生化药物制备第二章基因工程制药
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第二章基因工程制药新版3
第二章基因工程制药新版3
（3）化学合成法的实例
讫今为止，通过化学合成方法已经了近百种产 物的基因。主要有以下种类：
细菌酪氨酸t-RNA 人生长激素 α干扰素 γ干扰素 血管紧张素 人胰岛素 人生长激素抑制释放因子 溶菌酶 组织血纤维蛋白溶酶原激活剂
第二章基因工程制药新版3
3、逆转录法
（1）逆转录法的理由 （2）逆转录法的理论依据 （3）逆转录所产生的DNA的特性 （4）逆转录法的具体步骤 （5）逆转录法的实例
表达型----是指重组后插入的cDNA能够经过转录、翻译，最 终合成蛋白质。
非表达型----是指重组后插入的cDNA不能经过转录、转译， 合成蛋白质。
表达型 非表达型
质粒 PUC pBR322
噬菌体 λgt11 λgt10
第二章基因工程制药新版3
•（D2）、cDNA的片段与载体的连 接
（1）借助同型多聚体尾巴的连接方法----用3-末端脱氧核 苷酸转移酶催化，在cDNA的3’末端加上polyG（或者 polyT）的尾巴、而在载体的末端加上polyC（或者 polyA） 的尾巴，就能够实现cDNA的片段与载体DNA的连接。
经过2-3次寡聚脱氧胸腺苷酸Oligo dT-纤维素柱 之后，就可得到较高纯度的mRNA。
第二章基因工程制药新版3
• mRNA的分 离
•Oligo-dT纤维素柱
•O第二li章g基o因-工d程制T药磁新版珠3 法
•B、cDNA第一链的合成
由于mRNA的3’端常含polyA，所以可用寡聚 脱氧胸腺苷酸Oligo dT做引物，在逆转录酶催 化下，合成cDNA。
第二章基因工程制药新版3
•（2）逆转录法的理论依据
逆转录法就是从 mRNA→cDNA→DNA→mRNA→Protein的方 法。
（3）化学合成法的实例
讫今为止，通过化学合成方法已经了近百种产 物的基因。主要有以下种类：
细菌酪氨酸t-RNA 人生长激素 α干扰素 γ干扰素 血管紧张素 人胰岛素 人生长激素抑制释放因子 溶菌酶 组织血纤维蛋白溶酶原激活剂
第二章基因工程制药新版3
3、逆转录法
（1）逆转录法的理由 （2）逆转录法的理论依据 （3）逆转录所产生的DNA的特性 （4）逆转录法的具体步骤 （5）逆转录法的实例
表达型----是指重组后插入的cDNA能够经过转录、翻译，最 终合成蛋白质。
非表达型----是指重组后插入的cDNA不能经过转录、转译， 合成蛋白质。
表达型 非表达型
质粒 PUC pBR322
噬菌体 λgt11 λgt10
第二章基因工程制药新版3
•（D2）、cDNA的片段与载体的连 接
（1）借助同型多聚体尾巴的连接方法----用3-末端脱氧核 苷酸转移酶催化，在cDNA的3’末端加上polyG（或者 polyT）的尾巴、而在载体的末端加上polyC（或者 polyA） 的尾巴，就能够实现cDNA的片段与载体DNA的连接。
经过2-3次寡聚脱氧胸腺苷酸Oligo dT-纤维素柱 之后，就可得到较高纯度的mRNA。
第二章基因工程制药新版3
• mRNA的分 离
•Oligo-dT纤维素柱
•O第二li章g基o因-工d程制T药磁新版珠3 法
•B、cDNA第一链的合成
由于mRNA的3’端常含polyA，所以可用寡聚 脱氧胸腺苷酸Oligo dT做引物，在逆转录酶催 化下，合成cDNA。
第二章基因工程制药新版3
•（2）逆转录法的理论依据
逆转录法就是从 mRNA→cDNA→DNA→mRNA→Protein的方 法。
2第二章--生物制药工艺基础
第二节 微生物制药工艺技术基础
一、菌种的分离与筛选
1．含菌样品收集 2. 富集培养：“投其所好”，“取其所抗” 3. 菌种纯化：（1）平板划线法 （2）稀释平板法 4. 性能测定（菌种复筛）
（1）平板划线法
是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀 释而达到分离的目的。固体培养基四区划法接种法步骤：
二、菌种的选育与保藏
1．自然选育
依据自发突变原理，通过不断分离、筛选，除去 衰变菌落，从中选择维持原有生产水平的菌株或高产 突变株，达到纯化、复壮、稳定生产目的。
单孢子菌悬液的制备→分离→单菌落培养→筛选
2．诱变育种
指有意识地将生物体暴露于物理的、化学的或生物的一种 或多种诱变因子，促使生物体发生突变，进而从突变体中 筛选具有优良性状的突变株的过程。
优点是生产规模大、蒸发温度低、速度快， 目的是除去挥发性溶剂，保持物料生物活性， 加速蒸发原理是使液体形成薄膜，增加气化表面
积。
世界上最大的具有80m2蒸发面 积的薄膜蒸发器。
实验室常用真空旋转蒸发仪。
薄膜蒸发器
2.干燥
使物质从固体或半固体状经除去存在的水分或它种 溶剂，从而获得干燥物品的过程。
第二章 生物制药工艺技术基础
Basis of biopharmaceutical technology
生化制药工艺技术基础 微生物制药工艺技术基础 生物技术制药工艺技术基础 生物制药中试放大工艺设计 生物药物的研究与新药申报
本章学习目标
掌握：生化活性物质的提取、分离和纯化； 微生物菌种选育和培养。
②pH；
③盐；
④表面活性剂。
四、生化活性物质浓缩与干燥
1.浓缩方法： 生化活性物质的热不稳定性 ①盐析，中性盐硫酸铵沉淀蛋白（酶）； ②有机溶剂沉淀，生物大分子溶液
生物制药：基因工程制药2
影响蛋白质的活性和包含体的形成
4、溶解氧
影响菌体代谢的一个重要参数，对菌体的生长和产物 的生成影响很大 外源基因的高效表达和翻译需要维持较高水平的DO2值 （>40%） 调节搅拌转速法，可以改善培养过程中的氧供给，提高活 菌产量
5、诱导时机
一般在对数生长期或对数生长后期升温诱导表达
6、诱导表达程序 热诱导 7、pH pH对细胞的正常生长和外源蛋白的高效表达都有
获得微生物自身基因表 达所产生的初级或次级 代谢产物
工艺要求：外源基因既高效表达，又有利于 产品分离纯化。对发酵影响较大的几个因素有： 1. 培养基的影响 2. 接种量的影响 3. 温度的影响 4. 溶解氧的影响 5. 诱导时机的影响 6. 诱导表达程序的影响 7. pH的影响
1、培养基
提高工程菌生长速率，保持重组质粒的稳定性，使外源基因能 够高效表达 常用碳源：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等
发酵液
细胞分离 胞内产物
细胞破碎
固液分离
包含体
细胞碎片分离
变性
复性
胞外产物 浓缩 初步分离 高度纯化 制剂 产品
一般不应超过4～5个步骤 细胞破碎 固液分离 浓缩与初步纯化 高度纯化直至得到纯品以及成品加工
捕获阶段：目标是澄清、浓缩和稳定目标蛋白
中度纯化阶段：目标是除去大多数大量杂质， 如其它蛋白、核酸、内毒素和病毒等
培养基组成：限制培养基比丰富培养基更有利于稳定 培养温度：较低的培养温度有利于重组质粒的稳定
(七) 基因工程菌中试、培养 及高密度发酵
基因工程菌的培养过程
(1) 通过摇瓶操作了解工程菌生长的基础条件， 如温度、pH、培养基各种组分以及碳氮比，分 析表达产物的合成、积累对受体细胞的影响；
4、溶解氧
影响菌体代谢的一个重要参数，对菌体的生长和产物 的生成影响很大 外源基因的高效表达和翻译需要维持较高水平的DO2值 （>40%） 调节搅拌转速法，可以改善培养过程中的氧供给，提高活 菌产量
5、诱导时机
一般在对数生长期或对数生长后期升温诱导表达
6、诱导表达程序 热诱导 7、pH pH对细胞的正常生长和外源蛋白的高效表达都有
获得微生物自身基因表 达所产生的初级或次级 代谢产物
工艺要求：外源基因既高效表达，又有利于 产品分离纯化。对发酵影响较大的几个因素有： 1. 培养基的影响 2. 接种量的影响 3. 温度的影响 4. 溶解氧的影响 5. 诱导时机的影响 6. 诱导表达程序的影响 7. pH的影响
1、培养基
提高工程菌生长速率，保持重组质粒的稳定性，使外源基因能 够高效表达 常用碳源：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等
发酵液
细胞分离 胞内产物
细胞破碎
固液分离
包含体
细胞碎片分离
变性
复性
胞外产物 浓缩 初步分离 高度纯化 制剂 产品
一般不应超过4～5个步骤 细胞破碎 固液分离 浓缩与初步纯化 高度纯化直至得到纯品以及成品加工
捕获阶段：目标是澄清、浓缩和稳定目标蛋白
中度纯化阶段：目标是除去大多数大量杂质， 如其它蛋白、核酸、内毒素和病毒等
培养基组成：限制培养基比丰富培养基更有利于稳定 培养温度：较低的培养温度有利于重组质粒的稳定
(七) 基因工程菌中试、培养 及高密度发酵
基因工程菌的培养过程
(1) 通过摇瓶操作了解工程菌生长的基础条件， 如温度、pH、培养基各种组分以及碳氮比，分 析表达产物的合成、积累对受体细胞的影响；
生物技术制药-第二章-基因工程制药(201309-201401-2)
7、目的cDNA克隆的分离和鉴定
cDNA克隆示意图
mRNA
逆转录酶
ss-DNA
DNA聚合酶I Klenow片段
ds-cDNA 核酸酶S1
ds-cDNA
二、逆转录－聚合酶链反应法（RT-PCR）
1985，PCR发明以后，RT-PCR得到了广泛的应用。
特异引物 mRNA 逆转录酶 ss-DNA PCR 目的cDNA链
优点：表达产物可由重组转化细胞分泌到培养 液中，纯化容易。产物是糖基化的接近天然物。 缺点：生长慢，生产率低，培养条件苛刻，费 用高，培养液浓度稀。
二、大肠杆菌体系中的基因表达
（一）表达载体 表达载体必须具备的条件
（1）载体能独立地进行复制 (复制起点，ori)
（2）应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记
核酸酶S1
第三节 目的基因的获得
克隆真核基因常用方法：逆转录法和化学合 成法。（不能直接分离？）
一、逆转录法
逆转录法就是先分离纯化目的基因的mRNA，再 反转录成 cDNA，然后进行 cDNA 的克隆表达。 cDNA与模板mRNA序列严格互补，而不含内含子。
逆转录法的步骤
1、mRNA的纯化 2、cDNA第一链的合成 3、cDNA第二链的合成 4、cDNA克隆
利用基因工程技术生产药品的优点：
（1）可以大量生产过去难以获得的生理活性蛋 白和多肽； （2）可以提供足够数量的生理活性物质；
（3）利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的
内源性生理活性物质；
（4）基因工程和蛋白质工程进行改造和去除 内源性生理活性物质的不足之处。 （5）利用基因工程技术可获得新型化合物，
又分为普通表达载体和精确表达载体
第二章基因工程制药新版2
（三）基因工程载体的种类
1、细菌质粒 2、真核基因病毒DNA 3、λ噬菌体DNA 4、单链DNA噬菌体M13载体 5、人工质粒载体----科斯质粒 6、酵母人工染色体 7、其他载体
1、细菌质粒
（1）质粒的定义 （2）质粒的特性 （3）质粒的分类 （4）质粒载体的具备条件 （5）常用的细菌质粒
（1）质粒的定义
质粒载体(plasmid)
存在于天然细菌体内 的一种独立于细菌 染色体之外的双链 环状DNA，具有独 立复制的能力，常 带有细菌的抗药基 因。也存在于某些 真核细胞（酵母的 2μ环状质粒）
（2）质粒的特性
独立于细菌染色体之外的环状DNA或RNA。 其遗传特性属于非染色体控制。 能够进行自我复制。 容易在宿主体内进行转移和迁移。
单链切割 连接
线性DNA （L型）
开环DNA
（oc型）
单链切割 连接
共价闭合环形DNA （SC型）
环形双链的质粒DNA分子具有三种不同构型
（3）质粒的分类
F质粒----可使宿主A的部分基因随着F质粒一起 转移到不存在该质粒的另一宿主B的体内。
R质粒----可编码宿主A的一种或者数种抗生素抗 性基因，并能够将它们带到不存在该质粒的另 一宿主B的体内，使得宿主B也获得同样的抗性。
（A2）、SV40病毒DNA的基因 组
（A3）、SV40病毒DNA载体的 构建
（A4）、SV40病毒DNA载体的使用方法
[G]、腺病毒
（G1）、腺病毒DNA载体 （G2）、腺病毒DNA载体的特
点
3、λ噬菌体DNA
（1） λ噬菌体DNA的特性 （2） λ噬菌体DNA的改造 （3） λ噬菌体DNA的体外包装 （4） λ噬菌体载体的构建 （5） λ噬菌体载体的使用 （6） λ噬菌体载体的优点
生物技术制药：2-基因工程制药-2
下相 杂蛋白 （核酸、多糖）
上相 目的蛋白
白 流 程
第三步两相萃取
静置分层 +盐
下相 目的蛋白
上相 杂蛋白、 PEG、色素
（二）基因重组蛋白的主要纯化技术
➢ 分离纯化目的产物主要依赖于色谱分离技术。色谱 技术分为：
Ion exchange chromatography (IEC) Gel filtration chromatography (GFC) Hydrophobic interaction chromatography (HIC) Affinity chromatography (AC)
二、基因重组蛋白的分离纯化与分析鉴定 (自学）
基因重组蛋白的特点
➢ (1) 目的产物在初始原料中的含量较低; ➢ (2) 含目的产物的初始物料组成复杂,除了目的
产物外,还有大量的细胞、代谢、残留培养基、 无机盐等，特别是产物类似物对目的产物的分 离纯化影响很大；
➢ (3) 目的产物的稳定性差，具有生物活性的物质对 pH、温度、金属离子、 有机溶剂、剪切力、表面张 力等十分敏感，容易是其失活、变性；
① 等电点沉淀法
➢ 两性电解质分子上的净电荷为零时溶解度最低，不 同的两性电解质具有不同的等电点，以此为基础可 进行分离。
✓ 如工业上生产胰岛素时，在粗提液中先调pH8.0去除碱性 蛋白质，再调pH3.0去除酸性蛋白质。
② 盐析法
定义：在稀盐溶液中，蛋白质的溶解度随盐浓度 的增加而升高的这种现象称为盐溶(salting in), 但 当盐浓度增加到一定量时，其溶解度又逐渐下降， 直到某一浓度时便从溶液中沉出，即为盐析 (salting out)
➢ 几种盐的盐析能力的排列次序：
• 磷酸钾>硫酸钠>磷酸铵>柠檬酸钠>硫酸镁。
基因工程制药2课件
（4）大肠杆菌中不存在翻译后的修饰系统，不能对 蛋白质产物进行糖基化. （5）大肠杆菌内的蛋白酶会对目的蛋白质造成破坏。 （6）大肠杆菌会产生内毒素，难以除去。
2、枯草芽孢杆菌
优点： （1）分泌能力很强，可以将蛋白质产物直接分 泌到培养液中。 （2）不会形成包含体。
缺点： （1）不能使蛋白质产物糖基化。 （2）枯草芽孢杆菌具有很强的胞外蛋白酶分泌 系统，常常对蛋白质产物造成破坏。
质粒pBV220的结构框：（图2－3）
ori-------复制起始点；
clts857-------抑制子基因，在31℃时，其基因产物 具有阻抑PL的活性，当温度升高时，这种阻抑活 性就丧失，PL就开始指导合成mRNA；
PR-------启动子1；PL--------启动子2； BglII、EcoRI、SmaI、BamHI、SalI、PstI、
缺点： （1）生产慢、 （2）生产率低、 （3）培养条件苛刻、费用高， （4）培养液浓度较稀。
二、大肠杆菌体系中的基因表达
（一）表达载体 （二）影响真核基因在大肠杆菌中表达的因素 （三）真核基因在大肠杆菌的中表达的形式
（一）表达载体
表达载体必须具备的条件：
（1）载体能独立地进行复制：分严紧型和松弛型，前 者在宿主细胞中拷贝数仅1~3个，后者在宿主细胞中 拷贝数可高达3000个。
表达载体必须具备的条件
（6）所产生的mRNA必须具有翻译的起始信 号，即起始密码AUG和SD序列（ShineDalgarno sequence），以便转录后能顺利翻译。
大肠杆菌表达载体的构成：
复制及选择系统 （载体）
转录系统
（目的基因）
蛋白质翻译系统 （目的蛋白）
23
外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理：
2、枯草芽孢杆菌
优点： （1）分泌能力很强，可以将蛋白质产物直接分 泌到培养液中。 （2）不会形成包含体。
缺点： （1）不能使蛋白质产物糖基化。 （2）枯草芽孢杆菌具有很强的胞外蛋白酶分泌 系统，常常对蛋白质产物造成破坏。
质粒pBV220的结构框：（图2－3）
ori-------复制起始点；
clts857-------抑制子基因，在31℃时，其基因产物 具有阻抑PL的活性，当温度升高时，这种阻抑活 性就丧失，PL就开始指导合成mRNA；
PR-------启动子1；PL--------启动子2； BglII、EcoRI、SmaI、BamHI、SalI、PstI、
缺点： （1）生产慢、 （2）生产率低、 （3）培养条件苛刻、费用高， （4）培养液浓度较稀。
二、大肠杆菌体系中的基因表达
（一）表达载体 （二）影响真核基因在大肠杆菌中表达的因素 （三）真核基因在大肠杆菌的中表达的形式
（一）表达载体
表达载体必须具备的条件：
（1）载体能独立地进行复制：分严紧型和松弛型，前 者在宿主细胞中拷贝数仅1~3个，后者在宿主细胞中 拷贝数可高达3000个。
表达载体必须具备的条件
（6）所产生的mRNA必须具有翻译的起始信 号，即起始密码AUG和SD序列（ShineDalgarno sequence），以便转录后能顺利翻译。
大肠杆菌表达载体的构成：
复制及选择系统 （载体）
转录系统
（目的基因）
蛋白质翻译系统 （目的蛋白）
23
外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理：
生物制药--基因工程制药--ppt课件可编辑全文
组建重组质粒 构建基因工程菌或细胞
前5个步骤是上游过程
培养工程菌
后4个步骤是下游过程
产物分离纯化
除菌过滤
半成品和成品鉴定
包装
基因工程制药
2.1 目的基因的获得
逆转录法
• 从真核细胞中提取产生该蛋白质的 mRNA 并纯化 （oligo-dT 亲和层析法）
• 借助于逆转录酶，以 mRNA 为模板，以 oligo-dT 为引物， 进行第一链 cDNA 的合成
• 酶解除去 mRNA 链； • 通常在合成 cDNA 第一链后直接 PCR 扩增，即“逆转录
－PCR法”
基因工程制药
2.1 目的基因的获得
逆转录法
基因工程制药
2.1 目的基因的获得
从基因组中直接分离
• 随机断裂法：将基因组 DNA 用内切酶切成多个片段，然 后将这些片段混合物随机重组入适当载体、转化、扩增， 再筛选出所需的基因片段
基因工程制药
2.2 基因载体的选择
质粒载体 —— pET-32a(+)
E. coli 中表达的优良载 体。
pET-32a(+) 具有 Ampr 抗性，酶切位点丰富。含 T7lac 启动子；含有 T7.Tag 和 His-Tag 融合标签，便于 检测和纯化目标蛋白。
基因工程制药
2.2 基因载体的选择
Escherichia coli Rye13
Hae III G GCC
Haemophilus aegyptius
Hind III A AGCTT
Haemophilus influenzae
Hpa I GTT AAC（平末端）
Haemophilus parainfluenzae
生物制药技术-第二章-基因工程制药(1,2,3,4小节)
Richard Young和Ronald Davis设计的λgtl0和 λgtDNA便十 分有效地产生许多克隆，每纳克cDNA可产生 5000个克隆，另方面可容纳较大相对分子质量 的外源DNA片段。由于噬菌斑的筛选和操作较 筛选细菌主中，λgtl0载体对于未携带cDNA的噬菌体的 裂解生长有很强的生物学选择作用。cDNA 插 入到λgtl0可使噬菌体阻遏物基因(c 1)失活。
1. MRNA的纯化
反转录法的前提是必须首先得到该目的基因的mRNA，而要 分离纯化目的基因的mRNA，其难度几乎不亚于分离目的基 因。细胞内含有3种以上RNA，mRNA占细胞内RNA总量的 2%~5%，相对分子质量大小很不一致，由几百到几千个核苷 酸组成。在真核细胞中mRNA的3'末端常含有一多聚腺苷酸 （polyA)组 成的末端，长达20~250个腺苷酸，足以吸附于寡 聚脱氧腺苷酸Oligo(dt)-纤维素上，可以用亲和层析法将mRNA 从细胞总RNA中分离出来。利用mRNA的3'末端含有polyA的 特点，在RNA流经寡聚（dt）纤维素柱时，在高盐缓冲液的 作用下，mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度 洗脱时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，mRNA被i洗脱下来， 经过两次寡聚(dt)纤维素往后，可得到较高纯度的mRNA。
我国基因工程药物研究和开发起步较晚，基础较差。 20 世纪70年代末以来，开始应用 DNA重组技术、淋 巴细胞杂交瘤技术、细胞培养、克隆表达等技术开 发新产品和改造传统制药工艺。几十年来，在国家 汁划，特别是国家"863"高技术计划的优先支持下， 使这一领域迅速发展，缩短了我国与世界先进国家 的差距。"863"高技术计划在生物技术领域内研究的 三个主题之一是新型药物、疫苗与基因治疗，重点 是利用现代生物技术手段，开发化学合成法难以生 产的医药产品，如肝炎、肿瘤、传染病和心脑血管 疾病预防、诊断和治疗的生物技术医药产品。
生物化学2基因工程制药(2)
菌体浓度OD 葡萄糖
乙酸
重组 蛋白
3、 连续培养（continuous culture）
培养开始时为分批培养，培养至一定程度后，连续 不断的补加新鲜培养基同时排出等量培养液。 一定时间后，细胞浓度和培养基中各种物质浓度 均保持不变。 基因工程菌不稳定，很难连续培养。
4、透析培养（dialysis culture）
2.5 基因工程菌的稳定性
一、 质粒的不稳定性 （1）分裂不稳定性 工程菌分裂时出现一定比例不含质粒的子代菌。
相关因素： 质粒的丢失率（宿主菌、质粒特性和培养条件） 含质粒菌与不含质粒菌的生长速度差异
（2）结构不稳定 DNA从质粒上丢失、质粒上序列发生重排等。
二、 提高质粒稳定性的方法
1. 选择合适的宿主菌株 2. 选择合适的载体 低拷贝数质粒丢失的频率较大 含高拷贝数质粒的菌比生长速度明显低于不含质粒菌。 3. 加入抗生素
（4）细菌、酵母、真菌、支原体、病毒 微生物学方法 （5）其他物质 抗生素 牛血清 采用了抗体亲和层析，检测小鼠IgG含量。 5.稳定性检测 在不同温度下保存，定期取样检测生物活性及其他 特性的变化。 6.一致性 各批次产品均符合标准规格。
产品的保存：
液态保存 低温： -20℃、 -80℃和液氮、短期4℃ 稳定的pH 高浓度 加保护剂：糖类、脂类、蛋白类、还原剂（二硫苏 糖醇）等 固体保存 含水量5%以下， 4℃长期保存 冷冻干燥 冻干过程中加保护剂：低分子化合物（葡萄糖、蔗 糖等）、高分子物质（糊精、血清）
离子交换层析凝胶过滤疏水层析亲和层超滤六非蛋白类杂质的去除热原脂多糖超滤阴离子交换疏水层析多黏菌素b亲和层析病毒紫外线照射40nm膜过滤七选择分离纯化方法的依据根据产物表达形式来选择分泌表达超滤沉淀胞内可溶表达亲和层析离子交换周质腔表达溶菌酶处理后渗透压休克包含体离心回收七选择分离纯化方法的依据根据分离单元之间的衔接选择初步纯化超滤沉淀
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依赖于基因表达产物和生物学功基因表达
基因表达是指结构基因在生物体中的 转录、翻译以及所有加工过程。 基因高效表达是指外源基因在某种细 胞中的表达活动，即剪切下一个外源基因 片段，拼接到另一个基因表达体系中，使 其能获得既有原生物活性又可高产的表达 产物。
动物病毒学
反转录病毒 和反转录酶 mRNA结构与 代谢的研究
大规模的蛋白合成 克隆特定 的基因
制备探 针
寡核苷酸合成 蛋白序列分析
小鼠胚胎学
DNA序 列分析 插入生殖细胞 定点突变改 变基因结构 功能分析 序列分析
RNA序 列分析
基因工程药物制药的主要程序
⒈目的基因的克隆， ⒉构建DNA重组体， ⒊DNA重组体转入宿主菌， ⒋构建工程菌， ⒌工程菌发酵， ⒍表达产物的分离纯化， ⒎产品的检验等。
方法：合成目的基因DNA不同部位的 两条链的寡核苷酸短片段，再退火成为两 端形成粘性末端的DNA双链片段，然后将 这些双链片段按正确的次序进行退火连接 成较长的DNA片段，再用连接酶连接成完 整的基因。
人工化学合成基因的限制： a. 不能合成太长的基因。最长50-60bp.只 适用于克隆小分子肽的基因。 b. 人工合成基因时，遗传密码的简并会为 选择密码子带来很大困难， 如用氨基酸顺 序推测核苷酸序列，得到的结果可能与天 然基因不完 全一致，易造成中性突变。 c. 费用太高。
三、目的基因的获得
问题：来源于真核细胞的产生基因工程药物 的目的基因，为什么不能进行直接分离？
目的基因的获取途径：
1、逆转录法 逆转录法就是分离纯化目的基因的mRNA，再 反转录成cDNA，然后进行cDNA 克隆表达。 （1）、mRNA purification（ mRNA 纯化） a.细胞内RNA的组成和含量: DNA:95%核内，5％细胞器 RNA：75％细胞质，10%核内，15%细胞器 rRNA80-85%;tRNA10-15%; mRNA1-5% b.真核细胞mRNA 的特点及分离纯化方法。 3’-polyA（20-250AAA）-oligo(dT)
2、大肠杆菌体系中的基因表达
（1）表达载体
真核基因在原核细胞中表达载体必须具备条件： ⑴载体能够独立复制。载体本身是一个复制子， 具有复制起点。 严谨型：1-3个拷贝
松弛型：可达3000个
⑵应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，以 利于外源基因的克隆鉴定和筛选。 ⑶应具有很强的启动子，能为大肠杆菌RNA聚合 酶所识别。
包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞 内凝集，形成无活性的固体颗粒。
③ 、 在大肠杆菌中表达不存在翻译后修饰 作用，故对蛋白质产物不能糖基化，因此， 只适于表达不经糖基化等翻译后修饰仍具 有生物功能的真核蛋白质，在应用上受到 一定的限制。 由于翻译常从甲硫氨酸的AUG密码子 开始，故目的蛋白质的N端常多余一个甲硫 氨酸残基，容易引起免疫反应。大肠杆菌 会产生很难除去的内毒素，还会产生蛋白 酶而破坏目的蛋白质。
pBR322是一个人工构建的重要质粒，有万能 质粒之称。它是由pSF2124、pMB8及pSC101三个亲 本质粒经复杂的重组过程构建而成的。
常用表达载体--质粒pBV220的结构
pBV220系统国内使用最多的载体, 其组成: ①来源于pUC8多克隆位点 ②核糖体rrnB基因终止信号 ③pBR322第4225～3735位 ④pUC18第2066～680位 ⑤λ噬菌体cIts857抑制子基因及 PR启动子 ⑥pRC23的PL启动子及SD序列
第二章、基因工程制药
第一节、概述
现代生物技术是一项与医药产业相互结 合极为密切的高技术。
1982年，第一个基因重组产品—人胰岛素在美国问世。 基因工程药物主要是医用活性蛋白和多肽类： 免疫蛋白、细胞因子、激素、酶类等
优点:大量生产、应用临床、 深入研究、扩大应用、改造不足 。
基因工程技术生产药品的优点：
基因工程药物的制备流程
基因工程药物生产的基本过程
基因工程药物的生产分为上游和下游两 个阶段 上游阶段：主要是分离目的基因、构建 工程菌(细胞)。 下游阶段：从工程菌的大量培养一直 到产品的分离纯化和质量控制。
基因工程药物的上游技术：
1、基因克隆载体:质粒载体，
2、重组DNA技术的有关工具酶及其应用 3、核酸制备技术：制备纯净、高质量的 载体DNA和 待克隆的 核酸，才能有效地进行后续的酶切、反转录、 连接等分子克隆操作。
Oligo(dT)
TTTTTT TTTTTT AAAAA TTTTTT AAAAA TTTTTT 100mM NaCl 洗脱 rRNA/tRNA Total RNA
纤维素
Poly(A)--Oligo(dT)
10mM Tris
1mM EDTA
纤维素柱纯化Poly(A)mRNA 流程图
Poly(A)mRNA
基因工程基本过程：
双重旋转对称的结构 或称回文序列(palindrome)。
(5)、将重组体导入host cell (6)、cDNA library id离和鉴定（限制酶图谱的绘
制、杂交分析、基因定位、基因测序、确定基因 的 转录方向、转录起始点等。）
进行基因表达研究的主要问题是目的 基因的表达产量、表达产物的稳定性、 产物的生物学活性和表达产物的分离 纯化。因此，建立最佳的基因表达体 系，是基因表达设计的关键。
1、宿主细胞的选择
（1）、宿主细胞的基本要求： ① 容易获得较高浓度的细胞； ② 能利用易得廉价原料； ③ 不致病、不产生内毒素； ④ 发热量低，需氧低，适当的 发酵温度和细胞形态； ⑤ 容易进行代谢调控； ⑥ 容易进行DNA技术操作； ⑦ 产物的产量、产率高， 且易提取纯化。
pBV220系统优点：
①cIts857抑制子基因PL启动子同在一个载体上， 可以转化任何菌株，以便选用蛋白酶活性较 低的宿主细胞，使表达产物不易降解。 ②SD序列紧跟多克隆位点，便于插入带起始 ATG的外源基因，可表达非融合蛋白；
SD序列（Shine-Dalgarnosequence）： mRNA中用于结合原核生物核糖体的序 列。SD序列在细菌mRNA起始密码子 AUG上游10个碱基左右处，有一段富 含嘌呤的碱基序列 （5′…AGGAGG…3′），能与细菌 16SrRNA3’端识别，帮助从起始AUG 处开始翻译。
宿主细胞的 分类
① 原核细胞，常用的有大肠杆菌、枯草芽孢 杆菌、链霉菌等； ② 真核细胞，常用的有酵母、丝状真菌、哺 乳动物细胞。
(1)、原核细胞 a:大肠杆菌：表达产物的形式,细胞内不溶 性表达（包含体）、胞内可溶性表达、细 胞周质表达，极少还可分泌到胞外表达。 不同的表达形式具有不同的表达水平，且 会带来完全不同的杂质。
第二节、基因工程药物生产的过程
基因工程技术：
将所要重组对象的目的基因插入 载体、拼接、转入新的宿主细胞，构建成 工程细菌（或细胞），实现遗传物质的重 新组合，并使目的基因在工程菌内进行复 制和表达。
基因工程的诞生与及其相关学科的关系
噬菌体遗传学 细菌抗药性遗传学 限制酶的发现 DNA合成与修复 细菌基因 调节研究 外源DNA 插入载体 哺终止信号可防止出现“通读”现 象，有利于质粒-宿主系统的稳定； ④整个质粒仅为3.66kb，有利于增加其拷贝数 及容量，可以插入大片段外源基因； ⑤PR和PL启动子串联，可以增强启动作用；
*持家基因(house-keeping gene) *Alu序列
Alu重复序列是哺乳动物基因组中SINE家族 的一员，约有50万份拷贝。也就是说平均4～6 kb 中就有一个Alu序列。由于这种DNA序列中有限制 性内切核酸酶Alu工的识别序列AGCT，所以称为 Alu重复序列。
3 动物杂交法 4 功能克隆法
2、反转录—聚合酶链反应法 mRNA经反转录合成cDNA第一链，不需要再 合成cDNA链，用于重组、克隆。
3、化学合成法 较小的蛋白质和多肽的编码基因可以用 人工化学合成法获得。化学合成法有个先 决条件是：必须知道目的基因的核苷酸排 列顺序，或知道目的蛋白质的氨基酸顺序， 再按相应的密码子推导出DNA的碱基系列。
*哺乳动物细胞
由于外源基因的表达产物可由重组转化的细胞 分泌到培养液中，培养液成分完全由人控制，从而 是产物纯化变得容易。产物是糖基化的，接近或 类似于天然产物。 但动物细胞生产慢，生产率低， 而且培养条件苛刻，费用高，培养液浓度较稀。 虽然从理论上讲，各种微生物都可以用于基因 表达，但由于克隆载体、DNA导入方法以及遗传 背景等方面的限制，目前使用最广泛的宿主菌仍然 是大肠杆菌和酿酒酵母。
筛选基因的其他方法
1 编码序列富集法
2 岛屿获救PCR法 *CpG岛
CpG岛（CpG islands）是指DNA上一个区 域，此区域含有大量相联的胞嘧啶（C）、鸟嘌呤 （G），以及使两者相连的磷酸酯键（p）。哺乳 类基因中的启动子上，含有约40%的CpG岛（人类 约70%）。一般CpG岛的长度约300到3000个碱基对 （bp）。 常用的正式定义是指一个至少含有200bp的区域 ，其中GC所佔比例超过50%，且CpG的观察值／ 预测值比例必须高於0.6。
பைடு நூலகம்
(2)真核细胞
a:酵母：繁殖迅速，可廉价的大规模培养， 而且没有毒性，基因工程操作与原核生物 相似，表达产物直接分泌到细胞外，简化 了分离纯化工艺。表达产物能糖基化。特 别是某些在细菌系统中表达不良的真核基 因，在酵母中表达良好。目前以酿酒酵母 应用最多。干扰素和乙肝表面抗原已获成 功。
b:丝状真菌：很强的分泌能力；能正确进行翻 译后加工，包括肽剪切和糖基化；而且糖 基化方式与高等真核生物相似；丝状真菌 （如曲霉）被确认是安全菌珠，有成熟的 发酵和后处理工艺。
a. 可大量生产过去难以获得的生理活性多肽和蛋 白质，为临床使用提供有效的保障；
b. 可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生 理生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质 的应用范围； c. 利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源 性生理活性物质；
基因表达是指结构基因在生物体中的 转录、翻译以及所有加工过程。 基因高效表达是指外源基因在某种细 胞中的表达活动，即剪切下一个外源基因 片段，拼接到另一个基因表达体系中，使 其能获得既有原生物活性又可高产的表达 产物。
动物病毒学
反转录病毒 和反转录酶 mRNA结构与 代谢的研究
大规模的蛋白合成 克隆特定 的基因
制备探 针
寡核苷酸合成 蛋白序列分析
小鼠胚胎学
DNA序 列分析 插入生殖细胞 定点突变改 变基因结构 功能分析 序列分析
RNA序 列分析
基因工程药物制药的主要程序
⒈目的基因的克隆， ⒉构建DNA重组体， ⒊DNA重组体转入宿主菌， ⒋构建工程菌， ⒌工程菌发酵， ⒍表达产物的分离纯化， ⒎产品的检验等。
方法：合成目的基因DNA不同部位的 两条链的寡核苷酸短片段，再退火成为两 端形成粘性末端的DNA双链片段，然后将 这些双链片段按正确的次序进行退火连接 成较长的DNA片段，再用连接酶连接成完 整的基因。
人工化学合成基因的限制： a. 不能合成太长的基因。最长50-60bp.只 适用于克隆小分子肽的基因。 b. 人工合成基因时，遗传密码的简并会为 选择密码子带来很大困难， 如用氨基酸顺 序推测核苷酸序列，得到的结果可能与天 然基因不完 全一致，易造成中性突变。 c. 费用太高。
三、目的基因的获得
问题：来源于真核细胞的产生基因工程药物 的目的基因，为什么不能进行直接分离？
目的基因的获取途径：
1、逆转录法 逆转录法就是分离纯化目的基因的mRNA，再 反转录成cDNA，然后进行cDNA 克隆表达。 （1）、mRNA purification（ mRNA 纯化） a.细胞内RNA的组成和含量: DNA:95%核内，5％细胞器 RNA：75％细胞质，10%核内，15%细胞器 rRNA80-85%;tRNA10-15%; mRNA1-5% b.真核细胞mRNA 的特点及分离纯化方法。 3’-polyA（20-250AAA）-oligo(dT)
2、大肠杆菌体系中的基因表达
（1）表达载体
真核基因在原核细胞中表达载体必须具备条件： ⑴载体能够独立复制。载体本身是一个复制子， 具有复制起点。 严谨型：1-3个拷贝
松弛型：可达3000个
⑵应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，以 利于外源基因的克隆鉴定和筛选。 ⑶应具有很强的启动子，能为大肠杆菌RNA聚合 酶所识别。
包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞 内凝集，形成无活性的固体颗粒。
③ 、 在大肠杆菌中表达不存在翻译后修饰 作用，故对蛋白质产物不能糖基化，因此， 只适于表达不经糖基化等翻译后修饰仍具 有生物功能的真核蛋白质，在应用上受到 一定的限制。 由于翻译常从甲硫氨酸的AUG密码子 开始，故目的蛋白质的N端常多余一个甲硫 氨酸残基，容易引起免疫反应。大肠杆菌 会产生很难除去的内毒素，还会产生蛋白 酶而破坏目的蛋白质。
pBR322是一个人工构建的重要质粒，有万能 质粒之称。它是由pSF2124、pMB8及pSC101三个亲 本质粒经复杂的重组过程构建而成的。
常用表达载体--质粒pBV220的结构
pBV220系统国内使用最多的载体, 其组成: ①来源于pUC8多克隆位点 ②核糖体rrnB基因终止信号 ③pBR322第4225～3735位 ④pUC18第2066～680位 ⑤λ噬菌体cIts857抑制子基因及 PR启动子 ⑥pRC23的PL启动子及SD序列
第二章、基因工程制药
第一节、概述
现代生物技术是一项与医药产业相互结 合极为密切的高技术。
1982年，第一个基因重组产品—人胰岛素在美国问世。 基因工程药物主要是医用活性蛋白和多肽类： 免疫蛋白、细胞因子、激素、酶类等
优点:大量生产、应用临床、 深入研究、扩大应用、改造不足 。
基因工程技术生产药品的优点：
基因工程药物的制备流程
基因工程药物生产的基本过程
基因工程药物的生产分为上游和下游两 个阶段 上游阶段：主要是分离目的基因、构建 工程菌(细胞)。 下游阶段：从工程菌的大量培养一直 到产品的分离纯化和质量控制。
基因工程药物的上游技术：
1、基因克隆载体:质粒载体，
2、重组DNA技术的有关工具酶及其应用 3、核酸制备技术：制备纯净、高质量的 载体DNA和 待克隆的 核酸，才能有效地进行后续的酶切、反转录、 连接等分子克隆操作。
Oligo(dT)
TTTTTT TTTTTT AAAAA TTTTTT AAAAA TTTTTT 100mM NaCl 洗脱 rRNA/tRNA Total RNA
纤维素
Poly(A)--Oligo(dT)
10mM Tris
1mM EDTA
纤维素柱纯化Poly(A)mRNA 流程图
Poly(A)mRNA
基因工程基本过程：
双重旋转对称的结构 或称回文序列(palindrome)。
(5)、将重组体导入host cell (6)、cDNA library id离和鉴定（限制酶图谱的绘
制、杂交分析、基因定位、基因测序、确定基因 的 转录方向、转录起始点等。）
进行基因表达研究的主要问题是目的 基因的表达产量、表达产物的稳定性、 产物的生物学活性和表达产物的分离 纯化。因此，建立最佳的基因表达体 系，是基因表达设计的关键。
1、宿主细胞的选择
（1）、宿主细胞的基本要求： ① 容易获得较高浓度的细胞； ② 能利用易得廉价原料； ③ 不致病、不产生内毒素； ④ 发热量低，需氧低，适当的 发酵温度和细胞形态； ⑤ 容易进行代谢调控； ⑥ 容易进行DNA技术操作； ⑦ 产物的产量、产率高， 且易提取纯化。
pBV220系统优点：
①cIts857抑制子基因PL启动子同在一个载体上， 可以转化任何菌株，以便选用蛋白酶活性较 低的宿主细胞，使表达产物不易降解。 ②SD序列紧跟多克隆位点，便于插入带起始 ATG的外源基因，可表达非融合蛋白；
SD序列（Shine-Dalgarnosequence）： mRNA中用于结合原核生物核糖体的序 列。SD序列在细菌mRNA起始密码子 AUG上游10个碱基左右处，有一段富 含嘌呤的碱基序列 （5′…AGGAGG…3′），能与细菌 16SrRNA3’端识别，帮助从起始AUG 处开始翻译。
宿主细胞的 分类
① 原核细胞，常用的有大肠杆菌、枯草芽孢 杆菌、链霉菌等； ② 真核细胞，常用的有酵母、丝状真菌、哺 乳动物细胞。
(1)、原核细胞 a:大肠杆菌：表达产物的形式,细胞内不溶 性表达（包含体）、胞内可溶性表达、细 胞周质表达，极少还可分泌到胞外表达。 不同的表达形式具有不同的表达水平，且 会带来完全不同的杂质。
第二节、基因工程药物生产的过程
基因工程技术：
将所要重组对象的目的基因插入 载体、拼接、转入新的宿主细胞，构建成 工程细菌（或细胞），实现遗传物质的重 新组合，并使目的基因在工程菌内进行复 制和表达。
基因工程的诞生与及其相关学科的关系
噬菌体遗传学 细菌抗药性遗传学 限制酶的发现 DNA合成与修复 细菌基因 调节研究 外源DNA 插入载体 哺终止信号可防止出现“通读”现 象，有利于质粒-宿主系统的稳定； ④整个质粒仅为3.66kb，有利于增加其拷贝数 及容量，可以插入大片段外源基因； ⑤PR和PL启动子串联，可以增强启动作用；
*持家基因(house-keeping gene) *Alu序列
Alu重复序列是哺乳动物基因组中SINE家族 的一员，约有50万份拷贝。也就是说平均4～6 kb 中就有一个Alu序列。由于这种DNA序列中有限制 性内切核酸酶Alu工的识别序列AGCT，所以称为 Alu重复序列。
3 动物杂交法 4 功能克隆法
2、反转录—聚合酶链反应法 mRNA经反转录合成cDNA第一链，不需要再 合成cDNA链，用于重组、克隆。
3、化学合成法 较小的蛋白质和多肽的编码基因可以用 人工化学合成法获得。化学合成法有个先 决条件是：必须知道目的基因的核苷酸排 列顺序，或知道目的蛋白质的氨基酸顺序， 再按相应的密码子推导出DNA的碱基系列。
*哺乳动物细胞
由于外源基因的表达产物可由重组转化的细胞 分泌到培养液中，培养液成分完全由人控制，从而 是产物纯化变得容易。产物是糖基化的，接近或 类似于天然产物。 但动物细胞生产慢，生产率低， 而且培养条件苛刻，费用高，培养液浓度较稀。 虽然从理论上讲，各种微生物都可以用于基因 表达，但由于克隆载体、DNA导入方法以及遗传 背景等方面的限制，目前使用最广泛的宿主菌仍然 是大肠杆菌和酿酒酵母。
筛选基因的其他方法
1 编码序列富集法
2 岛屿获救PCR法 *CpG岛
CpG岛（CpG islands）是指DNA上一个区 域，此区域含有大量相联的胞嘧啶（C）、鸟嘌呤 （G），以及使两者相连的磷酸酯键（p）。哺乳 类基因中的启动子上，含有约40%的CpG岛（人类 约70%）。一般CpG岛的长度约300到3000个碱基对 （bp）。 常用的正式定义是指一个至少含有200bp的区域 ，其中GC所佔比例超过50%，且CpG的观察值／ 预测值比例必须高於0.6。
பைடு நூலகம்
(2)真核细胞
a:酵母：繁殖迅速，可廉价的大规模培养， 而且没有毒性，基因工程操作与原核生物 相似，表达产物直接分泌到细胞外，简化 了分离纯化工艺。表达产物能糖基化。特 别是某些在细菌系统中表达不良的真核基 因，在酵母中表达良好。目前以酿酒酵母 应用最多。干扰素和乙肝表面抗原已获成 功。
b:丝状真菌：很强的分泌能力；能正确进行翻 译后加工，包括肽剪切和糖基化；而且糖 基化方式与高等真核生物相似；丝状真菌 （如曲霉）被确认是安全菌珠，有成熟的 发酵和后处理工艺。
a. 可大量生产过去难以获得的生理活性多肽和蛋 白质，为临床使用提供有效的保障；
b. 可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生 理生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质 的应用范围； c. 利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源 性生理活性物质；