抗原抗体反应与非标记免疫分析.pdf
抗原抗体反应
力高（对照孔） 4、适宜工作浓度
抗原性肽段的固相合成
以Fmoc-Gly-Wang树脂为载体，以N-α-Fmoc基团保护的氨基酸为原料，以HBTU/HoBt作为偶联试剂， 从C-N端顺序依次偶联所需的氨基酸，直至合成所需的各肽段。然后将肽从树脂上裂解下来，洗涤， 冻干得到短肽。
Precipitation Reaction
Immunodifusion（免疫扩散） Immunoturbidimetry（免疫浊度） Immunoeletrophoresis（免疫电泳） Et al(环状～）
（絮状～）
沉淀反应的类型归纳
环状沉淀反应 液相（液体）{絮状沉淀反应
免疫浊度测定 沉淀反应{
—— Solid phase （固相）
ELISA：
ELISA— 是以酶作为标记指示物、以抗原抗 体反应为基础的固相吸附测定。
— 抗原/抗体的固相化 （coating，包被） （immunosorbent） (蛋白分子表面效应)
操作：（例）Ag/Ab in pH 9.6 carbonate buffer Incubated at 4℃ for overnight
分类：荧光免疫显微技术（流式） 荧光免疫测定 （非均相/均相）
荧光（fluorescence）： 某些物质在光的照射下，吸收光能进入激发态，
当其从激发态返回原基态时，以电磁辐射形式放射 出所吸收的光能，称为光致发光。
若用一短波长光照射某物质，该物质能发射较长 波长的光，此种光被称谓荧光。 荧光素（ fluorchrome ）：
免疫扩散 固相（凝胶）{
免疫电泳
免疫浊度(turbidimetry)测定:
免疫检测技术
3.免疫电泳技术
免疫电泳技术是电泳分析与沉淀反应的结合产物. 这种技术有两大优点：一是加快了沉淀反应的速度, 二是将某些蛋白组分利用其带电荷的不同而将其分 开,再分别与抗体反应,以此作更细微的分析.
免疫电泳包括:血清免疫电泳、对流免疫电泳、 火箭电泳、免疫印迹等
血清免疫电泳
将抗原混合物病人血清在凝胶中用电泳 分离后,沿电泳方向挖一平行的小槽,加入 抗血清,进行双向扩散.沉淀线的特点显示 病人血清与正常人血清存在的差异,即血清 蛋白组分的缺少或增加.
第九章
免疫检测技术
➢ 免疫检测是目前生物学检测方法中 用途最广泛的一种方法.
➢ 具有高度精确、灵敏、特异的特点. ➢ 可用于免疫学的基础理论和应用研
究,也可应用于生物学研究的各个 领域.
免疫检测技术在生物科学领域中的应用：
1 、免疫疾病诊断 2 、动物植物生理活动研究激素、维生素 3 、物种及微生物鉴定 4 、动物、植物性状的免疫标记 5 、免疫增强药物和疫苗的研究 6 、发病机理研究 7 、分子生物学研究
2. 凝胶扩散沉淀
单向琼脂扩散试验 双向琼脂扩散试验
3. 凝胶免疫电泳
血清免疫电泳 火箭电泳 对流免疫电泳
免疫印迹等
絮状沉淀试验
操作步骤：
1 将可溶性抗原作一系列倍比稀释. 2 各管加入一定浓度的适量抗血清. 3 振摇使抗原、抗体充分混匀,置37℃孵育. 4 产生沉淀量随抗原量而不同,以出现沉淀物最多的管为最适
2 间接法测抗体
几种标记/检测技术灵敏度的比较
灵敏度mol/L
10-18 10-15 10-12 10-9
酶标
荧光
放免
发光
几种标记/检测试剂的有效期比较
有效期月
抗原抗体反应实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 了解抗原抗体反应的基本原理和过程。
2. 掌握抗原抗体反应的实验操作方法。
3. 通过实验观察抗原抗体反应现象，加深对免疫学基础知识的理解。
二、实验原理抗原抗体反应是指抗原与特异性抗体在一定条件下发生的特异性结合反应。
抗原是一类能引起机体免疫应答的物质，抗体是一种由B细胞产生的具有特异性结合抗原能力的蛋白质。
抗原抗体反应具有高度的特异性，即一种抗原只能与相应的抗体结合。
实验中常用的抗原包括细菌、病毒、肿瘤细胞等，抗体则多为免疫球蛋白（Ig）。
根据抗原抗体反应的性质，可分为沉淀反应和凝集反应。
本实验主要观察凝集反应。
三、实验材料与试剂1. 实验材料：- 羊红细胞（抗原）- 兔抗羊红细胞抗体（抗体）- 洗涤剂- 稀释液2. 实验试剂：- 磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）- 生理盐水- 0.1%碳酸钠溶液- 0.1%氢氧化钠溶液- 0.1%盐酸溶液四、实验步骤1. 准备实验器材：试管、移液器、滴管、显微镜等。
2. 将羊红细胞与兔抗羊红细胞抗体按一定比例混合，置于试管中。
3. 将混合液置于37℃水浴中孵育30分钟。
4. 取出试管，加入适量的洗涤剂，轻轻振荡，使未结合的抗体与红细胞分离。
5. 将洗涤后的混合液离心，弃去上清液。
6. 加入适量的稀释液，混匀。
7. 观察红细胞是否发生凝集现象。
五、实验结果与分析1. 正常情况下，羊红细胞与兔抗羊红细胞抗体发生特异性结合，形成红细胞凝集现象。
2. 通过观察，发现实验组红细胞发生明显的凝集现象，而对照组（未加抗体的红细胞）未发生凝集。
六、实验结论1. 本实验成功观察到抗原抗体反应现象，证明了抗原抗体反应的特异性和结合能力。
2. 通过实验，加深了对免疫学基础知识的理解，为后续学习提供了实践基础。
七、实验讨论1. 实验过程中，应注意避免交叉污染，确保实验结果的准确性。
2. 实验操作应严格按照实验步骤进行，避免人为误差。
3. 通过本实验，了解抗原抗体反应在免疫学研究和临床诊断中的应用。
抗原抗体反应及其应用
抗原抗体反应及其应用摘要抗原抗体反应指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。
免疫印迹，又称蛋白质印迹（Western blotting），是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。
双转印法、天然电泳及western blot 分析等是最近几年出现的新型蛋白印迹技术。
单克隆抗体技术是20世纪后20年内最为重要的生物高技术之一。
单克隆抗体药物在肿瘤治疗、抗感染等方面具有重要的作用。
关键词抗原抗体反应、Western blotting、单克隆抗体技术一、抗原抗体反应抗原抗体反应指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。
这种反应既可在机体内进行，也可以在机体外进行。
抗原抗体反应的过程是经过一系列的化学和物理变化，包括抗原抗体特异性结合和非特异性促凝聚两个阶段，以及由亲水胶体转为疏水胶体的变化[1]。
抗原是能够刺激机体产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体内外结合，发生免疫效应（特异性反应）的物质。
抗原表位是抗原上与抗体结合的区域。
蛋白质抗原的表位是由相邻的连续的或非连续的氨基酸序列形成的局部表面结构[2]，如图1所示。
抗体是指宿主对体内存在的外来分子、微生物或其他因子的应答而产生的蛋白质。
抗体主要由B淋巴细胞系的终末分化细胞-浆细胞产生，并且循环在血液和淋巴液中，在那里与抗原结合。
抗体是具有4条多肽链的对称结构，其中2条较长、相对分子量较大的相同的重链(H链)；2条较短、相对分子量较小的相同的轻链(L链)。
链间由二硫键和非共价键联结形成一个由4条多肽链构成的单体分子。
整个抗体分子可分为恒定区和可变区两部分。
抗体上与抗原表位结合的位点由重链和轻链的可变区构成[3]，如图2所示。
抗原抗体复合物通过大量非共价键连接。
某些免疫复合物中抗体或抗原的结构未发生改变，而另一些则出现巨大的构像改变。
研究抗原抗体复合物最有说服力的的方法是抗体-抗原共结晶的X射线衍射技术。
图1 抗原表位示意图图2 抗体结构示意图二、蛋白印迹技术免疫印迹，又称蛋白质印迹（Western blotting），是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。
7.免疫分析1
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免疫应答的动力学
当抗原引入动物的有关组织时最初引起淋巴细胞的分化，
特别是在淋巴结和脾脏中的淋巴细胞。然后，一种称之为浆
细胞的抗体生成细胞便会增加。在注射入抗原和在血清中发
现抗体之间存在一个潜伏期，之后抗体的浓度增加到最大，
而后开始降低。如果抗原对动物是全新的，动物则表现出慢
的响应(初次应答)．但若动物以前遇到过这种抗原，则会出
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五种免疫球蛋白的比较
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抗体的制备
多克隆抗体：从特定的抗原免疫动物中提取的含有抗体的 血清称之为抗血清。在许多分析应用中并不需要把抗体从 血清中分离出来。这种抗血清会因不同动物，甚至是同种 动物的不同的个体由于遗传性的差异，而导致所得抗体并 非均一物质，特别是抗体的特异性及亲和力几乎每批产品 都不相同，通常称这类抗体为多克隆抗体。
除了上述考虑之外，任何一种分离方法都应简单、快速、 耗费低、易于自动化，并且适用于较多的分析对象。
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8.2.2 分离方法的分类
免疫分析中常用的分离方法
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二抗
抗动物种的二抗是在20世纪70年代末80年代初开 始使用的， 二抗是专门针对-球蛋白的一种抗体， 也称为抗抗体。二抗的使用，使免疫分析得到了巨 大的进步。
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(3)抗原的免疫原性还与免疫原的分子表层基团有关， 对蛋白质抗原。它还与氨基酸的组成相关。例如， 多聚赖氨酸无免疫原性，在其外层接上一层丙氨酸 或甘氨酸，它仍无免疫原性，但若外层接的是酪氨 酸，则它会表现出免疫原性．由此可见，带芳香环 氨基酸，或者说结构较为复杂的氨基酸对免疫原性 有重要的贡献。
择哪一种方法与抗体的用途、对抗体纯度的要求、 及抗体的种类和来源有关，如抗体可以来源于血清， 培养上清液或腹水。
临床免疫学检验 抗原抗体反应PPT
第二节 抗原抗体反应的特点
抗原抗体复合物浓度 亲和常数=
游离抗原浓度×游离抗体浓度
K值表示亲和力，大表示结合牢固，不易解离。
二、亲水胶体转化为疏水自然沉淀， 其蛋白质含大量氨基与羧基残基，带电荷，静电作用下，其 周围形成带相反电荷的电子云、水化层，不致自行聚合、产 生沉淀。疏水胶体 — 抗原抗体结合 — 电荷减少，电子云消 失，再加入电解质，使疏水胶体相互靠拢，形成可见抗原抗 体复合物。
抗体预滴定，找出最适反应浓度。
二、环境因素
1.电解质 Ag+Ab结合后无电解质参与，不出现可见反应 常用0.85%的Nacl促使沉淀和凝集物的形成。 2. 酸硷度 抗原抗体反应一般在pH 6~8间。 pH达到或接近抗原的等电点，即使无相应抗体，也会引起颗粒性抗原非特异 的凝集，造成假阳性反应。 3. 温度 温度升高，分子运动加速，碰撞机会增多，抗原抗体反应加速 常为37℃，高于56℃，抗原抗体解离，甚至变性或破坏。 有 些 有 独 特 的 最 适 反 应 温 度 ， 如 冷 凝 集 素 在 4℃ 左 右 与 细 胞 结 合 最 好 ， 20℃ 反而解离。
溶性复合物，大多数动物属比型，家兔为代表。
H型抗体 — 合适比例较窄，抗原抗体过量均可形成可溶性复合物，人 和大动物属此型，马免疫血清为代表。
三、可递性（reversibility）
Ag + Ab
Ag + Ab
化学发光免疫标记分析技术(基本原理)
吖啶酯化学发光系统-CH3-HOO-C=0-OH-光子+C02+-R
碱性磷酸酶化学发光系统-金钢烷（发光底物）及其衍生物的增敏化学发光系统-OCH3-AP-0P032-碱性磷 酶及其衍生物的化-·光子477nm
化学发光的检测类型-化学发光按化学反应类型分为：-◆直接化学发光（非酶促化学发光-吖啶酯系统-●-异鲁米诺 统-◆间接化学发光（酶促化学发光-·辣根过氧化物酶一鲁米诺系统（HRP系统-碱性磷酸酶一金刚烷系统AP系统 其它-电化学发光
板式化学发光-,适合流行病调查、疾病预防与控制、-体检中心，以及医院血站等大样本检-测项目的使用（比如HI 、TP、HCV和-乙肝两对半等。-通常采用96孔白色不透明微孔板进行包-被，不方便随到随测和医院急诊；-对 定量检测需要做标准曲线。-◆-国内厂家主要是板式化学发光系统
管式化学发光-采用管式或微粒子发光，测定快速、准确；-可以随到随测，适用于医院急诊；-定量检测的标准曲线存 在试剂条形码中，-可在2-4周内直接使用。-国外厂家全部是管式化学发光系统
间接化学发光-以碱性磷酸酶系统为例-洗涤清除团-间接化学发光：用参与发-◆》回+-光反应的酶来标记抗原或体，免疫反应后，加入-抗体包被-的磁珠-标记抗体-双抗体夹心复合物-发光底物，测定发光体系-的发光强度来进 抗原或-◆可茶-抗体的检测。-AMPPD-AMPD发光-两大反应体系：-辣根过氧化物酶-HRP系统：氧化还 反应，稳定性差-·源德、科美、安图-碱性磷酸酶（AP系统：水解反应，灵敏度较高-●-贝克曼：Access1 Access2,DXI600、DXI800-西门子：mmulite:1000,Immulite2000-达 生物：AULIN200
免疫学检测-◆-免疫学检测是应用免疫学理论设计的一系列测定抗原、-抗体、免疫细胞及其分泌的细胞因子的实验手 及分子-生物学技术在免疫学研究中的应用。它包括：-抗原抗体的检测技术-免疫细胞的检测-细胞因子的检测-免疫 关基因分析-免疫标记技术-免疫PCRIM-PCR技术-杂交瘤技术与T细胞克隆技术
抗原抗体反应及应用
第七章抗原抗体反应及应用不论天然的还是人工合成的分子，只要能被机体的免疫系统识别的都可以诱导机体的免疫应答，产生相应的抗体。
大多数抗体和抗原本身是既有免疫原性(诱发产生特异抗体)，又有反应原性(与特异的抗体相结合)。
抗原与抗体的特异性反应不仅可以在体内进行，而且可以在体外进行。
一切利用血清学技术方法所进行的各种测试都是基于这一根本的特性。
抗体反应技术的应用之广泛已经远远超出了免疫学、医学、甚至生命科学的范围，成为—类微量，灵敏，快速的检测分析方法。
本章着重介绍抗体制备，抗体抗原反应原理及技术方法的应用。
第一节抗体的制备环境中的大部分生物(包括病原生物)及其产物分子和一些化合物对哺乳动物的免疫系统而言是外源抗原，这些抗原能通过侵染或其他的途径刺激免疫系统，产生以抗体为主的体液免疫应答。
同样用抗原人工免疫实验动物，可以获得含有特异性抗体的血清，称为抗血清(antiserum)，因血清中抗体是多个抗原决定簇刺激不同B细胞克隆而产生的抗体，所以称多克隆抗体(polyclonal antibody)。
一个B细胞克隆所分泌的抗体即为单克隆抗体。
用免疫动物的B细胞与骨髓瘤细胞融合，在体外可以分离出许多单个B细胞克隆，以此方法可制备单克隆抗体(monoclonal antibody)。
随着分子生物学技术的发展，已经可以用抗体基因文库(antibody combinatorial library)筛选制备单克隆抗体。
应用基因工程技术，根据需要对抗体进行改造，获得基因工程抗体(engineering antibody)，以及催化性抗体(catalytic antibody 或abozyme)等的全新的抗体。
一、抗血清的制备1．免疫动物(1)抗原：免疫动物是制备抗血清的第—步。
免疫所用的抗原可用病毒、细菌或者其他蛋白质抗原，如果使用半抗原如小分子激素等，必须与大分子载体连接，连接剂见表7—1。
抗原的用量视抗原种类及动物而异，—次注射小鼠可以少至几个微克，免、羊甚至更大的动物每次注射的量就相应增加，从几百μg／次至几mg／次。