酶促反应动力学实验

酶促反应动力学实验 Document serial number【UU89WT-UU98YT-UU8CB-UUUT-UUT108】

实验 酶促反应动力学

————蔗糖酶米氏

常数的测 【目的要求】

1．了解酶促动力学研究的范围。

2．以蔗糖酶为例，掌握测定米氏常数(Km) 【实验原理】

在酶促反应中，当反应体系的温度、pH 和酶浓度恒定时，反应初速度(v)则随底物

浓度[S]的增加而加速，最后达到极限，称为最大反应速度(v)。Michaelis 和Menten

根据反应速度与底物浓度的这种关系，推导出如下方程：

]

[]

[S k S V v m +=

此式称为米氏方程，式中Km 称为米氏常数，按此方程，可用作图法求出Km 。方法有： 1．以v[S]作图

由米氏方程可知，v=V ／2时，Km ＝[S]即米氏常数值等于反应速度达到最大反应速度一半时所需底物浓度。因此，可测定一系列不同底物浓度的反应速度v,以v 对[S]作图。当v ＝V ／2时，其相应底物浓度即为Km 。

2．以1／v 对1／[S]作图

取米氏方程的倒数式：

V

S V k v m 1][11+•=

以1／v 对1／[S]作图可得一直线，其斜率为Km ／V ，截距为1/V 。若将直线延长与横轴相交，则该交点在数值上等于—l ／Km 。

本实验以蔗糖为底物．利用一定量蔗糖酶水解不同浓度蔗糖所形成的产物(葡萄糖和果糖)的量来计算蔗糖酶的Km 值。葡萄糖和果糖能与3，5—二硝基水杨酸试剂反应，生成桔红色化合物，可于520nm 处比色测定之。 【试验材料】 1．试剂

(1)标准葡萄糖溶液：准确称取100mg 葡萄糖溶于少量饱和的苯甲酸溶液%)，再转移到100ml 容量瓶中，用饱和苯甲酸溶液稀释到刻度，混匀，即得浓度为1mg ／m1的标准葡萄糖溶液。冰箱贮藏可长期保存； (2)的L 醋酸缓冲液：取lmol/L 醋酸钠溶液43m1及lmol ／L 醋酸溶液57m1，稀释至1000m1即得；

(3)的10％蔗糖溶液：准确取l0g蔗糖溶于少量的／L醋酸缓冲液，转移到100ml容量瓶中，用同样缓冲液稀释到刻度备用；

(4)3，5—二硝基水杨酸试剂：溶液I：％NaOH溶液300m1，1％3，5一二硝基水杨酸溶液880m1及酒石酸钾钠(KNaC4O6·4H20)255g三者一起混合均匀。

溶液Ⅱ：取结晶酚10g及lo％NaOH溶液22m1，加蒸馏水稀释成100ml，混匀。

溶液Ⅲ：取溶于64ml溶液n中。

将溶液皿和溶液I混合，激烈振摇混匀，即得3，5—二硝基水杨酸溶液，放置一周后备用。

(5)酵母蔗糖酶溶液：称取鲜酵母l0g于研钵中，加少量细砂及10一

15ml蒸馏水研磨。磨细后置冰箱中，过滤，滤液加2—3倍体积冷丙酮，搅拌均匀后离心，沉淀用丙酮洗两次，真空干燥得固体粉末状酶，再溶于100ml蒸馏水，即得酶溶液。若有不溶物可用离心法除去。

该酶液活力以6—12单位为佳。蔗糖酶活力单位的定义为：在一定条件下反应5min，每产生lmg葡萄糖所需要的酶量。备用。

2．器材

(1)100m1三角烧瓶2只；

(2)研钵1只；

(3)50m1及100m1容量瓶各1只；

(4)离心机1台(4000rpm)；

(5)糖管8支；

(6)恒温水浴1台；

(7)吸量管：×2支；

(8)秒表1只；

(9)72l型分光光度计1台。

【实验方法】

1．标准曲线的绘制

取干净糖管6支，如下表所示添加试剂。

加毕混匀．于沸水中准确煮5min，取出用自来水冷却3min，稀释至

25ml，混匀后以零号管调零点，于520nm处测定吸光度。以葡萄糖含量为横坐标，以吸光度为纵坐标作图。

2．根据活力选择酶浓度

将10％蔗糖溶液稀释成的％的溶液，取此溶液5m1于试管中，共加两管。

将两管同时置于25℃水浴中保温5min，然后向管中加入蔗糖酶溶液，立即混匀，

同时用秒表计时，准确反应5min后，立即加入LNaOH溶液终止酶反应。另

一管先加入溶液，再加入蔗糖酶溶液(此为对照管)。

取干净糖管3支，第l、2管分别加入上述反应液各及水各，第3管加蒸馏水，然后各管均加二硝基水杨酸溶液。置沸水浴中煮5min，取出后经自来水冷却3min，加水至25m1，混匀，以第3管调零点，于520nm 处测吸光度值。以测定管的吸光度值减去对照管吸光度值，求得的差值从标准曲线上查得相应的葡萄糖含量，并乘以ll，即为每1ml酶溶液的活力。

测定管中因酶催化水解而产生的葡萄糖含量以在—之间为佳，过高或过低均应适当改变蔗糖酶溶液的浓度或反应液用量后再测。

3．底物浓度对酶促反应速度的影响——米氏常数购测定

取试管7支，按下表所示加入试剂。

当加完蔗糖溶液及醋酸缓冲液后，均放置室温或恒温水浴(20℃或25℃)保

温5min，再分别依次向各管加入蔗糖酶溶液，立即摇匀．记录时间。准确反应

5min，再准时加入L的NaOH溶液，立即摇匀，以终止反应。

测定管反应完成后，取8支洁净糖管，前7支分别加入相应的上述反应液各及

蒸馏水各，第8支糖管加入蒸馏水作空白，然后各管均加入二硝基水

杨酸溶液，沸水浴5min。取出用自来水冷却3min，稀释到25m1，混匀，于520nm处比色

测定并记录吸光度值。

对照管的测定与测定管的操作相同。

【结果处理】

根据各测定管的吸光度值(需减去相应对照管的吸光度值)，从标准曲线上查出相应的还原糖毫克数(以在0．4一1．6mg范围内为佳，否则应调整反应液用量后重新测定)，再乘以11，即得各管的产物量，然后分别计算各反应管相应的[S]、l／[S]、v及1/v，并作出v—[S]及1/v—1／[S]曲线。再根据所作的两种动力学曲线，分别求出酵母蔗糖酶的Km 值，并加以比较。

上述数据可记录在下表中。

酵母蔗糖酶的提取

实验原理：