乳酸杆菌基因表达系统的研究进展
动物黏膜免疫疫苗基因表达系统一乳酸菌的研究进展
动物黏膜免疫疫苗基因表达系统一乳酸菌的研究进展王振华【摘要】乳酸菌是人及动物肠道中重要的益生菌,被公认为安全级(generally recognized as safe,GRAS)微生物.乳酸菌乳链菌肽诱导表达载体(Nisin controlled expression system,NICE)是近几年发展起来的一种表达系统,目前国内外学者利用乳酸菌NICE为载体来表达抗原蛋白研制黏膜免疫疫苗,刺激动物机体黏膜免疫系统产生高效的应答反应,试验证明抗原蛋白能在乳酸菌中正确表达,并能诱导机体产生分泌性抗体IgA(sIgA),同时激活机体系统免疫功能,具有重要开发前景.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2010(037)010【总页数】4页(P194-197)【关键词】黏膜免疫;乳酸菌【作者】王振华【作者单位】四川成都农业科技职业学院畜牧兽医分院,成都611130;四川农业大学,雅安,625014【正文语种】中文【中图分类】Q782动物机体约有80%以上的细菌、病毒和寄生虫感染都起始于黏膜表面。
黏膜免疫可诱导局部黏膜产生分泌性IgA(sIgA)、IgM和IgG等保护性抗体,并且通过机体共同膜机制诱导其它部位的黏膜也产生sIgA,这是黏膜免疫保护作用的主要机制。
此外,黏膜免疫还诱导黏膜细胞毒性 T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTL)反应,且产生分泌IFN-γ和CD4+T细胞,这对于病原体侵入的预防和清除是非常重要的(Holmgren等,2005)。
因此黏膜免疫是保护机体免于病原体侵犯的重要屏障,在疫苗的设计中具有重要意义。
1 黏膜免疫抗原递呈活载体尽管黏膜免疫具有许多优点,但并非所有的抗原物质都可被成功地减毒以用来开发口服疫苗,一些抗原很难或根本无法在黏膜表面存活,且在低pH和肠道酶作用下会发生降解、口服吸收率低、单独使用无法产生有效的免疫保护反应等。
因此,活菌载体疫苗是目前疫苗研制的重要方向。
食品级乳酸菌基因表达系统的研究进展
２ 食品级载体选择标记
传统的乳酸菌载体为保持一定的选择压力都带有一
作者简介 ： 平 （９ ５ ） 唐 １７～ ，男 ，江苏南京人，讲师 ，在读博士研究生 ，研究方向 ：基因表达与调控。 通讯作者 ：郭锡杰
唐平等：食品级乳酸菌基 因表达系统的研究进展
２ ９
个或多个编码特定抗生素 （ 红霉素、氯霉素 ）抗性的基 因，由于抗性 因子具有可转移性 ，将其释放 到环境或被
在Ｌ１ｃｉ 功地 表达 了来源脯 氨酸亚氨基 肽酶 的基因 ． ｔ成 ａ ｓ
ｐｅ 【 。 ｐｉ
人或动物摄人体 内会带来严重的生物安全性后果 ，美国
片球 菌、链球菌及双 歧杆菌等 。传统乳制 品制 作有着 几 千年的历史 ，其 中的乳酸菌是 重要的可利用 生物资 源 ，乳球 菌和乳杆 菌的许多种通 常是被认为具有 安全 （ ｅ ｅａ ｙｒｇ ｒｅ —ｓ ａｅ Ｇ ｎ ｒｌ — ａｄ ｄａ— ｆ，ＧＲ Ｓ ｌ ｅ ｓ Ａ ）的特性 ，是一 种 食 品级 的微 生物 … 。在过 去 的２ 年 里 ，Ｌ ０ ＡＢ的特
用前景 十分广 阔。
包 括 内源性质粒 的去除 、电穿 孔方法的建立 等 ，已建
立 了一系列具有不同用途 的选择标记和突变系统等 ， 以及Ｌ Ｂ的模式菌Ｌ ｃｏｏ ｃｓ ａｔ 的基 因组 的测序完 Ａ ａｔｃｃｕ ｃ ｓ ｌ ｉ 成 【 ，这些都为Ｌ Ｂ ３ ］ Ａ 在食 品 、医药工程方面的应用提 供 了可能，而食品级的高效表达系统的构建和应用更是
１ 乳酸基 因工程菌
乳酸菌是人和大多数动物肠道内的常见 细菌 ，已证
明其在食品工业各个领域中的长期应用不具有致病性 ，
食品级乳酸菌表达系统研究进展
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生 物 技 术 通 讯 Ｌ Ｔ ＥＲ Ｎ Ｉ ＴＥ ＮＯＬ Ｅ Ｔ Ｓ Ｉ Ｂ Ｏ ＣＨ ＯＧＹ ｖ ｌ ８ Ｎｏ一 一 ｒ，２ ０ Ｈ ｏ Ｏ２ Ｍａ ０ ７ － １ ． ・ ． ，
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文 章编 号 ：０ ９ ０ ０ （０ ７０ — ３ ５ ０ １０ — ０ ２２０ ）２ ０ ４ — ３
［ 键 词 ］ 乳 酸 菌 ； 品 级 ； 菌 疫苗 ； 因表 达 ； 关 食 活 基 表达 系统
［ 圈分 类 号 ］ Ｑ ８ 中 ７
［ 献标识码］ Ａ 文
Ａｄｖ ｎ ｅ ｎ Ｅｘ ｅ ｓｏ Ｓ ｓ ｅ ｓ ｏ ｃ ｉ ｉ ｃ ｅ ｉ ａ ｃ ｓ ｉ ｐｒ ｓ ｉ ｎ ｙ ｔ ｍ ｆ ｒ Ｌａ ｔｃ Ａｃ ｄ Ｂａ ｔ ｒａ
乳 酸 菌 （ ｃｉ ａｉ ｂ ｃ ｒ ，ＡＢ 是 一 类 能 利用 碳 水 化 合 物 １ ｔ ｃｄ ａｔ ａ Ｌ ） ａ ｃ ｅ ｉ 产 生 乳 酸 的 革 兰 阳性 菌 的 通 称 ｆ 包 括 乳 杆 菌 属 、 球 菌 属 等 至 Ｉ １ ， 乳 少２ ３个 属 。 作 为 重 要 的 益 生 菌 ， 酸 菌 已被 广 泛 地 应 用 于 食 乳 品 、饮 料 和 微 生 态 制 剂 等行 业 中 ，被 公认 为是 安 全 的 （ｅｅａ ｙ ｇｎｒ ｌ ｌ ｒｇｒｅ ｓｓｆ， Ｒ Ｓ 食 品级 微 生 物＿ ｅａｄｄ ａ ａ Ｇ Ａ ） ｅ １ 】 。乳 酸 菌 产 生 的一 些 酶 、 抗 微 生物 多肽 能 使 食物 美 味 可 Ｅ且 长久 保 持 ｌ 。乳 酸杆 菌 通 过 重 建肠 道 菌 群 平 衡 ，有利 于人 类 及 某 些 动物 宿 主恢 复 并 提 高 健 康
乳酸菌食品级高效表达载体系统的研究进展
综述与专治乳酸菌食品级高效表达载体系统的研究进展张金宝1,乌云塔娜2(1.内蒙古扎兰屯农牧学校,内蒙呼伦贝尔162650;2.呼伦贝尔市新巴尔虎右旗畜牧局动物疫控中心,内蒙古呼伦贝尔162650)摘要:乳酸菌以其遗传工程可行并操作简单,在建立和研究乳酸菌食品级高效表达载体系统方面具有十分重要的实际意义。
本文对乳酸菌食品级高效表达载体系统的最近研究及其在外源基因表达方面的应用概况进行初步总结。
指出食品级乳酸菌工程及其表达产物可直接用于食品工业、医药和保健品等领域,是具有巨大应用前景的技术。
关键词:乳酸菌(LAB);食品级;表达载体系统中图分类号:T S201.6文献标识码:A文章编号:1004-6704(2008)06-0042-03The Food Grade Inducible Over ProductionExpression System of Lactic Acid BacteriaZH ANG Jin-Bao,WU Yun-tana(1.Zalantun F armets and Sc hools in I nner M ong oli,Zalan tun,I nner M ong li162650;2.X in baery ou qi ise ase Cintrol Ceter,Zanlantun,162650)Abstract:T he g enetic pro ject of the L actic A cid Bacteria(LA B)is simple o per ated。
T hat already w idely used in to ex press many other sour ces g ene.Study the Fo od-Gr ade Inducible Over-P roduct ion Ex pression System-of L actic Acid Bacteria hav e v ery impo rtant significance.In this paper,T here are preliminary co nclusio n the research o f t he Fo od-Gr ade Inducible O-v er-P roduct ion Expressio n Sy stem-o f Lactic Acid Bacter ia at r ecently and it's used in to ex press other g ene aspects.Key words:lactic acid bacter ia;fo od-gr ade;over-production;ex pression system乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)是一群革兰氏阳性厌氧细菌,能发酵碳水化合物(如葡萄糖),主要代谢产物是乳酸的各类细菌的统称。
乳酸杆菌表达系统的研究进展
乳酸杆菌表达系统的研究进展丁轲程安春(四川农业大学动物科技学院四川雅安625014)乳酸杆菌是一种常见的益生菌，它的应用已有几百年的历史，是一种公认的具有GRAS(Generally Regarded As Safe)有益微生物。
该菌广泛存在于人、动物和植物中，可以产生多种物质，如短链脂肪酸、过氧化氢、细菌素、蛋白质和各种酶类等。
尤其重要的是它是人和动物肠道中最重要的优势菌群之一，对于机体的代谢、免疫调节等方面起着极其重要的作用。
但随着基因工程技术的发展日趋完善，人们已不再满足于乳酸杆菌自身固有的功能，特别是当前由于疫苗免疫和菌(毒)株的残留毒力之间的矛盾，促使人们寻求能良好表达外源抗原且安全的疫苗载体候选菌株，乳酸杆菌便自然成为最佳选择菌株之一，因此近年来在疫苗载体的研究中日益受到重视，但其研究却远远落后于病原微生物。
现就这一方面作一综述。
1 乳酸杆菌表达载体的优点乳酸杆菌作为表达载体有许多独特的优势，这主要是因为乳酸杆菌是人和动物体内最优势的益生菌株之一，许多研究都表明它的有无和多寡都对机体有着至关重要的影响，以它为表达系统有其它菌株不可比拟的优点，主要表现在以下方面：①乳酸杆菌是至今发现的唯一没有致病性的一个种；②它在人和动物体内占绝对优势，以它为表达系统，较其它菌株更易达到较高的表达量；③若选择非抗性标记，则该表达系统中的菌体、选择性标记、诱导物均为食品级，为生产绿色安全的食品提供了可能；④乳酸杆菌菌体本身就对机体有益生作用，其分泌多种物质更是机体必不可少的，若再在其载体上克隆入外源基因，这样就可集菌体、自泌物质和外源蛋白于一体；⑤乳酸杆菌对机体粘膜有极强的粘附作用，因此构建的乳酸杆菌基因工程菌就可在粘膜处不断繁殖，持续向机体释放目的蛋白；⑥乳酸杆菌可直接口服，能够耐受胃液中的强酸和小肠上段的胆盐，这样就免去了目的蛋白的体外提纯等后加工。
2 乳酸杆菌质粒1976年Chassy[1]首先发现乳酸杆菌中存在质粒，质粒在不同的乳酸杆菌中分布不均，Vescovo等[2]对159株乳酸杆菌进行质粒抽提，发现L. reuteri、L. helveticus 和L. acidophilus 含质粒的比率较高，分别为63%、27%和20%，L. casei仅有4%的菌株含有质粒，L.plantarum、L. brevis 和L. coryniformis没有发现质粒。
基因工程乳酸菌作为活载体表达外源蛋白及疾病防治研究进展
基因工程乳酸菌作为活载体表达外源蛋白及疾病防治研究进展刘琼^*2，陈宏亮2 ,姜延龙2 ,王春凤2收稿日期：2018—05—03基金项目：国家十三五重点研发计划项目(2017YFD0501000)； 国家自然科学基金项目(31602092，31272552，31272541 )；吉林省科技发展计划项目(20160519011JH,20170204034NY,20180201040NY)(吉林省教育厅科技研究项目(2016120)(吉林工程技术师范学院校级科 研项目(2016)作者简介:刘琼(1980 -)，女，实验师，博士，研究方向为动物微生态与黏膜免疫学，E-mail ： liuqiong@jlenu. edu. cn通讯作者：王春凤,E-mail ：wangchunfeng@ jlau. edu. cn[35] 李海燕，方肇勤，梁尚华.小鼠移植性肝癌(H22)模型的研究及在中医药抗肿瘤中的应用[J ].中国中医基础医学杂 志，2000, 6(1) ：27—29.[36] 姚明，杨建平，王丽娜，等.腹水传代与体外培养Walker 256癌细胞系建立大鼠骨癌痛模型的可行性[J ].中华医学杂志，2008, 88(13) ：880-884.[37] 王红卫，卓忠雄，赵树文，等.大鼠Walker-256皮下移植瘤模型的建立及其超声评价* J ] •临床超声医学杂志，2007, 9(2) ：68—71.[38] Mandio R , Diinne A A , Eikelkamp N , et al. Expression of MMP 一3, MMP 一 13 , TIMP -2 and TIMP -3 in the VX2 carcinoma of the New Zealand white rabbit [ J +. Anticancer Research , 2002, 22(6A )：3 281.[39] Jiu AH , Xu H X , Liu W J , ei al Anti-tumor effect ot Rhapontic-um uniUorum in H22-bearing mica [ J +. chin J Exp Tradit MedForm (中国实验方剂学杂志),2011,17(5) ：165—167.[40] 赵方，胡明道，陈鹏.小鼠肝癌原位移植模型的建立及其研(1.吉林工程技术师范学院食品工程学院，吉林长春130052 ； 2.吉林农业大学动物科学技术学院 吉林省动物微生态制剂工程研究中心 教育部动物生产和产品质量安全重点实验室，吉林长春130118中图分类号：Q78文献标志码:A乳酸菌是一类可以发酵碳水化合物产生乳酸的兼性厌氧菌总称，包括乳球菌、乳杆菌、链球菌、片球菌和双歧杆菌等，美国食品和药品监督管理局 (FDA )将许多乳酸菌定义为“食品级”微生物，极少 数如化脓性链球菌，肺炎链球菌是致病菌。
乳酸菌基因组学与基因工程的研究新进展
乳酸菌基因组学与基因工程的研究新进展薛迎迎，杨汝德（华南理工大学生物科学与工程学院，广东 广州 510006）摘要：本文对乳酸菌基因组学的研究新进展，包括乳酸菌基因组测序、基因组的进化和基因转移、乳酸菌重要的功能基因等以及乳酸菌基因工程的研究新进展，包括乳酸菌食品级表达载体、食品级载体选择标记、活体疫苗载体等方面进行了概述。
关键词：乳酸菌；基因组学；基因工程中图分类号：Q939.1；文献标识码：A；文章篇号:1673-9078(2008)06-0617-04Advances in Genomics and Genetic Engineering of Lactic Acid BacteriaXUE Ying-ying, YANG Ru-de（College of Bioscience and Bioengineering, South China University of Technology, Guangzhou 510006, China）Abstract: In this paper, research advances in genomics of lactic acid bacteria were reviewed, including genome sequencing, evolution, gene transfer and functional gene. The recent advances in genetic engineering of lactic acid bacteria were also introduced, including food-grade expression vector, selective marker, and live vaccine vector.Key words: lactic acid bacteria; genomics; genetic engineering乳酸菌( lactic acid bacteria , LAB)，是一类能利用碳水化合物产生大量乳酸的革兰氏阳性细菌的通称，广泛存在于自然界中，被公认为是安全的食品级微生物。
乳酸杆菌及其体外表达系统在临床中的应用及其前景
乳酸杆菌及其体外表达系统在临床中的应用及其前景王青元;周颖【摘要】Lactobacillus is a kind of probiotics in vivo, regarded as food-grade microbe, which play an important part in disease prevention and treatment, anti-aging and anti-tumor. Current studies of lactobacillus are mainly focused on gene therapy, functional protein expression and novel vaccine vectors etc. , Major vaccines using lactobacillus as vectors are contraceptive vaccine and HPV vaccine. The enigeering of lactobacillus has demonstrated a more broad application prospects in disease prevention and treatment.%乳酸杆菌是人体中重要的益生菌,被公认为食品级的微生物,在疾病预防、治疗、抗衰老和抗肿瘤等方面发挥着重要的作用.目前,乳酸杆菌的研究主要集中于基因治疗、功能蛋白表达及作为新型疫苗载体等方面.以乳酸杆菌为载体的疫苗主要有避孕疫苗和人乳头瘤病毒疫苗等,工程化改造的乳酸杆菌在疾病预防和治疗中有着更为广阔的前景.【期刊名称】《医学综述》【年(卷),期】2011(017)017【总页数】4页(P2561-2564)【关键词】乳酸杆菌;基因表达;遗传载体【作者】王青元;周颖【作者单位】安徽医科大学附属省立医院妇产科分子实验室,安徽省分子医学重点实验室,合肥,230001;安徽医科大学附属省立医院妇产科分子实验室,安徽省分子医学重点实验室,合肥,230001【正文语种】中文【中图分类】R378.992乳酸杆菌，因发酵糖产生大量乳酸而命名。
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乳酸杆菌基因表达系统的研究进展徐义刚1,2,崔丽春1(1.东北林业大学,黑龙江哈尔滨150040; 2.东北农业大学动物医学院,黑龙江哈尔滨150030)摘要乳酸杆菌是人及动物肠道中重要的益生菌,被公认为安全级(generall y recognized as safe,GRA S)微生物。
乳酸杆菌表达系统是近几年发展起来的一种表达系统,随着乳酸杆菌分子生物学的发展、各类表达调控元件的分离,相继发展了乳酸杆菌的克隆载体、表达载体和整合载体。
乳酸杆菌具有免疫佐剂、吸附黏膜、抗胆汁酸能力,以乳酸杆菌为载体,作为外源基因的传递和表达系统,研制口服疫苗,刺激黏膜免疫系统产生有效的免疫应答,具有重要开发前景。
关键词乳酸杆菌;外源基因;表达系统中图分类号Q939.11+7文献标识码A文章编号1005-7021(2007)03-0087-05Progress on G ene E xpressi on Syste m of Lact obacill usXU Y-i gang1,2,C U I L-i chun1(1.N ort h e a stF orest ry Univ.H arbin150040;2.C oll.of Veteri nary M e d.N ort h e a st Agric.Un i v.H arbi n150030)A bstrac t Lactobacill us is a k i nd o f i m portant prob i o ti c i n gastro-i ntesti nal tracts o f hu m an and most an i m a l s,and t hey are conside red to be safe bacter i a w it h a GRA S(generall y regarded as safe)status.T he express i on syste m s o f Lactobacillus is a k i nd of expression sy stem tha t have been deve l oped i n recent yea rs,and as t he deve l op m en t of mo-lecu l ar b i o l ogy o f Lactobacillus,and the sepa ration o f var i ous expressi on regu l a t o ry ele m ents,t he c l on i ng vector,the expressi on vector,and the i ntegrati on v ector have been deve loped one a fter ano t ctobacillus possesses many properties such as i m mune ad j uvant,adsorpti on mucosa,ant-i b ile ac i d capab ili ty;take Lactobacillus as a vector trans-fero r and expressi on syste m s o f exogenous gene to study ora l vacc i ne,sti m u l ate mucosa i m m une syste m to produce e-f fecti ve i m mune responses,a ll o f these possess i m portant deve l op m ent prospect.K eywords Lact obacillus;exogenous gene;expressi on syste m乳酸菌(Lactic ac i d bacteria,LAB)是人及动物肠道中极为重要的益生菌群之一,该菌为兼性厌氧的革兰氏阳性菌,是乳品工业发酵的重要菌类,是在食品、医药工程领域具有重要应用前景的食品级微生物,包括乳酸球菌、乳酸杆菌、双歧杆菌等十几个属。
20世纪80年代,人们开始致力于乳酸菌生物学性质和分子机制的研究,乳酸杆菌在农业、食品领域所具有的重大经济意义及对人体和动物健康的重要性,越来越引起人们的关注。
随着乳酸杆菌分子生物学的发展和电转基因技术的建立,以及各类表达调控元件的分离和克隆,已经建立和发展了一系列乳酸杆菌基因表达载体和传递系统,为探索其新的应用潜力提供了基础,其中利用乳酸杆菌作为抗原传递载体进行粘膜疫苗免疫的研究,是该领域研究的前沿和热点。
本文主要对乳酸杆菌表达系统方面的进展作一综述。
1乳酸杆菌作为外源基因表达宿主菌的优势乳酸杆菌作为主要的益生菌广泛应用于食品及饲料加工业,在功能食品、医疗保健、微生态制剂等领域的应用具有诱人的前景[1]。
目前,乳酸杆菌制剂已被应用于肠道的微生态治疗[2]。
乳酸收稿日期:2006-09-19作者简介:徐义刚男,博士。
从事病原微生物与免疫学研究。
87微生物学杂志2007年5月第27卷3期J OURNAL OF M ICROBIOLOGY M ay2007V o.l27N o.3杆菌另一个在医学领域具有应用潜力的是作为免疫接种的疫苗载体[3~5]。
乳酸杆菌作为外源基因表达宿主菌,其优越性主要表现在:¹乳酸杆菌能在呼吸系统、消化系统[6]、泌尿系统定植,对维持微生态平衡具有重要作用;º在食品工业各个领域中长期应用已证实不具有致病性,被公认为安全级(GRAS,genera ll y recognized as sa fe)微生物,身为食品级细菌,易构建成食品级的基因克隆及表达系统,可以有效提高基因工程产品的安全性,并可在一定程度上简化表达产物的后期处理工艺;»具有控制肠道感染、增加某些食物的营养价值、控制血清胆固醇水平、改善乳糖代谢、诱导体内特异性及非特异性免疫应答以及抗肿瘤活性等功能[7];¼同肠胃外免疫途径相比,通过黏膜免疫,可以诱发I g A产生;½具有免疫佐剂作用、固有免疫原性及对胆汁酸的抵抗力。
因此,乳酸杆菌作为基因工程受体菌的应用前景十分广阔。
2乳酸杆菌质粒乳酸杆菌的许多种类中均发现有质粒的存在,且多种乳酸杆菌均具有1个或多个质粒谱。
用DNA-c DNA杂交和核苷酸序列分析证实,各种质粒之间具有不同程度的同源性,从而说明质粒间的横向传递和重组是相当频繁的。
最近几年开展了有关质粒与细菌特性关系的研究,发现质粒与某些表型,如抗药性、N-乙酰氨基葡萄糖减缓酸的形成、糖苷的代谢、糖代谢、氨基酸代谢、细菌素产生与免疫等密切相关。
大多数乳酸杆菌质粒表现出分离稳定性,尤其是小的隐性质粒较大质粒相对更加稳定。
经研究表明乳酸杆菌质粒具有如下特点:¹大多数乳酸杆菌质粒均为隐蔽型质粒,但已证明某些乳酸杆菌的细菌素、糖代谢有关的酶及抗生素抗性等都是由不同质粒所决定的;º乳酸杆菌质粒具有遗传稳定性;»乳酸杆菌中小型质粒拷贝数高,一般可达30~50个;¼部分乳酸杆菌质粒复制子宿主范围广泛,可在其他种类的革兰阳性菌及大肠杆菌中发挥作用,避免了专一性质粒在不同菌株之间使用时不必要的亚克隆;½乳酸菌属的某些菌株的质粒也可作为乳酸杆菌的质粒,如由宿主范围广的乳酸球菌质粒pGK12构建出的乳酸杆菌基因转化系统;¾某些乳酸杆菌质粒没有宿主特异性,如pLP501、pLPE323适用于广泛宿主范围,可在不同种类乳酸杆菌中增殖,而且它们的扩增拷贝数没有明显不同,这说明其在不同宿主菌中DNA复制调控机制是相似的。
表1列出了从乳酸杆菌中分离的质粒及构建的质粒。
表1乳酸杆菌中分离及构建的质粒Tab le1S egregat ed and constru cted p l as m i ds fro m Lac t obacill us菌种分离质粒构建质粒L b.re u teri pGT232pNCK HpTE80/15pUE80L b.h i gard ii pLAB1000pLABpL AB2000L b.plantarum p8014-2pLPL b.fe rm e n t um pLE M3pLEM7、pLEM415pLF1311pLF9/14L b.pe n tosu s pLP3537pLPEW1/2、pLPE323/317p353-2pLPE323/350L b.he l ve tic us pLJ1PLHR、pBG103乳酸杆菌质粒基因表达调控随着乳酸杆菌分子生物学及基因工程技术的发展,已分离出了乳酸杆菌的各种表达调控元件,对乳酸杆菌基因转录和翻译调控及蛋白质分泌机制有了进一步的了解,并通过对部分质粒DNA序列的测定,然后同已知序列质粒的基因进行比较来推测未知质粒基因功能的途径,相继开发出了乳酸杆菌的克隆载体、表达载体、整合载体[8]。
研究发现乳酸杆菌质粒基因中普遍存在两种调控序列,一种是与基因复制起始相关的序列,主要包括两大类:一类是编码蛋白的开放阅读框架ORF,在乳酸杆菌中与质粒复制相关的ORF之间存在同源性。
另一类是与调控有关的非编码序列,主要包括复制相关蛋白作用的靶序列、正-负向复制起始点、缺失位点、启动子等复制调控元件。
其中乳酸杆菌的启动子对LAB具有高度的选择性[9],故在LAB表达系统中,很少使用外源启动子,目前已成功用于表达外源蛋白的启动子有lac A、lac R、lacF、T7、xy l A、lacS、n is A/n isZ、nisF、usp等,这些启动子的诱导物都是食品级的,如乳糖、木糖和N isin等,易于构成食品级LAB表达系统,提高转基因LAB工程菌株的安全性;另一种88微生物学杂志27卷是控制质粒拷贝数和不相容性的DNA序列。
质粒的拷贝数是由DNA非编码序列中的重复序列和反转录RNA来控制的。
除pLJ1外,所有质粒都有与革兰阳性杆菌质粒复制蛋白(Rep)相似的一种蛋白,根据复制蛋白的功能特性,及和其他质粒复制蛋白结构相似性,推测乳酸杆菌属的小质粒是以滚环(RCR)方式进行复制的,可产生单股DNA中间体的积累[10]。
因此具有滚环复制所必需的复制启动元件,这些结构包括正-负复制起始点、复制控制元件和移动元件等,这些序列或元件与其他源于革兰氏阳性菌的质粒的相应区域的广泛的同源性,推测乳酸杆菌质粒的这些序列或元件是通过基因内或基因间传递机制而获得的。
4乳酸杆菌质粒的选择性标记传统的乳酸菌载体都带有一个或多个编码特定抗生素(如红霉素、氯霉素等)抗性的基因,如果将抗生素抗性基因投放到环境中或人和动物体内,由于抗性因子的转移,将带来生物安全性的严重后果。