甘蔗钙依赖蛋白激酶基因克隆与序列分析

甘蔗钙依赖蛋白激酶基因克隆与序列分析
摘要：【目的】克隆甘蔗钙依赖蛋白激酶基因（ScCDPK1），为其功能解析和育种利用打下基础。

【方法】根据甘蔗cDNA文库中的CDPK基因序列信息设计引物，利用RT-PCR 克隆ScCDPK1基因，并采用在線生物信息学分析软件对其推导蛋白的理化性质、跨膜结构、信号肽及保守结构域等进行预测分析。

【结果】克隆获得的ScCDPK1基因完整编码区大小1650 bp，编码549个氨基酸，相对分子量61.971 kD，等电点（pI）6.78，不稳定指数35.63。

同源性和遗传进化树分析结果显示，ScCDPK1基因与小麦TaCPK7基因亲缘关系最近，同源性达88%；ScCDPK1蛋白与其他已知CDPK蛋白一致，具有CDPKs家族特有的4个保守区域（可变区、蛋白激酶区、自抑制区和钙离子结合区），其二级结构主要由α螺旋（42.80%）和无规则卷曲（32.97%）构成；蛋白功能分类预测结果显示，ScCDPK1蛋白是一种阳离子通道蛋白，可能参与植物胁迫应答、信号转导和翻译调控等生物反应。

【结论】ScCDPK1基因编码的蛋白与其他已知CDPK蛋白一致，具有CDPKs家族特有的4个保守区域，是一种阳离子通道蛋白。

关键词：甘蔗；钙依赖蛋白激酶基因（CDPK）；克隆；序列分析；生物信息学预测
中图分类号：S566.1 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）04-0574-07 Abstract：【Objective】The calcium-dependent protein kinase gene in sugarcane （ScCDPK1）was cloned to provide re-
ferences for revealing its biological functions and further utilization in breeding. 【Method】The specific primers were designed according to known CDPK gene sequence from sugarcane cDNA library. ScCDPK1 gene was cloned using RT-PCR.
The physical and chemical properties，transmembrane domain，signal peptide，and conserved domains were analyzed using online bioinformatics algorithms. 【Result】The full coding sequence of ScCDPK1 gene was cloned，which included 1650 bp in length and encoded 549 amino acid residues. Its relative molecular weight was 61.971 kD，isoelectric point（pI）6.78 and instability index 35.63. Homology and phylogenetic tree analysis showed that ScCDPK1 of sugarcane shared the closest genetic relationship with T aCPK7 of wheat and had 88% similarity. Like other known CDPK proteins，ScCDPK1 protein contained four conserved domains（variable domain，protein kinase domain，self-inhibition domain and calcium binding domain）. Its protein secondary structure mainly consisted of alpha helix（42.80%）and random coil（32.97%）. Protein functional analysis showed that ScCDPK1 protein was a kind of cation channel protein which play important roles in many biology processes such as plant stress response，signal transduction and translation. 【Conclusion】Like other known CDPK proteins，the protein encoded by ScCDPK1 gene contains four conserved domains which is peculiar to CDPKs family. And it is a cation channel protein.
Key words：sugarcane；calcium-dependent protein kinase（CDPK）；cloning；sequence analysis；bioinformatic prediction
0 引言
【研究意义】甘蔗（Saccharum spp. hybrids）是重要的糖料和能源作物，主要栽培于热带及亚热带地区。

广西是我国甘蔗主产区，但蔗区主要分布在缺乏灌溉条件的旱坡地上，干旱是影响广西甘蔗生产的主要因素之一，严重制约了蔗糖产业的可持续发展（李杨瑞等，
2011；刘鹏飞等，2015；谭芳等，2016）。

钙依赖蛋白激酶（Calcium-dependent protein kinases，CDPK）是一类广泛存在于植物细胞中的钙传感蛋白，具有Ca2+结合功能和丝氨酸/苏氨酸（Ser/Thr）蛋白激酶活性，通过参与细胞Ca2+信号传导调控下游基因表达，在植物应答胁迫反应中发挥重要作用（Harmon et al.，2001）。

因此，克隆甘蔗钙依赖蛋白激酶基因（ScCDPK1）并进行生物学功能分析，有助于探明甘蔗应答干旱胁迫的分子机制，为甘蔗抗旱育种提供参考依据。

【前人研究进展】CDPK为分子量40～90 kD的单肽链蛋白，主要包含4个保守结构域，即可变区、蛋白激酶区、自抑制区和钙离子结合区（Cheng et al.，2002）。

CDPK在植物中为多基因家族，目前已鉴定拟南芥中存在34个成员（Cheng et al.，2002；Harper et al.，2004；Harper and Harmon，2005）、水稻中存在31个成员（Asano et al.，2005；Ray et al.，2007）、小麦中存在20个成员（Li et al.，2008）、玉米中存在40个成员（Kong et al.，2013）、棉花中存在41个成员（Liu et al.，2014）。

此外，在苹果（Battey and Venis，1988）、芒果（Frylinck and Dubery，1998）、烟草（Yoon et al.，1999）和马铃薯（Kobayashi et al.，2007）等植物中也陆续克隆鉴定出CDPK基因。

CDPK 基因受赤霉素、生长素、干旱、高盐、低温、病原菌入侵和机械损伤等外界刺激诱导表达（Romeis et al.，2001；Wan et al.，2007；Boudsocq and Sheen，2013；Schulz et al.，2013）。

Saijo等（2000）研究表明，超表达OsCDPK7和OsCPK13基因可增强转基因水稻植株抵御低温干旱和盐分胁迫的能力；Wan等（2007）研究发现，稻瘟病菌可诱导水稻OsCPK2、OsCPK9、OsCPK15和OsCPK17基因上调表达；Coca和San Segundo（2010）发现AtCDPK1通过正调控水杨酸（SA）信号传导途径而提高拟南芥的抗病性。

【本研究切入点】至今，有关ScCDPK1基因的序列及结构等分子生物学特性尚未明确，且这方面的研究报道甚少。

【拟解决的关键问题】从水分胁迫处理的甘蔗cDNA文库（罗海斌等，2012）中克隆获得ScCDPK1基因，对其序列同源性、遗传进化、推导蛋白理化性质、结构与功能
进行预测分析，旨在为ScCDPK1基因的功能解析和育种利用打下基础。

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