7种菊科药用植物的RAPD分析
菊科植物特征、分布及药用详细情况总结
被子植物科类特征分布及药用详细介绍如下：菊科（Compositae ）：[主要特征]:直立或匍匐草本，或木质藤本或灌木，稀为乔木；叶通常互生，亦有对生或轮生，单叶式复叶，全缘、具齿或分裂花两性或单性，具舌状或管状花冠，密集成头状花序，头状花序中有全为营状花，亦有全为舌状花，有中央为两性或无性管状花（盘花），外围为雌性或无性舌状花（放射花）或雌性管状花，为一个具1至多层的总苞片所围绕，单生或排列成聚伞花序、总状花序、穗状花序、伞房花序或圆锥花序；花序托凸、扁或圆柱状，平滑或有多数窝孔，裸露或被各样片；雄蕊4－5，花药合生成一管，极稀离生，药基钝或具尾，花丝分离；子房下位，1室，具1胚珠，花柱分为2枝，枝的内侧具柱头面，顶端有各种附器；果为菊果（Cypsela），习称瘦果，顶端冠以糙毛、鳞片、刺状冠毛。
[分布及作用]：Compositae菊科，双子叶植物，约1000属，25000－30000种；广布于全球，主要产温带地区，我国有23O属，2300多种,各地均产，有些供观赏，有些入药，也有些供食用，还有产橡胶的。
显微特点：本科植物普遍含菊糖；常具各种腺毛、分泌道、油室；具各种草酸钙晶体。
[分类]：分为2个亚科管状花亚科（Liguliflorae,Cichorioicleae）：[主要特征]：植物体无乳汁；头状花全由管状花组成，或由舌状的边花和管状盘花组成；花柱圆柱状，具附器。
本亚科代表植物如下：1.苍术[形态特征]：[分布]苍术为多年生草本，茅苍术[Atractylodes lancea (Thunb.) DC.]喜温和、湿润气候，耐寒力强，忌强光和高温,生于丘陵岗地杂草丛或树林之中,主要分布于江苏省茅山山脉，浙江、安徽、湖北、河南、四川等省的部分地区亦有分布；北苍术[Atractylodes chinensis (DC.) Koidz.]为山地阳坡、半阳坡灌丛群落中的常见植物。
分布于黑龙江、辽宁、河北、山东、河南、陕西等2 0多个省区。
植物RAPD分析技术
实验20 植物RAPD分析技术RAPD（Randomly Amplified Polymorphic DNA），意为随机扩增多态性DNA，是利用PCR技术进行随机扩增，把扩增的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据DNA条带的多态性来反应模板DNA序列上的多态性。
RAPD同AFLP、SSR等分子标记一样都基于PCR扩增，只是RAPD分析只需要一个引物，其引物长度一般为10个核甘酸，其序列是随机的，不同核甘酸序列的引物均有商品出售。
单引物扩增是通过一个引物在两条DNA互补链上的随机配对来完成。
由于基因组DNA 的差异，使引物与模板的结合位点及这些位点之间的距离不同，使PCR扩增后的片段大小表现出多态性。
在基因组DNA分子内可能存在或长或短被间隔开的颠倒重复序列，如果这些序列与引物能碱基配对，则在两条单链上就会出现该引物的结合位点，结合位点的数量取决于这种重复序列的多少。
不同DNA分子中这种颠倒重复序列间隔的长短不同，扩增条带的大小就不同，即表现出多态性。
10碱基引物理论上有410 种组合，不同引物检测的模板序列不同，用足够多的引物可覆盖基因组全序列，检测位点多，可以在完全不知道分子生物学背景的情况下对基因组进行分析，是研究植物系谱关系、起源与进化、遗传多样性及分子标记辅助育种的简单易行的方法；此外，外源基因转化后，转基因植株与非转基因植株相比，外源基因插入的部位导致基因组DNA序列不同或重排，当引物适宜时，扩增条带的长短就会不同，RAPD技术可以检测出对照植株和转化植株PCR产物带型的区别。
由于随机引物短，与模板结合的退火温度低，易出现碱基错配，因此在实验中要严格操作程序及条件，使RAPD分析的结果较为稳定。
因其费用较低，方便易行，模板DNA用量少，不需要同位素，安全性好，继RFLP之后得到广泛应用；且操作上比AFLP、SSR等分子标记较为简便易行，因此，多数种类的栽培植物在资源多样性、分子标记等方面都有大量RAPD的研究报道。
RAPD技术及其在植物病理学上的应用
2001年 12月河南农业大学学报Dec. 2001第35卷 第4期Journal of Henan Agricultural University Vol.35No.4文章编号:1000-2340(2001)04-0331-04RAPD技术及其在植物病理学上的应用曹丽华1,韩青梅2,刘春元1(1.河南农业大学生物工程学院,河南郑州450002;2.西北农林科技大学动物科学院,陕西杨凌712100)摘要:分析了RAPD技术的原理与优缺点,并总结了近年来该技术在抗性育种、群体遗传、病原物分类检测等植物病理领域内的运用状况.关键词:RAPD;植物病理;应用中图分类号:S432144 文献标识码:AThe technique of RAPD and its applicationin the studies of plant pathologyC AO Li2hua1,H AN Qing2mei2,LI U Chun2yuan1(1.C ollege of Bio2engineering,Henan Agricultural University,Zhengzhou450002,China;2.C ollege of Animal Science,Northwestern Agricultural and F orestry University of Scienceand T echnology,Y angling712100,China)Abstract:The principle and characteristics of RAPD m olecular markers are discussed in this paper.An analysis and summary are given of the application status of RAPD m olecular markers in the studies of plant pathology,such as resis2 tance breeding,mass Heredity,and classification and identification of plant pathogen.K ey w ords:RAPD;plant pathology;application RAPD技术(随机扩增多态性DNA技术)又称AP-PCR技术(任意引物PCR),1990年WE LSH和MC2 C LE LLAND,WI LLI UAMS等2个科研小组各自独立发表了这一新的基于PCR反应检测核苷顺序多态性的研究手段.因为RAPD仅需少量的DNA,且不需要研究对象的克隆库或其他分子形式,通常不需要使用放射性标记的核苷酸,具有简便、快速、费用低、分子识别率高、环境污染小的特点,该技术一经出现便得以广泛应用.与传统的形态标记、同功酶标记、染色标记和毒性标记等相比,现代DNA标记在遗传上是中性的,不受环境变化、生理因素、组织器官发育阶段的影响,不受表型效应的影响,是基于自然变异而不依赖基因表达,不依赖基因互作,不被寄主强烈的选择作用影响.因此RAPD标记可用于从分子水平研究物种的进化与亲缘关系,分析种质资源,客观地认识病原物的群体生物学和流行学,对那些难以人工培养的专性寄生菌和韧皮部病原物的检测和遗传研究而言,RAPD更是提供了一个前景广阔的新思路.近年来,植物病理学研究已不再局限于常规生理生化分析或遗传学手段,而开始使用RAPD等分子生物学方法,从微观入手,研究寄主植物与病原物的识别、互作机理,了解生物体进化变异的本质,加快抗性育种的步伐,科学指导生产布局.收稿日期:2001-04-12作者简介:曹丽华(1971-),女,山西临汾人,河南农业大学生物工程学院讲师,西北农林科技大学在读博士生,从事植物免疫学及分子植物病理学研究. 332河 南 农 业 大 学 学 报第35卷1 RAPD技术的原理与优缺点1.1 RAPD技术的原理RAPD一般使用10聚体随机引物,其标记的产生基于以下假设:与某一单一引物同源的DNA序列有可能出现在DNA模板互补链的其它位置上,如果这些位置间的距离处于可通过PCR扩增的长度范围,单个10聚体引物就可在PCR反映中介导DNA呈几何级数扩增[1].在实际操作中首先进行的是2个低严谨度循环,使寡核苷酸引物在低严谨条件下与模板退火,然后进行40个左右高严谨度退火条件的循环,使2个位点间的序列在前2个低严谨度退火条件下发生的引物延伸在随后的高严谨度退火条件下继续扩增.通常情况下,每个引物可产生3～10个非连续的DNA产物,一般认为这些产物是由不同的遗传位点产生.发生在引物结合位点上,或引物结合序列之间的突变与重排可导致某个扩增产物的出现或消失,进而表现出多态性[2].1.2 RAPD技术的优缺点在RAPD技术出现之前,人们主要利用RF LP(限制性片段长度多态性)技术评判DNA水平的多态性.由于RF LP对DNA含量和纯度要求高,技术难度大,需制备放射性探针,进行S outhern转移及杂交、放射自显影,RF LP技术显得费时、繁琐、污染严重.相比之下,RAPD利用PCR随机合成多态性DNA片段,检测被扩增区域内的遗传变化,具有极大的探测性和丰富性.人们不需要预知的系列资料,即能通过有目的地降低退火步骤的严谨度和选择与基因组匹配力不同的单个引物,可重复地获得信息量丰富的基因组指纹图谱.如果设计的引物在低严谨度退火条件下能减少引物产生的人为产物,应用成对组合的引物可以产生新的RAPD谱型.这说明RAPD的高效性和灵敏性足以反映出亲缘关系相当紧密的个体间遗传性质的变化[3].由于RAPD的引物是随机选择的,任何生物体都可使用同一套引物作图.如果设计时将序列偏向人工选择,则可针对G C富集区域,重复序列和基元序列作图,使研究的目标性更强.与其他方法一样,RAPD技术也存在一些弱点.首先RAPD多态性的基础是引物结合位点序列的不匹配或序列上的插入与缺失,这意味着RAPD标记是显性的,不能将2份拷贝等位基因的个体(纯合表型)与单拷贝个体(杂和表型)区分开,在F2群体中RAPD图谱可提供的信息量也相应减少.其次,RAPD图谱对实验程序和条件的变化很敏感,PCR缓冲液、dNTP和Mg2+浓度、循环参数(退火温度、变温时间、PCR 仪)、T aq酶、模板DNA含量、引物浓度等均可影响到RAPD的可靠性和可重复性.因此不同的研究者必须对RAPD的条件标准化,提供RAPD材料和方法的具体细节,方可进行RAPD结果的比较[4].2 RAPD技术在植物病理学上的应用2.1 应用RAPD技术进行植物基因定位选育和利用抗病品种是防治病害最经济有效的措施,但常规育种年限长,并存在远缘杂交不育、不稔等问题.相比之下,转基因技术的目的性更强、操作周期短、应用潜力巨大.目前植物遗传图谱的构建与抗病基因的选择分离已成为分子育种瓶颈所在.利用RAPD技术进行的基因定位主要在两个方面———近等位基因系(NI L)的基因定位和利用F2个体目的基因分离的基因定位.近等位基因系(NI L)是植物抗性育种的产物,人们往往将供体亲本的一个目的特征(如抗病、抗虫、抗除草剂和抗旱等)通过渐渗现象导入另一个农艺性状良好的回归亲本,不断地回交、筛选.近等位基因系与回归亲本间除目的基因及其周围部分外,其它所有位点均完全一致,因此用RAPD可快速有效地筛选与渐渗片段相连的标记.如M ARTI N等[14]用144个随机引物筛选了1对番茄近等位基因系,确定了3个位于番茄第五染色体上的与P seudomonas syringae抗病位点pto紧密连锁的产物.C AR LAND和ST ASK AWICZ[15]用另1对不同的NI L得到了其它7个与pto紧密连锁的标记.RONA LD等[16]用985个引物确定了2个与水稻白叶枯抗性位点Xa21连锁的标记.BARUA等[17]用300个引物筛选了1对NI L,确定了大麦中与Rhyn2 chosporium secalis抗性位点疏松连锁的标记;PE NNER等[18]用204个引物筛选,得到了1个与燕麦茎腐基因pg3连锁的标记.利用F2个体目的基因分离的基因定位又称混合分离分析法,应用此法时,先在1个F2群体内对表型第4期曹丽华等:RAPD技术及其在植物病理学上的应用333 进行评估,选出数个具有某种极端表现型的个体组成3个池,另选出具有与之相对性状表型的数个个体组成另1个池.再在每个池中进行RAPD,2个池间的任何多态性都可能连锁,不连锁的多态性仅占多态性位点的1/32[19].董伟等[5]以高抗品种东农9674为父本,以高感品种东农87—104为母本,杂交得到F2代群体,该群体经人工接种灰斑病1号生理小种后,分别从抗、感材料中取15株的叶片提取DNA组成抗、感池.用820个引物进行RAPD分析,得到3个与抗性协同分离的多态性标记,且这3个标记与抗性基因R f1的连锁顺序为(OPK03840-R f1-OPM171700-OPO10950),连锁距离为(10.4cM-R f1-13.8cM-26.1cM). WEI LAND J J[20]等用Pyrenophora teres f.teres的毒力不同的2个菌株杂交,发现P.teres f.teres对‘Harbin’大麦的毒力由单一的主效基因控制,从父母本及杂交菌株中制备DNA用于RAPD分析,发现有5个与低毒位点连锁的RAPD标记.2.2 应用RAPD技术进行遗传多样性和系统发育研究物种间DNA相似性的高低,决定其亲缘关系的远近.通过特定分子量大小的共迁移带的研究,人们可能了解物种进化的历程,以及物种在属、种水平上的亲缘关系[13].相对RF LP等其它分子标记,简便、经济、高效的RAPD技术在自然群体的遗传结构与动态变化研究、亲本推断、基因流估测等方面影响深远,RAPD 多态性指纹图谱现已广泛地用于系统学和群体遗传学研究.韩正敏等[6]研究了我国不同地区不同寄主上的42个杨生褐盘二孢菌菌株,以80%的聚类相似性把42个菌株分成A组、B组和AB组,并推断AB组菌株可能是A组菌株向B组菌株进化的1个过渡类型.王莉梅等[7]以RAPD鉴定北方棉区棉黄萎病菌落叶型菌系时发现,26个北方落叶型菌系中的22个与来自美国的对照落叶型菌系T9,V44的关系比来自江苏的对照落叶型菌系V B,V991的关系更近.刘学堂等[8,9]对我国12个省主要产棉区26个黄萎病菌进行RAPD分析,认为可分成A,B两群,其中B群又分为Ba,Bb 两亚群;且不同的黄萎单孢菌RAPD分析有差异,这说明棉黄萎病菌中存在单孢变异现象.冯洁等[10]将棉花枯萎菌划分为了6个RAPD组,认为中国的3号、7号小种分属2个独立的RAPD组,8号小种则分属2个不同的RAPD组,是遗传背景最为复杂的1个小种,今后该群体可能会划分出新的小种.实验还发现,7号小种致病力变异的Ag156和Ag173菌株在分子水平上没有差异,因此估计该致病力变异尚未导致遗传基因的改变.单卫星等[11]对中国小麦条锈菌流行小种的多个模式分离系进行的RAPD分析表明条锈菌的小种内与小种间存在遗传变异,且地理上相隔数百公里并有高山阻挡的地区间也存在菌源相互交流的可能.在国外H A J EKA E等[21]用RAPD法,分析了来自北美2个不同寄主的Zoophthora phytonomi的起源,认为此病原的2个基因型,一个起源于以色列(Isreal),一个起源于欧亚(Eurasian).DE LYE C等[22]用RAPD法分析了葡萄白粉菌62个欧洲分离物中存在的遗传多样性,认为葡萄芽中的越冬菌丝与越冬的子囊孢子在遗传上显著不同,这表明分离的白粉菌中存在2个遗传类群;同年,他们又分析了采集于不同地区的葡萄白粉菌菌丝,系统分析表明414个扩增产物可分为3个类群,多数欧洲分离系聚在一起构成1个类群,而印度分离系则可聚类为2个类群,且这2个类群具有不同的气候忍耐性,可能代表不同的遗传类群.此外,进行了遗传变异和多态性研究的真菌类群还有:Fusarium Oxysporum,Alternaria solani和A.alternata,Beauve2 ria bassiana,Aphanomyces euteiches,Tilletiopsis,Uncinula necator等.2.3 利用RAPD技术进行病原微生物的分类、鉴定RAPD反应所产生的指纹图谱相当复杂,包含的信息量丰富,其多态性可用以鉴别亲缘关系很近的个体间的差异.通常情况下,2个差异模板间产生的RAPD多态性条带大致与它们的遗传距离相等.因此寻找特异的RAPD条带,制作特异探针,可使传统的以形态学比较为基础的鉴定分类技术变得简便、准确和规范化,同时也可监测病原菌变异,提供指导品种合理布局的依据.王莉梅等[6]用RAPD法对采自北方棉区6省的34个棉花黄萎病菌进行分类鉴定,发现其中26个为落叶菌系,6个为非落叶菌系.实验中还初步筛选了2条用以鉴别Verticillium dahliae落叶系与非落叶系的特异RAPD条带OP B-19966和OPM-201691;冯洁等[12]分析了棉花枯萎菌3个生理小种的26个菌株,从产生的140个RAPD分子标记中找到了不同小种的特征性条带OPF—10513(3号小种).OPF—08371(7号小种), OPF—12703(8号小种),CHI OCCHETTI A等[23]研究了Fusarium oxysporum的52个菌株,发现 F.oxysporum f. sp.Basilici的RAPD图谱与其他专化型的以及 F.oxysporum的非致病菌株的RAPD图谱明显不同, 334河 南 农 业 大 学 学 报第35卷K AISER W T等[24]用RAPD带谱的差异鉴定了Ascochyta f abae与A.lentis及其杂交后代.T AN M K等[25]分析了3种柑橘疮痂病菌的遗传差异,RAPD的结果表明来自于澳大利亚和弗罗里达的Elsinoe f awcettii之间比来自阿根廷的E.australis更接近,RAPD图谱可以区别所有来自澳大利亚和来自弗罗里达的病菌,这充分表明RAPD标记是一种快速、实用的病原鉴定工具,在植物检疫方面应用前景广阔.3 小结与展望随着分子生物学技术的发展、普及与实验成本的下降,越来越多的基础研究将借助于这些现代分析手段,植物病理学这一古老的学科也展现出了新的活力.植物病原物的分子诊断技术和抗性遗传标记技术的发展使得直接从复杂的生物混合物中鉴定和识别病原物而不必室内培养成为现实;进行抗性位点标记可极大地加快抗性育种的筛选进程;从分子角度研究病原菌的群体遗传结构与动态变化,将有助于了解病菌与寄主的互作机制,指导抗性育种与生产.参考文献:[1] 顾红雅,瞿礼嘉译.植物分子生物学-实验手册[M].北京:高等教育出版社,1998.[2] 穆里斯K B,费里F,吉布斯R,等.陈受宜,等译.PCR聚合酶链式反应[M].北京:科学出版社,1997.[3] 王和勇,陈敏,廖文华,等.RF LP,R AP D,AF LP分子标记及其在植物生物技术中的应用[J].生物学杂志,1999,16(4):24-25.[4] 荆玉祥,匡延云,李德保.植物分子生物学—成就与前景[M].北京:科学出版社,1995.[5] 董伟,扬庆凯,沈义国,等.大豆灰斑病1号生理小种抗性基因的RAPD标记[J].高技术通讯,1999,24(10):48-51.[6] 韩正敏,尹佟明,黄敏仁,等.用RAPD研究我国杨生褐盘二孢菌的群体分化[J].植物病理学报,1998,28(4):347-352.[7] 王莉梅,石磊岩.北方棉区棉花黄萎病菌落叶型菌系鉴定[J].植物病理学报,1999,29(2):181-189.[8] 刘学堂,郭金城,张元恩,等.中国主产棉区黄萎病的RAPD分析[J].华北农学报,1999,14(1):107-114.[9] 刘学堂,郭金城,张元恩,等.棉花黄萎病菌gDNA提取方法和不同单孢的RAPD分析[J].河南农业大学学报,1999,33(3):274-278.[10]冯洁,孙文姬,石磊岩,等.棉花枯萎病菌生理小种的分子指纹分析[J].棉花学报,1999,11(5):230-234.[11]单卫星,陈受宜,惠东威,等.我国小麦条锈菌的DNA指纹分析[J].科学通报,1996,41(15):1427-1430.[12]冯洁,孙文姬,石磊岩,等.我国棉花枯萎菌生理小种特异性DNA扩增片段的筛选及序列测序[J].植物病理学报,2000,1:4-9.[13]姜述君.RAPD标记及其在植物真菌病害研究中的应用[J].黑龙江八一农垦大学学报,2001,13(1):17-22.[14]M ARTI N GB,WI LLI AMS J G K,T ANK S LEY S D.Rapid identification of markers linked to a P seudomonas resistance gene in tomatoby using random primers and near2is ogenic lines[J].Prc Natl Acad Sci US A.1991,88:2336-2340.[15]C AR LAND F M,ST ASK AWICZ B J.G enetic characterisation of the pto lcus of tomato2semi2dominance and co2segregation of resis2tance to P seudomonas syringae Pathovar tomato and sensitivity to the insecticide Fenthion[J].M ol G en G enet,1993,239:17-27. 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几种常用分子标记遗传多样性参数的统计分析
张德全1,2,杨永平(1中国科学院昆明植物研究所,云南昆明650204;2中国科学院研究生院,北京 100049)摘要:对235篇文献中314种野生种子植物的遗传多样性参数进行了统计分析。
结果表明,目前常用的五种分子标记中,ISSR 、等位酶和SSR 的参数值间差异显著,彼此不宜直接比较,且与RAPD 和AFLP 的参数也不宜直接比较;显性标记RAPD 和AFLP 的参数之间可以直接比较。
基于Hardy -Weinberg 平衡的遗传分化指数G st 值明显低于基于A MOV A 分析的Φst 值,两者亦不宜直接比较。
对基于RAPD 和AFLP 标记的179种植物的遗传多样性参数进行联合分析,结果表明:在种群水平上,裸子植物的遗传多样性比双子叶植物和单子叶植物都要高,而其遗传分化值较低;乔木的遗传多样性比草本和灌木高,而分化值更低;克隆植物具有比有性生殖更高的遗传多样性,在有性生殖植物中,异交植物最高,而自交植物最低;广布种的遗传多样性明显高于濒危和狭域分布种。
关键词:遗传多样性;生活史特性;显形标记;等位酶;SSR 中图分类号:Q 16 文献标识码:A文章编号:0253-2700(2008)02-159-09ZHANG De -Quan1,2,YANG Yong -Ping1**(1Kunming Institute of Botany ,Chinese Academy of Sciences ,Kunming 650204,China ;2G raduate University of Chinese Academy of Sciences ,Beijing 100049,China )This paper presented a statistical and comparative analysis of common parameters of plant genetic diversity by using relevant data of 314wild plant species fro m 235published articles .The results indicated that the parameters of genet -ic diversity revealed by RAPD and AFLP are comparable ,but all parameters of genetic variation detected by ISSR ,allo z -yme and SSR are incomparable ,which are not comparative with those by RAPD and AFLP .The genetic differentiation val -ue G st based on Hardy -Weinberg equilibrium is obviously lower than the value Φst based on AM OVA analysis ,which showed that these two parameters are inco mparable as well .Furthermore ,the statistical and comparative results of genetic diversity of 179plant species by RAPD and AFLP indicated that at population level :1)the genetic diversity of gy mnosperm is higher than those of both dicotyledon and m onocotyledon of angiosperm ,but lower genetic differentiation ;2)the genetic diversity of tree is higher than those of shrub and herb ,but lower genetic differentiation ;3)the clonal plant has higher ge -netic diversity than those reproduce sexnally ,and 4)the cross -breeding plant has higher genetic diversity than self -breeding plant ;5)the widespread plant species has higher genetic diversity than the rare ,endangered or endemic species .Genetic diversity ;Life history ;Dominant molecular markers ;Allozyme ;SSR遗传多样性是生物多样性的重要组成部分,是地球上所有生物携带的遗传信息的总和(施立明,1993)。
RAPD技术在中药材鉴定中的应用
综述
广 东 药 学 院学 报
A CAD EM IC JO U RN AL O F GU A N GD ON G CO LLEGE OF PHAR M ACY
Vol. 17 No. 1
M ar. 2001
RAPD 技术在中药材鉴定中的应用
王阳顺* 综述 罗集鹏 审校 ( 广东药学院术是一种 DNA 分子标记技术, 自 90 年代问世以来, 人们即把它试用于 中药材的 鉴定, 并 在该领域 取得可喜的 研 究进展。本文就 RAPD 技术的基本原理以及它应当用于中药格鉴定的优缺点、注意事项、目前国内外研究动态、可能 发展前景等 方 面作了较详细的阐述。 关键词 RAPD 技术; 中药材; 鉴定 中图号 R282. 5 文章编号: 1006-8783( 2001) 01- 0019- 03 文献标识码: A
RA PD 即 随 机 扩 增 的 多 态 性 DNA ( R andom amplified polymorphic DNA ) , 是美 国的 Williams 与 Welsh 两 个研 究小 组 于 1990 年同时提出的一种 DN A 分子标记 技术。Williams 等[ 1] 称之 为 RA PD, Welsh 等[ 2] 称 之 为 A p- PCR ( Arbitarily primed PCR) 。RAPD 技 术建立在 PCR( poly merase chain r eaction) 技术 基础上, 它是 以任 意 顺序 列的 寡 核苷 酸 单链 ( 通 常为 10 个 碱 基,A p- PCR 则为 20~ 30 个碱 基。) 为 引物, 对 所 研究 的基 因组 DNA 进行 随机扩增。RA PD 所用的一系列 引物的 DN A 序列各 不相同, 但对于任一引物, 它同基因组 DNA 序列有 特定的 结合 位点。这些特定的结合 位点 在基 因组某 些区 域 内的 分布 如符 合 PCR 扩增的反应条件, 即在一 定范围内 模板 DNA 上有 与引 物互补的反相 重复 序 列时, 就 可 扩 增出 此 范围 的 DNA 片 段。 在不同物种基 因组 DNA 中, 这 种反相 重复 序列 的数 目和 间隔 的长短不同, 就可导致这些特定的 结合位 点分布发 生相应 的变 化, 而使 P CR 扩 增产物增加、减少 或发生 分子量 的变化。 通过 对 P CR 产物的检 测( 扩 增产 物以 琼脂 糖凝 胶电 泳分 离, EB 染 色,紫 外灯下 测 视, 拍 照。) 和 比 较, 即 可识 别 这 些物 种 基因 组 DNA 的扩增多态性片段。Williams[ 1] 等已用实验证明这 种短的 随机引物可用于扩增从低等到高等各种生物的基因组 DNA, 并 已证明这种多态性是按孟德尔方式遗 传的, 因而可 以用此 作遗 传标记, 研究物种的亲缘关系。
药用菊花种质资源研究进展
药用菊花种质资源研究进展夏伟;谭政委;余永亮;杨红旗;许兰杰;董薇;梁慧珍【摘要】菊花是我国重要的药用、食用及观赏类资源,药用历史悠久.药用菊花以栽培为主,在其药用历史中菊花虽然种类众多,但新品种较为匮乏.从药用菊花资源分布、种质资源多样性、表型多样性、质量多样性及遗传多样性对菊花进行综述,探讨药用菊花应用并展望,以为获取高产、高质、高效药用菊花新品种提供依据.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2018(046)021【总页数】3页(P37-38,49)【关键词】菊花;资源分布;多样性;新品种【作者】夏伟;谭政委;余永亮;杨红旗;许兰杰;董薇;梁慧珍【作者单位】河南省农业科学院芝麻研究中心,河南郑州450002;河南省农业科学院芝麻研究中心,河南郑州450002;河南省农业科学院芝麻研究中心,河南郑州450002;河南省农业科学院芝麻研究中心,河南郑州450002;河南省农业科学院芝麻研究中心,河南郑州450002;河南省农业科学院芝麻研究中心,河南郑州450002;河南省农业科学院芝麻研究中心,河南郑州450002【正文语种】中文【中图分类】S602.4菊花为菊科植物菊(Chrysanthemum morifolium Ramat.)的干燥头状花序[1]。
菊花始载于《神农本草经》，列为上品[2]。
传统理论中认为菊花性甘、味苦，微寒；归肺、肝经；可散风，平肝明目，清热解毒。
临床用于治疗风热感冒、头痛眩晕、目赤肿痛、眼目昏花[1]。
现代研究表明，菊花含有挥发性、黄酮、萜类、有机酸等化学成分，应用菊花配伍在风热感冒、抗病毒等领域具有明显疗效，并且对其有效成分研究发现，菊花具有抗肿瘤、保肝等药理作用[3]。
菊花是传统的常用大宗药材，药用品种丰富，分布广泛，但关于菊花种质资源的研究报道较少。
而对菊花资源分布及多样性进行研究，有利于改良药用菊花种质，改善菊花药用市场，从而为获得高产、高质、高效药用菊花新品种提供依据。
菊属植物遗传多样性的RAPD分析
菊属植物遗传多样性的RAPD分析刘蕤;杨际双【摘要】采用RAPD分子标记技术分析了菊属10个野生种和12个栽培品种间的遗传关系和多样性.从50个随机引物中筛选出了14条引物,对供试材料的DNA进行扩增,共获得169条清晰可辨的谱带,多态位点比率为96.4%,多态性较高.POPgene32软件计算结果表明;种(品种)间相似系数变幅在0.195 4～0.565 6;平均有效等位基因数为1.515 8,平均Nei's基因多样性指数为0.321 6,平均Shannon信息指数为0.479 4.并且菊属野生种的多态条带、多态位点比率、平均有效等位基因数(Ne)、平均Nei's基因多样性指数(He)及 Shannon信息指数值均高于栽培菊花,表明野生种的遗传多样性比栽培菊花丰富.根据Jaccard相似系数进行UPGMA聚类结果表明,"若狭滨菊"与栽培菊花关系较近,野菊和小红菊与栽培菊花亦较近.栽培菊花基本可以按照花径聚类.【期刊名称】《河北农业大学学报》【年(卷),期】2010(033)001【总页数】7页(P60-65,83)【关键词】菊属;菊花;RAPD;遗传多样性;遗传关系【作者】刘蕤;杨际双【作者单位】河北农业大学,园林与旅游学院,河北,保定,071001;河北农业大学,园艺学院,河北,保定,071001【正文语种】中文【中图分类】S682.1菊花(Dendranthema×grandi f lorum)系菊科(Compositae)菊属的多年生草本植物,是原产中国的传统名花之一,在中国已有1600年以上的栽培历史,品种达3000以上,类型丰富多彩[1-2]。
随着分子生物学的发展,从基因水平上研究菊属植物之间的遗传多样性及其性状与基因之间的关系,能为培育新的菊花品种、品种鉴定和保护种质资源提供依据。
中国拥有近2/3的菊花品种,丰富品种类型的形成和品种之间丰富的遗传多样性一直备受关注,韩洁等[3]和吴在生等[4]运用AFLP分子标记技术分别对菊花栽培品种进行分析,多态位点比例高达92.8%和73.0%,证实了菊花在DNA水平上酶切位点的分布存在着广泛的变异;丁玲等[5]分析了菊花品种间过氧化物酶、酯酶同工酶的差异也得出了菊花品种间遗传变异很丰富的结论。
菊科Compositae ↑K0～∞C3～5 A4～5G2∶1∶1。
本科植物很少含有淀粉，但大多含有菊糖。常 见的药用植物有红花、菊花、白术、苍术、茵陈、 黄花蒿、滨蒿、艾、木香、紫菀、牛蒡、旋复花、 醴肠、佩兰、蒲公英、大蓟、小蓟、千里光、天明 精、苍耳、祁州漏芦、款冬、飞廉、豨莶 、山莴苣、 大丁草、橐吾 、兔耳伞、菊叶三七、青蒿、南牡蒿、 大金鸡菊、 大丽花 、鬼针草 、马兰、 泽兰。
雪莲
雪莲花解剖
苍 耳Xanthium sibiricum Patr.et Willd.
为苍耳属植物；茎无刺，上有浅褐色 斑点，叶三角状卵形或心形，基部三 出脉；果实成熟后囊状苞片变坚硬， 密被钩刺；果实入药，有微毒，具有 发汗通窍、散风驱湿、消炎镇痛之效； 幼苗有剧毒。草本，叶互生，叶缘具 不规则的锯齿，两面有糙伏毛。头状 花序单性同株，雄花序在上( A )，雌 花序在下或腋生( B )，雌花序的总苞 片2-3层，内层的2总苞片较大，愈合 成一个2室的壶状体( C )，外生钩刺， 顶端有喙( D )，每室有一花，连萼瘦 果( E )，果皮黑色，种皮( F )，子叶 ( G )。
与花柱从花药筒中
穿出时将花粉推出，
然后柱头张开露出 授粉面(E)接受花粉， 连萼瘦果(F)有中棱 与瘤状突起，具细 长的喙，冠毛(G)白 色，宿存。
蒲公英花解剖
旋复花Inula japonica Thunb.
为旋复花属植物； 茎直立，单生或簇生， 上有分枝，被长伏毛， 基部叶有柄，下部叶 通常宿存，头状花序 直径2-4厘米5-13个排 成散房状，雌花舌状， 黄色；全草入药，根 叶治刀伤、疔毒，煎 服可平喘镇咳；幼苗 称“金沸草”，花称 “旋复花”，功效相 似，能化气降痰、软 坚行水。
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摘要 [目的 ]利用 RAPD 技术研究 7种菊科药用植物的遗传多样性及亲缘关系。 [方法 ]从 50条 10 bp随机引物中筛选出 10个多态性 好的引物进行 RAPD扩增, 扩增 DNA 片段数据用 UPGMA 聚类法构建系统发育树。 [结果 ] 10条引物共扩增出 337条带, 多态性带 337 条。聚类结果显示, RAPD 分子标记构建的系统发育树在族内属间与传统分类系统一致。 [结论 ]该研究可为菊科药用植物的鉴别提供 参考, 并为针对性地进行菊科植物的保护提供依据。 关键词 菊科; 药用植物; RAPD分析 中图分类号 R 284. 1 文献标识码 A 文章编号 0517- 6611( 2010) 17- 08964- 03
38卷 17期
樊晓霞等 7种菊科药用植物的 RAPD分析
8965
的 RAPD图谱见图 1。 10条引物对 7种菊科植物 DNA 进行 扩增, 共产生 337条不同分子量的谱带, 各个引物产生的多 态性条带数不一 (表 1)。每条引物在 7 种菊科植物中都产
生了不同的指纹图谱, 且没有 1条引物能在所选菊科植物中 扩增出共有条带, 这说明所选菊科植物的遗传相似性较低, 遗传物质的差别较大。
RAPD Analysis of Seven Species of M ed icalP lants from A steraceae FAN X iao xia et al ( College of L ife Sciences and Engineer ing, Southwest Jiaotong U niversity, Chendu, S ichuan 610031) A bstract [Ob jective] The research ami ed to analyze 7 spec ies of m edical plants from A steraceae by random am plified po lym orph ic DNA ( RAPD ) analysis. [M ethod] 7 species o fm edica lplants from A steraceae were am plified by 10 selected prmi ers from 50 prmi ers, and the results were generated by UPGMA a lgorithm to cluster genetic distance cacula ted from RAPD data. [ Result] 10 selected pr mi ers were able to produce 337 clear po lym orphic bands which were all po lym orphic. The genetic results based on RAPD m arkerswere consistantw ith that of the traditional classification to som e exten.t [ Conc lusion] The study can prov ide reference for identifing m edical plants from A steraceae, and lay basis for its corresponding protec.t K ey w ords A steraceae; M edical plants; RAPD analysis
2010 03 17
rTaq DNA 聚合酶购自大连宝生物工程有限公司; NaC 、l Tris、 EDTA、SDS、醋酸钾、醋酸钠、巯基乙醇均为进口分装试剂; 其 他试剂为国产分析纯。 DNA 提取缓冲液 [ 500 mm ol/L N aC l、 100 mm ol/L T ris HC l ( pH 值 8. 0) 、50 mm ol/L EDTA ( pH 值 8. 0)、2% 巯基乙醇 ] ; [9] TE 缓 冲液 [ 10 mm ol/L TrisH C l ( pH 值 8. 0)、1 mm ol/L EDTA ( pH 值 8. 0) ]。 1. 2 方法 1. 2. 1 DNA的提取。采用改良 SDS法 [ 10] 提取 DNA, 用核酸 蛋白定量仪检测 DNA 溶液的浓度和纯度, 并将其稀释为 10 m g /m ,l 于 - 20 冰箱储存备用。 1. 2. 2 PCR 扩增。 PCR反应在 PTC 100TM B IO RAD PCR仪 上进行, 反应体系总体积为 25 ,l 包括模板 0. 6 ng / ,l 引物
引物
Prim er S88 S111 S288 S296 S339 S1222 S1361 S1422 S2008 S2158 总计 Total
序列 ( 5 3 ) S equ ence
TCA CGT CCA C CT TCCGCAGT AGG CAGAGCA GGGCCAA TGT GTGCGA GCAA GT CCTCGT GT TCGGA TCCGT GT CGTCGTCT CCACAGCCGA GA CG CTTGT C
F ig. 1 RAPD amp lified by prim er S2008
2. 2 7种菊科植物聚类分析结果 由表 2可知, 在由 337
个 RAPD标记获得的 Nei氏相似性系数矩阵中, 7种菊科植
物两两间相似系数分布在 0. 043~ 0. 303, 平均相似性系数
为 0. 173。其中 天名 精与 苍耳 之间 的相 似系 数最小, 为 0. 043, 表明这 2个物种亲缘关系最远。采用 UPGMA 法进 行聚类分析, 构建树系图见图 2。由图 2可知, 依相似性系 数 0. 289水平, 同为向日葵族 ( Trib. H elen ieae Cass. )的 2份 材料 (鬼针草和苍耳 )聚为 1支, 其余 5份材料各为 1 支, 因 此可以将 7份材料以族为单位进行分类, 这与传统分类结 果 [ 12] 一 致。并 且 在传 统分 类学 上, 青蒿 属于 春 黄菊 族 ( T rib. An them ideae) , 天名 精属 于 旋覆 花族 ( Trib. Inu leae C ass), 马兰属于紫苑族 ( T rib. A stereae C ass. ) , 它们同向日 葵族共属于向日葵超族 ( Supertrib. H elianthanae Y. R. L in) ; 斑鸠菊 为斑 鸠 菊超 族 ( Supertrib. V ernon ianae) 斑鸠 菊 族 ( T rib. An them ideae); 白术为帚木菊超族 ( Supertrib. M u tis ia nae)菜蓟族 ( Trib. C ynareae)。而依相似性系数 0. 147水平 时, 可以观察到同为向日葵超族的 5份材料分裂为 2 支, 马 兰、天名精和青蒿聚为 1支, 与斑鸠菊超族的斑鸠菊遗传相 似性更接近; 而鬼针草与苍耳聚为 1支, 与帚木菊超族的白 术遗传相似性更接近。
多态性条带数比率 % Polym orph ic fragm en ts rate
100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
注: M 为 250 bp DNA LadderM arker; 1代表青蒿; 2代表鬼针草; 3代 表马兰; 4代表天名精; 5代表斑鸠菊; 6代表白术; 7代表苍耳。
菊科 ( A steraceae)是世界上种子植物中最大的科, 分布 在我国的有 240属, 2 300多种。近年来, 有诸多学者从细胞 学、同工酶及 DNA分子水平上对部分菊科植物进行了较为 系统的研究。他们发现, 药用菊品种比观赏菊品种更接近菊 属野生种 [ 1]。栽培菊主要起源于 D endran the indicum、D. vesti tum 和 D. nankingense[ 2- 3] 。在菊属野生种、栽培菊及种间杂 种间父母本亲缘关系近的遗传距离较小, 杂交亲和性好, 结 实率较高; 反之, 杂交亲和性差, 难以结实 [ 4]。新疆红花具有 丰富的遗传多样性, 可划分为 4 个主要类群, 且与其生态地 域性不存在相关性 [ 5] 。冷蒿居群表现出丰富的 RAPD 多态 性, 居群亲缘关系与其地理分布有着密切关系 [ 6] 。大多数来 源相同的观赏向日葵种质资源表现出较为密切的亲缘关 系[ 2] 。引物 S40扩增的指纹图谱特异性最强, 能同时将 30 份野生菊和 2份栽培种菊明确区分开来, 可作为种质鉴定的 重要依据 [ 8]。在上述研究的基础上, 笔者对峨眉山的几种药 用菊科植物进行 RAPD分析, 旨在为菊科药用植物的鉴别提 供参考, 也为针对性地进行菊科植物的保护提供依据。 1 材料与方法 1. 1 材料 1. 1. 1 研究对象。青蒿 ( Artem isia apiacea H ance)、鬼针草 ( B iden s pilosa L. )、马兰 [K a lim eris indica ( L. ) Sch. B ip. ]、 天名精 (C arpesium abrotanoides L. ) 、斑鸠菊 [ Vernonia cinerea ( L. ) Less. ]、白 术 ( A tractylod is m acrocephala K oidz)、苍 耳 (X an th ium sibiricum Patrin. ), 来源于四川峨眉。 1. 1. 2 主要试剂。RAPD PCR 扩增引物购自上海生工生物 工程技术服务有限公司; dNTPs、250 bp DNA LadderM arker、