发，其中具有代表性的报道是，1967年中科院微生物所筛选得到解脂假丝酵母菌株，并于1969年制成酶制剂供应市场。
脂肪酶的作用基本原理和应用领域
其他脂肪酶，胰脂肪酶，如被分泌到细 胞外空间，他们为处理成更简单的形式， 可以更容易吸收和运输整个身体的饮食 血脂。
真菌和细菌分泌的脂肪酶，以促进养分的吸 收，从外部介质（或病原微生物的例子，以 促进一个新的主机入侵）。一定黄蜂和蜜蜂 毒液含有磷脂，加强“生物损伤和炎症刺交 付有效载荷”。
制备化工产品和试剂
利用脂肪酶催化的脂水解反应、酯合成 反应或酯转移反应可以制备许多有重要 价值的化工产品。另外，脂肪酶催化的 酯交换反应还被广泛应用于油脂改良以 生产具有特殊结构与性质的油脂。
造纸工业
用脂肪酶辅以纤维素酶和木质素酶处理 纸浆可以防止树脂在干燥转鼓上的沉积， 保持纸的产量和质量，并减少处理树纸 化学品的用量 。
琼脂块培养法：
将分离培养基用灭菌的打孔器制作成许 多单个的直径约的小琼脂块，排放在干 净的培养皿内，将套选的菌株接种在这 些小琼脂块上培养，让其充分生长。
然后依次再将长满菌的小琼脂块放到酶 活测定板上，28℃培养1-3d，观察各菌 落周围油脂水解圈的大小，水解菌越大， 酶活越强，将水解圈大的菌株纯化后保 存在斜面培养基上。
复筛选方法——摇瓶培养
种子培养基→发酵培养基→收集菌体和上清 液，分别测酶活。
酶活的测定：
在给定的时间内，脂肪酶酶活大小与其催化 水解生成的脂肪酸的量成正比。脂肪酶酶活 的测定方法很所，根据原理不同，其中酸碱 滴定法和分光光度法最为常用，常用的分光 光度法有铜皂显色法和对硝基苯酯法。
测定脂肪酶酶活常用方法的比较
品化生产的脂肪酶并不适合于饲料用。
脂肪酶的类型和生理分布情况
大多数脂肪酶的行动特定位置上的脂至底物 （小肠）甘油骨干。列入，人体胰腺酶。只 是主要的酶，能分解人体消化系统中的膳食 脂肪。转换成单甘酶和两种脂肪酶的摄入由 衷的甘油三脂基板。其他及中国类型那个的 脂肪酶的活性存在于自然中 如磷脂和鞘磷脂， 然而，这些通常是从 传统的脂肪酶 分别对 待。
生物柴油生产技术的研究进展
生物柴油生产技术的研究进展赖红星;万霞;江木兰【摘要】生物柴油作为一种新兴的生物能源,以其可降解性、可再生性等优良品性受到人们极大的关注.生物柴油生产技术从最初的直接使用法、稀释混合法等到后来的酸/碱催化法、生物酶法、超临界法,经历了漫长的发展过程.综述了国内外生物柴油生产技术的优缺点及其研究进展.【期刊名称】《化学与生物工程》【年(卷),期】2010(027)005【总页数】6页(P11-15,20)【关键词】生物柴油;生产技术;物理法;化学法;生物酶法;超临界法【作者】赖红星;万霞;江木兰【作者单位】中国农业科学院油料作物研究所,湖北,武汉,430062;中国农业科学院研究生院,北京,100062;中国农业科学院油料作物研究所,湖北,武汉,430062;湖北省能源油料作物与生物柴油研究中心,湖北,武汉,430062;中国农业科学院油料作物研究所,湖北,武汉,430062;湖北省能源油料作物与生物柴油研究中心,湖北,武汉,430062【正文语种】中文【中图分类】TQ914.3生物柴油是指动植物油脂、餐饮废油等与低碳醇反应所得的脂肪酸甲酯(或乙酯)。
近年来，由于石油价格持续飚升和生物柴油的环境友好性，生物柴油的价值日益凸显。
制备生物柴油的方法可以归为四类：物理法、化学法、生物酶法以及超临界法。
作者在此简要概述了国内外生物柴油生产技术的优缺点及其研究进展。
1 物理法物理法是指通过物理机械的作用，将动植物油脂与石化柴油按比例混合，得到的油品因掺入了一定的动植物油脂而被称为生物柴油。
根据混合方式的不同，物理法分为直接使用法、稀释混合法和微乳化法三种。
1.1 直接使用法直接使用法迄今已有100多年的历史，柴油机的发明者Rudolph Diesel当初就是用花生油为燃料做测试的[1]。
1981年，Bartholomew提出了用食物作燃料的概念，并且指出植物油和酒精必将取代石油，可再生能源一定会取代不可再生能源。
微孔聚醚型聚氨酯弹性体的制备与力学性能研究
优异的耐磨性和耐挠曲性，还有突出的吸能特性、耐
冲击性好、缓冲性能高等优点，因而被广泛用作减震
缓冲材料、密封材料和鞋底材料等 ［２－３］ 。
微孔聚氨酯弹性体一般用预聚体法或半预聚体
法制备。 首先通过选择不同种类的聚酯或聚醚多元
醇与二异氰酸酯反应生成预聚体，然后再用低黏度
星东大化工有限责任公司；４，４′⁃二苯基甲烷二异氰
多元醇、扩链剂、发泡剂及助剂配成混合物，这两种
限公司；ＡＩ⁃７０００Ｍ 型电子拉力试验机，高铁检测仪
原料在一定的温度和时间下进行快速混合，生成微
器东莞有限公司。
孔聚氨酯弹性体。 在一定范围内调整配方，就可制
１ ３ 微孔 ＰＵ 弹性体的制备
得在结构和性能上各具特色的微孔聚氨酯弹性体制
１ ３ １ 多元醇组分（ Ａ 组分） 配制
组分，密封备用。
第 １ 期
· ４３·
刘超奇，等·微孔聚醚型聚氨酯弹性体的制备与力学性能研究
１ ３ ３ 微孔弹性体制备
２ １ ２ 纯 ＭＤＩ 与液化 ＭＤＩ 质量比对性能的影响
组分，快速搅拌均匀后，倒入预热至 ４０ ～ ５０ ℃ 的模
具中，迅速合模，制成 １００ ｍｍ × ２００ ｍｍ × １５ ｍｍ 的试
ＭＤＩ） ，工业级，万华化学集团有限公司；有机硅泡沫
稳定剂 Ｌ⁃６８０，工业级，上海耀南工贸有限公司；１，４⁃
丁二醇（ ＢＤＯ） 、乙二醇（ ＥＧ） 、二乙二醇（ ＤＥＧ） 、三
亚乙基二胺、二月桂酸二丁基锡，试剂级，杭州化学
试剂有限公司。
１ ２ 设备及仪器
ＬＡＣ⁃Ｊ 型邵 Ａ 橡胶硬度计，乐清市艾力仪器有
由不同 ＭＤＩ ／ 液化 ＭＤＩ 质量比制备了 ３ 种 ＮＣＯ
粗状假丝酵母(Candida valida T2)生产脂肪酶的发酵条件
母 引、 一 根霉 、 霉 和 假 单 胞 菌 青
等 ， 中假 其
丝酵母 （ ａ ｄｄ ） 目前 国 内外研 究 较 多 பைடு நூலகம்产 Ｃ ｎ ｉａｓ 是 ｐ．
脂 肪 酶 菌种 。Ｂ Ｓ Ｋｉ 等 ＿ 利 用 高 密 度 发 酵柱 状 ．． ｍ ８ 假 丝酵母 （ ａ ｄ ｄ ｙｉｄ ａ ｅ ） Ｃ ｎ ｉａｃ ｌ ｒ ｃａ 生产 脂 肪 酶 ， 高 ｎ 最
摘 要 ：对粗状假 丝酵母 产 生脂肪酶 的培 养条 件 进行 了研 究 。结果 表 明 ， 菌株 产脂 肪 酶 的适 宜 该
培养基 组成 为 ： 油 １ ／ 黄 豆粉 ３ ／ ， 桐 ５ｍＬ Ｌ， ０ｇ Ｌ 糊精 １ ／ ， 酸铵 １ ／ ， Ｓ ・ Ｈ２ ｇ Ｌ， ０ｇ Ｌ 硝 ０ｇ Ｌ Ｍｇ Ｏ ７ Ｏ １ ／
Ｊ １ ２ ０ ｕ． ０７
文章 编号 ：６ ３１８ （０ ７０ —０ ２０ １７ —６９ ２ ０ ３０ ６—５ Ｊ
粗状假丝酵母 （ ａ ｄｄ ａｉａＴ ） Ｃ ｎ ｉａｖ ｌ ２ 生产 ｄ 脂肪酶 的发酵条件
肖海 群 ， 段 学辉 ， 牛春 铃
（ 昌大 学 食 品科 学教 育部 重 点实验 室 ， 西 南 昌 ３ ０ ３ ） 南 江 ３ ０ １
发酵水 平 达到 ２ ． ｍＬ； Ｌ ｕ９等 通 过大 肠 杆 ３ １Ｕ／ Ｄ． ｉｌ
菌进 行南极 假丝 酵母 脂 肪酶 基 因表 达 ， 酵 酶蛋 白 发 活力 达到 ６ ｍｇ 何耀 强等 ｌ 一株 突变高 产脂 １Ｕ／ ； ＿ １ 对
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第２ ６卷 第 ４期 ２０ ０ ７年 ７月
食 品 与 生 物 技 术 学 报
Ｊ ｕ ｎ ｌｏ ｏ ｃｅ ｃ ｎ ｏ ｅ ｈ ｏ ｏ ｙ ｏ ｒ ａ ｆＦｏ ｄ Ｓ ｉ ｎ ｅ ａ ｄ Ｂｉ ｔｃ ｎ ｌ ｇ
假丝酵母Candidasp.99-125脂肪酶的固定化研究
其次，采用京尼平对其交联，考察影响交联的因素，得到最优交联反应条件：温度 20 ℃，交联 pH 6.0，时间 6 h，京尼平质量浓度为 0.25%（S–8）和 0.5%（NKA–9），该条件 下，酶活回收率可达 86.18%（S–8）和 96.99%（NKA–9）。比较得知，京尼平固定化酶的 pH 稳定性、热稳定性、操作稳定性和储存稳定性均比戊二醛固定化酶高。
关键词：假丝酵母 Candida sp.99-125 脂肪酶，吸附，京尼平，交联，氧化硅涂层，CLEAs
ii
河北工业大学硕士学位论文
STUDY ON THE IMMOBILIZATION OF LIPASE FROM
CANDIDA SP. 99-125
ABSTRACT
In this work, the systematical study about the immobilization of lipase from Candida sp. 99-125 was investigated. This study observed the cross-linking and coating methods on the adsorbed lipase on resins. The application of genipin on immobilization of lipase was investigated. And the effects of genipin and glutaraldehyde on immobilized lipase were showed in this paper. The silica and ionic liquid were used to coat the immobilized lipase on resins. The stability of these coated lipases was evaluated. The combination of CLEAs technology and biosilicification was also used to immobilize the lipase from Candida sp. 99-125.
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Imm ob iliza tion of lipa se2produc ing cells of C andida va lida T2 w ith polyurethane foam s
OU YAN G Jun2mei, DUAN Xue2hui, FU Q i, N IU Chun2ling
( State Key Labchnology, Nanchang University, Nanchang 330031, China)
Abstract: The immobilization conditions of lipase2p roducing cells of Cand ida va lida T2 w ith polyurethane foam were investigated. The results showed that the cell load of polyurethane foam reached 1 415 mg / g and the lipase activity of the dry cell achieved 1 255 U / g after the op tim ization of the conditions on the carrier density, the particle size, the p retreatment p rocedure, and the ratio of solid carrier to fermentation bro th. Scanning electric m icro scope showed the mycelium Cand ida va lida T2 enlaced or filled in the rib and on the inner wall of the carrier cavity. The immobilized Cand ida va lida T2 cells grew well and colony configuration was stable. In a catalyzed hydrolysis of tung oil by the immobilized cells, the enzymatic ac2 tivity rem ained 73% , and the each rate was 1215% after five repeat reactions. Key words: Cand ida va lida T2; immobilized cell; lipase; polyurethane foam
通常聚氨酯泡沫中会残留一些对微生物生长 有危害的化学成分 ,需进行预处理清除 ,同时适当 的处理可使聚氨酯泡沫基料中的一些化学基团活 化 ,或改变其表面的粗糙度 ,从而有利于菌体的生 长和固定 [ 2 ] 。将不同方式处理的聚氨酯泡沫 (密度 为 27 kg /m3 ,边长为 8 mm 的立方体 小块 颗粒 ) 各 012 g分别加入到装有 100 mL 发酵培养基的摇瓶内 , 灭菌 ,接种和发酵培养。
1 材料与方法
1. 1 试验材料 11111 菌种
粗状假丝酵母 ( Cand ida va lida T2 ) : 由本实验 室保藏 。 11112 培养基
斜面培养基 :麦芽汁培养基 ; 种子 培 养 基 ( g /L ) : 蔗 糖 2010, 蛋 白 胨 510, NaC l 210, K2 HPO4 210,酵母浸膏 510; 发酵培养基 ( g /L ) :橄榄油 1510,黄豆粉 3010,糊 精 510, NH4 NO3 1010, MgSO4 ·7H2 O 110, K2 HPO4 210, Tween 80 015。 上述培养基在 121 ℃湿热灭菌 25 m in,冷却后 备用 [ 5 ] 。其中 ,发酵培养基中加入一定量的 PUF后 灭菌 。 1. 2 细胞固定化方法 以无菌操作将斜面菌种接种到 60 mL种子培养 基中 ,于 30 ℃, 120 r/m in下培养 26 h。然后按 10% 的接种量接入到 100 mL 加有 PUF 的发酵培养基 中 ,在 30 ℃, 160 r/m in发酵 48 h,假丝酵母进入或 依附于 PUF内壁生长 ,将固定细胞的载体与发酵液 过滤分离 ,生理盐水清洗 3次 , 30 ℃风干 ,得到固定
水解率 = V t - V0 ×100%
SV - AV
式中 : Vt、V0分别为水解物样品在 t时刻的酸值和初 始酸值 ; SV 、AV分别为桐籽油的皂化值和初始酸值 (折算为相同的底物量 )
· 54 ·
生物加工过程
第 6卷第 6期
2 结果与讨论
2. 1 载体因素对细胞固定化的影响 2. 1. 1 聚氨酯泡沫预处理的作用
摘 要 :对聚氨酯泡沫固定产脂肪酶粗状假丝酵母 ( Candida valida T2)细胞的固定化条件进行了研究 。实验结果 表明 ,聚氨酯泡沫颗粒经密度和粒径筛选 ,酸碱处理 ,以及固液比优化 ,载体固定细胞干质量比达到 1 571 mg/ g,细 胞脂肪酶的酶活为每克干细胞 1 415 U。电镜图片显示粗状假丝酵母菌 (Candida valida T2)在载体孔隙内和脊壁上 缠绕充盈 ,生长良好 ,固定结构稳定 。固定化细胞连续催化水解桐籽油 5批次 ,细胞相对水解酶活保持率达 73% , 固定细胞的损失率为 1215%。固定化细胞颗粒显示出良好的操作稳定性和酶活保持率 ,为进一步的应用研究提供 了实验基础 。 关键词 :粗状假丝酵母 ;固定化细胞 ;脂肪酶 ;聚氨酯泡沫 中图分类号 : TQ925 + 16 文献标志码 : A 文章编号 : 1672 - 3678 (2008) 06 - 0052 - 06
N·ov .5220·08
生物加工过程
Chinese Journal of B iop rocess Engineering
第 6卷第 6期 2008年 11月
聚氨酯泡沫固定产脂肪酶粗状假丝酵母 (Candida valida T2)细胞的研究
欧阳军梅 ,段学辉 ,傅 奇 ,牛春铃 3
(南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室 ,南昌 330031)
and the immobilized cell biomass
由图 3可知 ,当载体尺寸较小时 ,固定的细胞较 少 。较小颗粒载体在摇瓶振荡培养环境中 ,载体内 部受到流动培养基的冲击相对较大 ,细胞难以稳定 生长和固定 ; 而载体尺寸偏大时 ,颗粒内部受到传 质限制 ,营养传递和供氧不畅 , 不利于菌体生长 。 切片观察颗粒内部只有少量的菌丝体甚至无菌丝 体 。载体为边长 8 mm 的立方体小块时 ,颗粒固定 细胞干质量最大 ,达到每克载体固定细胞 824 mg, 固定化细胞酶活达到每克干细胞 1 022 U。 2. 1. 3 载体材料密度的影响
1—直接使用 ; 2—酸处理 ; 3—碱处理 ; 4—先酸后碱处理 ; 5—先碱后酸处理 图 1 酸碱处理对细胞产酶酶活的影响 Fig. 1 Effect of PUF carriers treated w ith acid
or base on the lipase p roduction
图 3 载体尺寸对产酶及固定细胞生物量的影响 Fig. 3 Effect of PUF size on the lipase p roduction
载体选择是固定化技术的关键 ,目前常用的载 体有聚氨酯泡沫 ( polyurethane foam , PUF) ,多孔玻 璃 、聚乙烯醇等 。其中 , PUF作为新型固定载体材 料显示出一定的优势 [ 2 ] 。O ry等 [ 3 ]比较了木块 、多 孔玻璃和 PUF固定化培养醋酸杆菌的效果 ,结果显 示 PUF载体能在最短时间内固定更多的醋酸杆菌 细胞 。另外 , PUF作为固定化细胞载体在生物柴油 制备领域也得到了应用 。B an等 [ 4 ]将丙酮干燥过的 产脂肪酶的米根霉 IF04697 细胞固定在 PUF 颗粒 内 ,直接用来催化大豆油生产生物柴油 。假丝酵母 (Cand ida sp. )是国内外研究较多的产脂肪酶菌种 。 本文以 PUF为载体 ,固定一株产脂肪酶的菌株 Can2 d ida va lida T2细胞 ,研究固定化条件对载体固定细 胞生物量及细胞产脂肪酶活性的影响 ,以及固定化 细胞重复使用的稳定性 。
实验结果如图 1、图 2所示 。
的影响 ,但是 ,酸碱处理的先后顺序对固定化细胞 产酶的影响无明显差异 。先碱处理 ,再用酸处理的 方式每克载体固定细胞的干质量达到 824 mg,细胞 产酶酶活达到每克干细胞 1 022 U。 2. 1. 2 载体颗粒大小的影响
分离检测不同大小载体颗粒固定化细胞的干 质量和酶的活性 ,结果如图 3所示 。
2008年 11月 欧阳军梅等 :聚氨酯泡沫固定产脂肪酶粗状假丝酵母 (Candida valida T2)细胞的研究 · 53 ·
展起来的新技术 ,比固定化酶工艺简单 ,可免除酶 的提取纯化 ,保持细胞活力 , 进行连续催化发酵 ,有 利于提高生产能力 ,降低成本 ,提高产物分离纯化 效率 [ 1 ] ,在一些应用领域显示出明显的优越性 。
生物柴油是典型的“绿色能源 ”,发展生物柴油 对推进能源替代 , 减轻石化能源压力 , 控制城市大 气污染具有重要意义 。目前 ,生物柴油的生产方法
主要有化学法和生物酶法 。由于商业化的脂肪酶 成本较高 ,许多研究者都致力于用固定化方法来降 低生产成本 。固定化细胞是在固定化酶基础上发
3 收稿日期 : 2008204201 基金项目 :江西省科技攻关资助项目 (20041B0103000) 。 作者简介 :欧阳军梅 (1979 - ) ,女 ,江西九江人 ,硕士研究生 ,研究方向 :食品生物技术 。 联 系 人 :段学辉 , 教授 , E2mail: xhduan@ nuc. edu. cn。
化细胞 , 4 ℃保藏待用 。 113 固定化载体处理及制备