第六章 微生物生态学的研究方法
微生物生态学研究中的分子生物学方法
微生物生态学研究中的分子生物学方法微生物是地球上最为丰富、多样且广泛分布的生物，有着重要的生态功能。
在微生物生态学研究中，许多问题需要考虑微生物的多样性、生态学分布及其作用和适应性。
传统的微生物学研究通常依赖于纯培养和形态学特征进行分类和鉴定，但存在着很大的缺陷，许多微生物无法进行纯培养，而且在分布及功能上存在巨大的多样性和复杂性。
因此，利用分子生物学方法，在微生物生态学研究中推进更为深入的探索和解决问题尤为重要。
分子生物学方法已经成为微生物学研究中的常规手段。
其中，分子生态学作为微生物生态学研究的一个重要分支，是利用微生物群落的DNA序列来描述微生物的多样性和结构、分布模式、演化规律以及生态功能。
分子生态学是利用分子生物学技术，以微生物群落DNA为物质基础，分析微生物群落的结构及其变化和生态功能的研究领域。
常见的分子生态学方法有PCR-DGGE、PCR-SSCP、PCR-RFLP 等。
PCR-DGGE技术是一种评价微生物群落构成的分子生物学方法，也是分子生态学研究中最常采用的一种方法。
此技术通过扩增轮廓分析电泳，能够在不进行序列测定的情况下，迅速知道样品中微生物群落的构成情况。
DGGE是一种革命性的电泳技术，可以使得同样长度、不同序列的DNA分子发生不同程度的变性而达到不同的电泳迁移率，因此，能够从PCR扩增产物中分离出不同种群、不同数量的DNA序列，可用于分析种群的构成和动态变化。
PCR-SSCP技术是用来研究微生物群落中小亚基的分子生物学方法。
它可以通过分析不同峰的数量及大小，评估群落的多样性和结构。
其原理是在一定条件下，所有长度相同的PCR产物的突变体将由于核酸热变性、缺陷组态和电泳带电性质等不同而形成不同的电泳迁移率，从而显示在聚丙烯酰胺凝胶上。
PCR-RFLP技术是将PCR扩增的外显子或内含子序列用限制酶切法切开后，根据限制酶切后DNA片段的数目、大小、分布等特征，依据电泳迁移率或其他方式进行分离鉴定。
第六章 微生物生态学的研究方法ppt课件
4.数学模型法
研究微生物生态学过程中惯用的方法，是以感官 观察为基础，经过一些实验将搜集的资料加以分析和 解释，并进一步归纳、假设和推理。在这过程中，其 结果大多数是描述性的，数据基本是孤立的。将数学 研究应用于微生物生态学研究中，以统计数据和建立 生态模型来定量描述微生物生态学问题。
首先在实验室中建立人工的经过简化的环境。
• 目前已经进行测序的核酸序列数目很有限， 这样对某些生态系统中存在的微生物和核 酸序列就不可能进行全面的了解，必须对 各种生物的16SrRNA和23SrRNA进行测序和 研究，才能设计足够的探针来监测高度可 变的目标样品中的所有微生物。
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图8-1 核酸探针和杂交技术的基本过程（池振明，2005）
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2.培养法
➢培养微生物的方法是很多的，一般来说对所采集的样品应 进行适当的稀释，以便每一个平板上只能生长有一定数目的 微生物菌落。 ➢其最大优点便是可以计算自然样品中的活微生物数目，并 可以辨认真菌、放线菌和细菌。 ➢其缺点是造成计算误差的因素很多。比如： A.自然中的许多微生物细胞成群粘接在一起，用普通的方法 很难把它们分开，这样形成的菌落可能是由许多个细胞增殖 而来的，而不是由单个细胞形成的菌落.
• 微生物生态学研究中采用的分子生物学方法主要 有核酸探针技术、PCR扩增技术、rRNA序列同源性 分析方法、梯度凝胶电泳方法等。
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一、核酸探针杂交技术
• 核酸杂交技术快速，能灵敏地探测出环境微生物中 特殊的核酸序列，并且用光密度测定法可直接比较 核酸杂交所得到的阳性条带或斑点就能得出定量的 结果，从而反映出相关微生物的存在及功能。
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3.生理生化法
同位素示踪法。我们知道一个微生物群体的大 小，那么通过测定H3标记的胸腺嘧啶组入微生 物群体DNA中的速率便可以估计微生物的代时。
微生物生态学复习资料
Microbial Ecology绪论1. 名词解释：微生物生态学:是研究微生物与其周围生物和非生物环境之间相互关系的一门科学。
微生态学：是生态学的一个层次，是研究正常微生物在细胞或分子水平上相关关系的科学环境、自然环境+生物环境生境、指生物的个体、种群或群落生活地域的具体环境。
生物＋非生物栖息地、生物生活或居住的范围的物理环境。
如林地生境中的不同树冠层、树干生态位、一个种群在生态系统中，在时间空间上所占据的位置及其与相关种群之间的功能关系与作用。
基础生态位、一个物种能够占据的生态位空间，由物种的变异和适应能力决定，而非其地理因素。
基本生态位是实验室条件下的生态位，里面不存在捕食者和竞争。
实际生态位、自然界中真实存在的生态位。
物种流是指物种的种群在生态系统内或系统之间时空变化的状态。
2.微生物生态学的研究意义有哪些？①发现新的在工农业（如固氮）、食品（如发酵）、医药（如抗生素）和环境保护（如生物修复）方面有重要用途的微生物菌株（包括极端环境中微生物资源的发掘）；②微生物在地球物质化学循环中具有重要作用；③开发和利用自然界中的微生物资源，保护好微生物基因资源；④控制有害微生物，利用微生物净化环境，保护环境，维持环境生态平衡；⑤保护人类健康和保护生态平衡发挥微生物的最佳作用。
3.微生物生态学主要研究内容有哪些？①正常自然环境中的微生物种类、分布及变化规律；②极端自然环境中的微生物；③微生物之间、微生物与动植物相互关系；④微生物在净化污染环境中的作用；⑤现代分子微生物生态学的研究方法。
4.生态系统的功能有哪些？物种流能量流食物链营养级信息流5.什么是微生物生态系统？其特点是什么？是指各种环境因子如物理、化学及生物因子对微生物区系（即自然群体）的作用和微生物区系对外界环境的反作用。
特点：微环境稳定性适应性7.简述物种流的含义及其特点。
是指物种的种群在生态系统内或系统之间时空变化的状态。
不同生态系统间的交流和联系。
微生物生态学的研究及其在环境修复中的应用
微生物生态学的研究及其在环境修复中的应用微生物生态学是研究微生物在自然界中的分布、数量、交互作用以及与宿主体之间的关系的学科。
微生物生态学中的微生物包括细菌、真菌、病毒、原生生物等各种微生物，它们构成了地球生物圈中最基础、最丰富的群落，生态功能与地球生命系统存在着密切的关系。
微生物生态学的研究内容涉及微生物的生态形态、生态功能、物种组成以及变化规律等方面。
微生物在自然界中扮演着重要的角色，通过分解机械组分、氮循环、光合作用、腐生、水分循环、有机物质降解等多种代谢过程，对自然界的生态系统产生着深刻的影响。
微生物的生态形态通常包括单胞和多细胞两种类型。
单胞生物是最简单的生物体，在细胞膜的保护下进行代谢活动，植物、细菌、病毒、原生生物等都属于单细胞生物。
多细胞生物则指的是由多个细胞组成的生物体，包括人类、动物、植物等。
微生物的生态功能包括有光合作用、有机物质降解、氮循环等，它们在自然界中起着重要的生态服务功能。
其中，光合作用是氧气、食物以及地球生态系统的来源，氮循环则是生命系统中最为常见的一个循环系统。
有机物质降解则是地球生态系统的能量来源。
微生物的物种组成以及变化规律则是微生物生态学中的重要研究内容。
这些规律通常受到环境、生物间关系、资源利用方式以及生物进化的影响。
对于环境修复、污染物减少等问题的解决，微生物生态学研究是重要的基础。
环境修复是保护环境、保障人类健康、构建绿色生态的一项关键的任务。
微生物生态学在环境修复中发挥着重要的作用。
目前，微生物的应用主要集中在以下三个方面。
第一，微生物的应用于重金属污染的修复。
在重金属污染地区，微生物通过生物降解、吸附、还原和修复等作用，去除毒性物质，恢复生态系统的平衡，缓解污染危害。
第二，微生物的应用于有机污染的修复。
在有机污染地区，通过微生物的降解和代谢作用，破坏有机污染物，将有机污染物转化为无害物质，实现有机污染的修复。
第三，微生物的应用于景观植被的修复。
微生物生态学研究中的新思路和新方法
微生物生态学研究中的新思路和新方法微生物生态学研究中涉及广泛的领域，从土地利用和农业生产，到全球气候变化和人类健康。
随着技术的不断进步，微生物生态学研究也得以不断地进展。
本文将探讨微生物生态学研究中的最新思路和方法。
1. 微生物群落分析微生物群落是微生物学界的一个热点领域。
微生物群落分析可以通过研究样品中的微生物数量和组成，进一步了解微生物群落的特性和功能。
利用高通量测序技术，可以快速、准确地鉴定和定量微生物群落，并且通过比较样品之间的差异，了解不同生境中微生物群落的变化规律。
近年来，人们越来越重视微生物群落分析在微生物生态学研究中的应用。
研究人员使用氧化还原梯度（redox gradient）分析样品中不同微生物代谢过程的分布情况，进一步了解微生物群落的硫化、铁化和甲烷氧化等生态过程。
研究人员也利用DNA甲基化和组蛋白修饰等信息，将微生物群落的组成与环境因素联系起来，为了解微生物与环境的互动提供了新的思路。
2. 基于模型的微生物生态学微生物生态学的另一种研究思路是基于模型的微生物生态学。
通过建立模型，可以模拟微生物群落在不同环境下的生长、繁殖和死亡过程，研究微生物群落的动态变化和稳定性。
传统模型主要关注微生物群落的数量和组成，但新兴模型不仅考虑到微生物物种的多样性和功能，还考虑了微生物群落与环境之间的相互作用。
基于模型的微生物生态学是非常有前景的领域。
将微生物群落功能和数量模型化，可以更深入地了解微生物生态学相关问题，如微生物群落的生机、适应性以及稳定性。
此外，基于模型的微生物生态学还可以用于评估环境污染对微生物群落的影响，比如食品加工过程中的微生物群落消耗等问题。
3. 表观遗传学表观遗传学在微生物生态学研究中也发挥着越来越重要的作用。
微生物表观组是一种在DNA序列未发生改变的情况下，会影响基因表达的细胞内结构。
表观修饰因子（epigenetic factors）可以通过DNA甲基化、组蛋白修饰等方式对基因组进行表观遗传学改变。
微生物生态学中的生态位理论与方法研究
微生物生态学中的生态位理论与方法研究微生物是地球上最古老、最广泛分布、数量最多、鉴定最困难的生物类群之一，是支持生态系统运作的基础。
微生物生态学研究微生物在不同生态环境中的数量、分布、功能以及它们之间的相互作用。
生态位理论是微生物生态学中重要的理论基础，对生物的适应性、竞争关系和生态位资源利用具有重要的指导意义。
本文将介绍微生物生态学中的生态位理论以及实验方法的研究进展。
生态位理论生态位是指生物与周围环境中的因素相互作用的空间在物理（生境）和功能（作用）两个方面的总和，是描述物种在生态系统中的占据位置及其与周围物种的关系的一种生态概念。
其基本观点是：生态位可以被人们看成“生态位置”，也可以被看做“生态空间”；任何一种生物对于生存条件的要求都表现在其生态位上。
根据生态位的定义，可以得知生态位有其内部和外部两个方面。
内部生态位主要包括营养特性、生长条件要求等方面，而外部生态位则是由生境的特点如温度、湿度、PH等环境因素所决定。
生态位理论不仅适用于微生物，也可以适用于动植物等多种生物学研究中。
生态位可分为空间生态位和时间生态位。
空间生态位是指一个物种在空间上的所占据的位置，而时间生态位是指一个物种在时间上所占据的位置。
一个物种的时间生态位也可以看做是对多个空间生态位的运用。
生态位的占据程度是一个相对的概念，不同物种占据的生态位是不一样的。
对于同一生态位的不同物种，按照它们在竞争、合作方面所表现出的适应性，来分配它们的占有度，这个分配程度叫做相对占有度。
生态位因此成为微生物生态学研究的核心之一。
生态位理论的应用微生物生态学研究中常常借助生态位理论进行相应的研究。
一个物种在特定的环境条件下所占据的生态位影响着其在生态系统中的角色、数量以及影响力等等。
生态位的作用也可以归纳为以下几个层面。
1. 确定菌群定殖在特定环境条件下，生境能够容纳或支持的微生物种类种类是有限的，具体哪些微生物可以占据生态位分别取决于其相对适应性和浓度势能。
微生物生态试题及答案
微生物生态试题及答案一、单项选择题（每题2分，共20分）1. 微生物生态学研究的主要内容不包括以下哪一项？A. 微生物群落的结构和功能B. 微生物与环境的相互关系C. 微生物的分类和鉴定D. 微生物在生态系统中的作用答案：C2. 下列哪项不是微生物生态学的研究方法？A. 显微镜观察B. 分子生物学技术C. 化学分析D. 植物栽培答案：D3. 微生物在生态系统中扮演的角色不包括以下哪一项？A. 分解者B. 生产者C. 消费者D. 寄生者答案：D4. 以下哪种微生物不属于原核生物？A. 细菌B. 放线菌C. 酵母菌D. 蓝细菌答案：C5. 微生物生态学中，微生物群落的演替过程通常受到哪些因素的影响？A. 环境条件B. 微生物种类C. 微生物数量D. 所有以上因素答案：D6. 在微生物生态学中，哪种物质不是微生物分解的主要物质？A. 纤维素B. 木质素C. 蛋白质D. 塑料答案：D7. 微生物生态学研究中，哪种技术常用于微生物群落结构的分析？A. 显微镜计数B. 培养基分离C. 16S rRNA基因测序D. 化学分析答案：C8. 微生物在环境中的分布通常受到哪些因素的影响？A. 温度B. pH值C. 营养物质D. 所有以上因素答案：D9. 在微生物生态学中，哪种微生物不是通过光合作用获取能量？A. 蓝细菌B. 绿藻C. 酵母菌D. 红细菌答案：C10. 微生物生态学中，哪种微生物不是通过发酵过程产生能量？A. 酵母菌B. 乳酸菌C. 醋酸菌D. 蓝细菌答案：D二、多项选择题（每题3分，共15分）1. 微生物在生态系统中的功能包括以下哪些？A. 物质循环B. 能量流动C. 环境净化D. 生物多样性维持答案：ABCD2. 微生物生态学研究中，以下哪些因素会影响微生物群落的结构？A. 温度B. pH值C. 营养物质的可用性D. 微生物之间的相互作用答案：ABCD3. 微生物生态学中，以下哪些微生物属于真核生物？A. 酵母菌B. 放线菌C. 原生动物D. 蓝细菌答案：AC4. 微生物生态学研究中，以下哪些技术可以用于微生物的鉴定？A. 形态学观察B. 生化试验C. 16S rRNA基因测序D. 免疫学方法答案：ABCD5. 微生物在环境中的作用包括以下哪些？A. 作为病原体B. 作为生物指示器C. 作为生物修复剂D. 作为生物肥料答案：ABCD三、判断题（每题2分，共10分）1. 微生物生态学是一门研究微生物与环境之间相互作用的科学。
微生物生态学及其应用研究
微生物生态学及其应用研究一、微生物生态学概述微生物广泛存在于各种生态系统中，是生态系统中不可或缺的重要组成部分。
微生物生态学是一门探讨微生物在生态系统中分布，种类，数量以及与环境之间相互作用和影响等方面的学科。
微生物生态学不仅有助于深入理解微生物在自然界中的作用，还能为环境保护和微生物学应用提供理论依据。
二、微生物生态学的研究方向（一）微生物在环境中的分布微生物分布是微生物生态学的基础和起点，微生物在环境中的分布规律和影响因素是研究微生物生态学的重要内容。
微生物分布因素很多，例如光照、温度、湿度、土壤成分、土壤pH值和微生物自身因素等都会影响微生物的分布。
（二）微生物种类的多样性微生物种类的多样性是微生物生态学的又一个重要方向。
微生物多样性包括在空间上的多样性，如不同环境中微生物多样性的差异；在功能上的多样性，如微生物在氮转化、羟基化以及酸化等方面的作用差异；还包括微生物种群的动态变化。
（三）微生物与环境物质的相互作用微生物是一种生物体，它们与环境中的各种物质之间存在多种复杂的相互作用。
微生物可以分解各种复杂的有机物和无机物，同时生产出一些化合物，发挥着生产和净化的作用。
因此，微生物与环境物质的相互作用是研究微生物生态学的重要方向。
（四）微生物在环境中的代谢作用微生物具有广泛的代谢作用，它们能利用环境中各种有机和无机物质，完成各种化学反应，产生能量和物质代谢产物。
微生物在环境中的代谢作用是研究微生物学的又一个重要方向。
三、微生物生态学的应用研究（一）环境污染的控制和治理微生物生态学可以应用于环境污染的控制和治理。
利用微生物降解有机物或吸附重金属等物质，可以有效控制和治理工业和农业污染。
此外，利用微生物及其代谢产物如化学物质，也可以对抗传染病和减轻污染物有害作用。
（二）农业生产的优化和提高微生物生态学可以在农业生产中得到应用。
例如利用微生物降解植物分泌物降低植物病害的发生，促进植物生长，提高作物产量。
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一、核酸探针杂交技术
• 核酸杂交技术快速，能灵敏地探测出环境微生物中 特殊的核酸序列，并且用光密度测定法可直接比较 核酸杂交所得到的阳性条带或斑点就能得出定量的 结果，从而反映出相关微生物的存在及功能。
• 其基本原理是:人工合成能与某类群微生物特征基 因序列互补的寡聚DNA或RNA探针，并以荧光或放射 性标记该探针，然后利用该探针与微生物基因杂交， 通过荧光显微镜技术或放射自显影技术对微生物的 群落结构进行分析和研究。
• AFLP 技术与其他的DNA 指纹技术相比有其独特的
优点：（1）AFLP 标记具有比RFLP 、RAPD标记更
为可靠、有效的揭示物种多态性水平的能力，为研
究原核生物属以下物种之间的亲缘关系，乃至菌株 之间关系提供了一种有效手段；（2）具有一定的 灵活性，可通过特异性PCR 引物设计和内切酶组合 的选择，来调整AFLP 图谱中限制性片段的适宜数 目；（3）由于使用了严格的PCR条件和高分辨率的 聚丙烯酰胺凝胶电泳，因而重复性好，分辨率高。
需要克隆基因探针，DNA的用量较大且纯度要求很 高，因此应用受到了一定限制。将PCR应用于RFLP 的PCR-RFLP技术则克服了这一缺点。
4、PCR-RFLP法是将PCR引物中的一条加以荧光标记，
反应后用合适的限制酶切、电泳分析，再根据片断 的大小不同以及标记片断种类和数量的不同分析群
落的结构及组成多样性。此方法对微生物遗传多样
• 其主要步骤是：（1）提取细菌基因组DNA； （2）用PCR扩增16SrDNA或16S-23SrDNA间 隔区片段；（3）将特异的PCR扩增产物变 性，而后快速复性，使之成为具有一定空 间结构的单链DNA分子；（4）该单链DNA 分子进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳； （5）银染或放射自显影；（6）分析得到 的特异指纹图谱，与标准菌株的图谱相比 较，即可分析菌群，对菌株进行鉴定。亦 可对特异条带回收、测序，进行菌种鉴定 和分类。
很难把它们分开，这样形成的菌落可能是由许多个细胞增殖 而来的，而不是由单个细胞形成的菌落.
B.有些微生物在平板上只能形成微菌落，不便于肉 眼观察。
C.一般情况下实验室所用的培养条件很难满足所有 微生物的生长，所用的有限种类的培养基也无法 满足所有微生物的生长。
D.在平板上形成的丝状微生物菌落不知是从孢子而 来的还是从菌丝而来的。
三、rRNA基因同源性分析方法
• rRNA基因同源性分析方法是综合应用多项 分子生物学技术对细菌中rRNA基因进行分 析，从而揭示微生物多样性。这是分子微 生物生态学中最重要的方法，取得的成果 也最多。rRNA在所有的微生物中，功能和 进化上是同源的，同源物种之间rRNA结构 是相当保守的。因此，为了确定一个分离 物为一个分类单元，或证明属于一个新的 分类单元，rRNA基因序列分析还是最可靠 的方法。
二、PCR特异性扩增技术
PCR技术主要特点是短时间内在实验室 条件下人为地控制并特异扩增目的基因或 DNA片段，使研究的目的基因及其环境样品
中的微量微生物基因得到无限CR技术可将靶序列放大几个数
量级，再用探针杂交探测对被扩增序列作
定性或定量研究分析微生物群体结构。
1、反转录PCR (RT-PCR)技术是利用反转录
酶，使样品中mRNA反转录为DNA，然后利 用DNA分析方法进行研究。虽然在活的微 生物细胞中mRNA的含量较高，但当细胞死 亡和裂解以后，释放到环境中的mRNA迅速 被降解。因此， RT-PCR技术常被用来分 析环境样品中活体微生物生存状况和活性。
2、竞争性PCR曾被用来测定受多环芳香烃污
染的沉降物中的编码邻苯二酚-2，3-加双 氧酶的dmpB基因的浓度。对PCR扩增dmpB的 基因片段进行人工改造，使其带有一个 40bp大小的缺失，作为PCR扩增的竞争模板。 因此，竞争模板的 PCR产物就比目的模板 的PCR产物短。用竞争性PCR对二者进行共 扩增，通过与竞争模板的浓度进行比较， 来定量沉降物中dmpB基因的浓度。
性尤其是微生物的种以下分类具有重要意义。
5、随机引物扩增多态性(RAPD)也是应用比较广泛的
一项技术。RAPD是用那些对某一特定基因的非特 异性的引物来扩增某些片段。RAPD分析用于探测 含有混合微生物种群的各种生物反应器中的微生
物多样性。用RAPD分析所得到的基因组指纹图谱
在比较一段时间内微生物种群的变化以及比较小
• 核酸探针杂交法的基本的步骤：先对 rRNA(基因)序列比对，并对这些序列的特 异性进行鉴定，然后进行互补核酸探针的 合成和标记，最后对探针的特异性和测定 敏感性进行评价和优化。 • 目前已经进行测序的核酸序列数目很有限， 这样对某些生态系统中存在的微生物和核 酸序列就不可能进行全面的了解，必须对 各种生物的16SrRNA和23SrRNA进行测序和 研究，才能设计足够的探针来监测高度可 变的目标样品中的所有微生物。
• Biolog 微孔板最初是由Biolog 公司为了 鉴定纯种微生物而设计的，其碳源代谢指 纹图可用来鉴定1900多种细菌、酵母和霉 菌。1991 年，Garland 首次将Biolog 微 孔板应用于土壤微生物群落的研究。现在 Biolog 微孔板已被广泛应用于描述各种环 境包括土壤、淡水、沉积物、活性污泥和 海水的微生物群落生理状况。
2.培养法
培养微生物的方法是很多的，一般来说对所采集的样品应
进行适当的稀释，以便每一个平板上只能生长有一定数目的
微生物菌落。 其最大优点便是可以计算自然样品中的活微生物数目，并 可以辨认真菌、放线菌和细菌。 其缺点是造成计算误差的因素很多。比如：
A.自然中的许多微生物细胞成群粘接在一起，用普通的方法
4.数学模型法
研究微生物生态学过程中惯用的方法，是以感官 观察为基础，经过一些实验将搜集的资料加以分析和 解释，并进一步归纳、假设和推理。在这过程中，其 结果大多数是描述性的，数据基本是孤立的。将数学 研究应用于微生物生态学研究中，以统计数据和建立 生态模型来定量描述微生物生态学问题。 首先在实验室中建立人工的经过简化的环境。 分解成许多小的、较为简单的亚系统。这些亚系统 之间的相互作用，亚系统之内各种因素的作用则用数 学方程式描述。可以大大地压缩真实过程的时间、人 力和物力，并在短时间内调查生态演变过程的规律， 并预测生态演变过程的发展趋势，提供最优利用方案。
尽管如此，这种方法还是被广泛用于微生物生态 学研究中，特别适合用于研究细菌生态学.
3.生理生化法
同位素示踪法。我们知道一个微生物群体的大 小，那么通过测定H3标记的胸腺嘧啶组入微生 物群体DNA中的速率便可以估计微生物的代时。
代谢活力测定法。是分析某些特殊酶类的酶活
力，这一方法是假设所有待测的细胞都含有这
试规模和中试规模的反应器方面是有用的，但还
不足以用来估测群落的生物多样性。
6、扩增片段长度多态性(AFLP)是RFLP技术和PCR
技术相结合发展而成的一种新型DNA指纹图 谱技术。具有可靠、有效地揭示微生物多 态性水平的能力，为研究微生物属以下物 种之间的亲缘关系，乃至菌株间差异提供 了非常有效手段。该技术的主要步骤：（1） 样品染色体DNA的提取和纯化；（2）DNA的 修饰和模板的制备；（3）AFLP反应；（4） 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析PCR产物；（5） 放射自显影及数据的数值分析。
图8-1 核酸探针和杂交技术的基本过程（池振明，2005）
• 寡聚核苷酸探针由人工合成，一般为30kb左右， 具有很高的灵敏度，可用于检测环境微生物的单 一基因和点突变。 • 目前应用较多的寡聚核苷酸探针是根据细菌rRNA 基因的多拷贝且高度保守的DNA片段设计的。这种 技术在微生物生态学研究时具有重要的用途： （1）用于检测环境中的微生物、指示生物及某些特 定基因型的存在与否；（2）用于检测某一特定环 境中的微生物种群、数量、分布及其变化，从而 预测该环境中的微生物种群变化趋势；（3）用于 检测某些微生物的特定基因型在环境中的动态。
测定的对象是O2和CO2量的变化。
生理学的方法——Biolog 微孔板法
Biolog GN 板是一种多底物的96 孔ELISA 反 应平板。除对照孔只装有四氮叠茂，其余95孔作 为反应孔还装有不同的单一碳底物。在进行ELISA 反应时，各孔中的微生物利用碳底物，呼吸作用 产生电子传递，引起四氮叠茂发生还原反应变为 紫色。微生物对不同碳底物的利用情况可用发生 反应的孔的分布及反应孔的颜色变化―― 时间关 系即群落水平生理图谱（CLPP）来表示。通过对 孔中颜色变化的光吸收值的测量，可获得较系统 的信息。
成的差异，造成单链构像的不同，使单链 DNA或RNA分子在电泳时产生特异性谱带。 被应用于微生物鉴定、微生物区系、微生 物多样性等研究领域。此法的原理是：DNA 单链构象具有多态性，由于碱基序列不同 而影响其空间构象，它的正常序列与变异 序列的单链构象不同，因此在电泳上的迁 移率也不同。从而可以在非变性聚丙烯酰 胺凝胶电泳中来分析DNA单链中的基因突变。
第二节 微生物生态学的分子生物学 研究方法
• 微生物分子生态学方法弥补了传统的微生物生态
学方法的不足，使人们可以避开传统的分离培养 过程而直接探讨自然界中微生物的种群结构及其 与环境的关系。 • 微生物生态学研究中采用的分子生物学方法主要 有核酸探针技术、PCR扩增技术、rRNA序列同源性 分析方法、梯度凝胶电泳方法等。
7、末端限制性片段长度多态性( T-RFLP)，是根据
16S rRNA 的保守区设计通用引物。其中一个引物 的5′端用荧光物质标记。提取待分析样品的总 DNA，以它为摸板进行PCR扩增，所得到的PCR产物 一端就带有这种荧光标记。将PCR产物用合适的限 制性内切酶消化。由于在不同细菌的扩增片段内 存在核苷酸序列的差异，酶切位点就会存在差异， 酶切后就会产生许多不同长度的限制性片段。消 化产物用自动测序仪进行检测，只有末端带荧光 标记的片段能被检测到，而其他没有带荧光标记 的片段则检测不到。这些末端标记的片段就可以 反映微生物群落组成情况，因为不同长度的末端 限制性片段必然代表不同的细菌，也就是说一种 末端限制性片段至少代表一种细菌。