RT-qPCR技术的原理及应用汇编
RT-qPCR技术的原理及应用
RT-qPCR技术的工作原理
1 逆转录（RT）阶段
通过RT酶将RNA模板转录成相应的互补DNA（cDNA）。
2 实时荧光定量PCR（qPCR）阶段
在PCR反应过程中，结合荧光探针或DNA染料实时检测PCR产物的数量，并利用定量标准 曲线计算RNA的起始含量。
RT-qPCR技术的优点和应用范围
高灵敏度
2 引物和探针设计
合理设计引物和探针，确保其与目标序列的特异性和敏感性。
3 数据分析和标准化
准确解读和分析RT-qPCR结果，合理选择标准曲线和内部参考基因等。
结论及展望
RT-qPCR技术以其高灵敏度、高特异性和广泛应用范围，在基因表达分析和病 毒检测等领域发挥着重要作用。随着技术的不断发展，我们可以期待在未来 更多领域中看到RT-qPCR技术的应用。
RT-qPCR技术的原理及应 用
RT-qPCR技术是一种广泛应用于分子生物学领域的技术，用于检测和定量分析 RNA的表达水平。 本文将介绍RT-qPCR技术的基本概念、工作原理、优点和应 用范围，并探讨其在基因表达分析和病毒检测中的应用。 与其他方法相比， RT-qPCR技术具有许多优点，但在应用中也有一些挑战和注意事项。
RT-qPCR技术的基本概念
1 什么是RT-qPCR技术？
2 为什么使用RT-qPCR技术？
RT-qPCR（逆转录实时荧光定量聚合酶链反应） 是一种将反转录和实时荧光定量PCR结合起来 的技术，用于定量分析RNA的表达水平。
RT-qPCR技ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ具有高灵敏度、高特异性、广泛 动态范围和准确性等优点，使其成为研究基 因表达和病毒检测等领域的重要工具。
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目标基因筛选
使用RT-qPCR技术可以准确地定量不同基
RTqPCR实时荧光定量PCR
Ct值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经
过的扩增循环次数。Ct值极具重现性。分析定量时多取15-35较好。
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RT-qPCR 原理----定量原理
1.绝对定理想的PCR反应：
X=X0 (1+Ex)n
n： 扩增反应的循环次数
X： 第n次循环后的产物量
X0：初始模板量
Ex：扩增效率
Ct = −
log X0
log X
+
log(1 + Ex) log(1 + Ex)
=
−1
log(1 + Ex)
Ex = 10−1/ − 1
log X0= - log(1+Ex) *Ct+ log X
Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值
合后才发荧光。（在变性过程中无荧光，在复性及
延伸过程中发出荧光）
• 特异性荧光标记：
• 1、TaqMan 水解型杂交探针。5′端标记有报告
基团R，3′端标记有荧光淬灭基团 Q。探针完整
，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光。
Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针R
与Q分开，发出荧光。
• 2、Molecular Beacon 分子信标。标记荧光的发夹
就可计算出样品中所含的模板量.
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RT-qPCR 原理----绝对定量
1.绝对定量
模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小
Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准
曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量
RT-qPCR技术的原理及应用
实时荧光定量PCR 原理
应用
实时荧光定量PCR 原理
应用
实时荧光定量PCR 原理
常 规 PCR技术：
实时原理
对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析
无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测
实时定量PCR技术：
利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每 一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线 的分析对起始模板进行定量分析
非特异性产物
融解曲线分析，出现杂峰 其他产物出现非特异性荧 光，因此定量不准确
SYBR Green 法 ------------PCR反应的建立
反应体系的建立及优化:
1. SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不 易检测
2. Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准 3. MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物
• • • • n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率
实时荧光定量PCR 原理 --------- DNA 产物的荧光标记
非特异性荧光标记：
1、 SYBR Green
特异性荧光标记：
2、TaqMan
实时荧光定量PCR 方法 1 ---------SYBR Green 法
4. 反应Buffer 体系的优化
5. 反应温度和时间参数:由酶和引物决定 6. 其他与常规PCR相同
SYBR Green 法
起始模板的测定
基因型的分析
应用范围
融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规 PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一 引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。
简述RT-PCR的原理及应用
简述RT-PCR的原理及应用1. RT-PCR的原理RT-PCR（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）是一种将RNA转录成DNA并通过聚合酶链式反应（PCR）扩增的技术。
它结合了逆转录反应（RT）和PCR技术，能够从RNA分子中扩增出目标序列的DNA片段。
RT-PCR的原理可以分为以下几个步骤： - 逆转录反应：在逆转录酶（RT酶）的作用下，将RNA模板反转录成单链cDNA（互补DNA）。
- 第一链合成：通过加入一条适配器序列，形成一条新的DNA链，并使其保持单链状态。
- 第二链合成：加入第二个引物，依靠DNA聚合酶进行DNA链的合成。
此时，所得到的双链cDNA与原始RNA分子完全互补。
这样，通过逆转录和扩增两个步骤，我们可以从RNA模板中获得目标序列的DNA片断。
接下来，这些DNA片段可以通过PCR技术进一步扩增，以获取更多目标DNA。
2. RT-PCR的应用RT-PCR技术具有广泛的应用范围，包括以下几个方面：2.1 基因表达分析RT-PCR广泛应用于基因表达分析领域，其敏感性、特异性和快速性使其成为研究基因表达的重要工具。
通过从细胞中提取RNA，然后经过逆转录反应合成cDNA，最后通过扩增PCR得到目标基因的片段，可以定量分析目标基因在不同条件或组织中的表达水平。
2.2 病毒检测与诊断RT-PCR技术在病毒检测和诊断方面具有重要的应用价值。
病毒RNA是RT-PCR的理想模板，通过逆转录和扩增，可以检测病毒的存在和数量。
例如，在COVID-19大流行期间，RT-PCR被广泛用于检测冠状病毒的RNA，以诊断感染者和筛查潜在的传播者。
2.3 遗传疾病筛查RT-PCR也被广泛用于遗传疾病的筛查，特别是单基因遗传病的检测。
通过RT-PCR扩增目标基因的DNA片段，可以鉴定致病基因的突变。
这对于帮助家族中可能患有遗传病的个体进行早期诊断和咨询是非常重要的。
RT-qPCR实验技术方案 20230418
RT-qPCR实验技术方案基本概念荧光定量逆转录PCR (quantitative reverse transcription PCR, RT-qPCR)是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程，并对起始模板进行定量分析的方法。
首先通过采集的样本来提取RNA，然后将提取的RNA通过逆转录酶合成互补DNA (cDNA)。
随后，以cDNA为模板进行qPCR反应，实时采集荧光信号来监控扩增反应过程。
目前RT-qPCR用于多种分子生物学领域，在科研端可用于基因表达量分析、病原体检测、RNA干扰验证，同时也是分子体外诊断的行业金标准，例如在临床疾病诊断、动物检验检疫、食品安全和科学研究等应用场景均有涉及，尤其在新型冠状病毒、肝炎、艾滋病、流感、登革热、感染性腹泻等的检测、诊断和治疗上发挥着重要作用。
RT-qPCR实验方案样本处理样本采集1.避免外源RNase影响外源无处不在RNase是导致RNA降解的主要因素。
采集和实验环境要尽可能整洁，使用的耗材需要用DEPC处理或购买无酶耗材；同时实验人员操作迅速熟练，缩短降解时间2.避免内源RNase影响某些富含RNA内源酶的部位(如脾脏、胸腺) 本身就容易降解，建议在液氮条件下将组织碾碎，且匀浆时使用更多裂解液。
3.根据提取量分装样本取样前先明确一次提取的组织量，取样后按照一次提取的量分管保存，避免二次分管和并管造成的污染和降解。
4.选择高丰度组织部位不同组织部位的RNA丰度不同，需尽量选用高丰度的组织部位，如动物样本的肝脏、脾脏、心脏的RNA丰度可达2-4 μg/mg，植物样本中的叶片、根茎为0.2-0.3 μg/mg。
样本保存保存方式对样本RNA质量有着极大影响，需要根据样本类型选择较为保存方式和操作方法。
一般保存方法都是用RNA组织细胞保存液(ATG #R202)或者Trizol (ATG #201) 低温保存组织细胞，若暂时不抽提RNA，可在低温下适当研磨匀浆后用液氮速冻，适当的匀浆有利于细胞分散充分接触保存液(浸透)，减少大块样本内部RNA降解；血液样本可以适当加入抗凝剂比如柠檬酸钠。
rtqpcr原理
rtqpcr原理RT-qPCR（real-time quantitative polymerase chain reaction）是一种用于检测DNA或RNA的数量的分子生物学技术。
它基于PCR技术，通过测量PCR反应过程中的荧光信号来实时监测DNA或RNA的扩增过程，从而能够准确、快速地定量分析样品中目标基因的表达水平或拷贝数。
本文将详细介绍RT-qPCR的原理及其在科研和临床中的应用。
RT-qPCR的原理主要包括RNA反转录、PCR扩增和荧光信号检测三个步骤。
首先，RNA反转录将RNA转录为cDNA，即反转录过程。
然后，PCR扩增通过DNA聚合酶酶链反应（PCR）使得目标DNA序列在体系中不断复制，从而形成指数级增长。
最后，荧光信号检测通过荧光染料实时监测PCR过程中的DNA合成量，从而得到实时的扩增曲线。
这三个步骤共同构成了RT-qPCR的原理。
RT-qPCR在科研和临床中有着广泛的应用。
在科研领域，RT-qPCR可以用于基因表达分析、病原微生物检测、基因型鉴定等方面。
在基因表达分析中，科研人员可以通过RT-qPCR技术准确地测定目标基因在不同组织或不同处理条件下的表达水平，从而揭示基因在生物学过程中的功能和调控机制。
在病原微生物检测中，RT-qPCR可以快速、灵敏地检测样品中的微生物DNA或RNA，对于临床诊断和疾病监测具有重要意义。
在临床领域，RT-qPCR常被用于病毒载量检测、癌症早期诊断、药物代谢鉴定等方面。
例如，临床医生可以利用RT-qPCR技术监测病毒患者血液中病毒载量的动态变化，指导临床治疗方案的调整。
总之，RT-qPCR作为一种准确、快速、灵敏的分子生物学技术，已经成为科研和临床实验室中不可或缺的工具。
它的原理简单清晰，应用广泛多样，为生命科学领域的研究和临床诊断带来了许多便利和突破。
相信随着技术的不断进步和完善，RT-qPCR在未来会有更加广阔的发展前景。
rt-pcr原理
rt-pcr原理RT-PCR（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）是一种常用的核酸检测技术，广泛应用于病毒检测、基因表达分析等领域。
本文将介绍RT-PCR的原理及其在实验室中的应用。
RT-PCR的原理主要包括逆转录（Reverse Transcription）和聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）两个步骤。
首先是逆转录，即将RNA转录成cDNA。
在这一步骤中，首先需要一种特殊的酶——逆转录酶，它能够将RNA模板上的信息转录成相应的cDNA。
逆转录过程中需要一段RNA引物（primer）作为起始序列，使逆转录酶能够在该位置开始合成cDNA链。
经过逆转录反应后，RNA被转录成了cDNA，为后续的PCR反应提供了模板。
接下来是聚合酶链式反应，即利用DNA聚合酶在适当的温度下，将cDNA模板进行扩增。
PCR反应需要两段DNA引物，它们分别位于所需扩增片段的起始和终止位置。
在PCR反应的循环中，先是将DNA双链解旋，然后引物与模板结合，随后DNA聚合酶开始在引物的引导下合成新的DNA链。
通过多次循环，可以在较短的时间内扩增出大量的目标DNA片段。
RT-PCR技术具有高灵敏度和高特异性的特点，适用于检测病毒、细菌等微生物的核酸。
在病毒检测中，RT-PCR能够对病毒RNA进行逆转录合成cDNA，然后通过PCR反应扩增出目标病毒基因片段，从而实现对病毒的快速检测。
此外，RT-PCR还可以用于分析基因的表达水平，通过检测特定基因的mRNA水平，可以了解该基因在不同组织、不同生理状态下的表达情况，为基因功能研究提供重要信息。
除了基本的RT-PCR技术外，还有一些衍生技术，如实时荧光定量PCR （qPCR）。
qPCR在PCR反应中加入荧光探针，可以实时监测PCR产物的扩增过程，从而获得准确的定量信息。
这种技术在基因表达分析、病毒定量检测等领域有着广泛的应用。
RT-qPCR之原理篇
RT-qPCR之原理篇Hi，⼩伙伴们，本周继续我们的RT之旅，在上期的内容中我们介绍了RT-qPCR的第⼀步——反转录，讲到怎样获得⾼质量的cDNA模板，那么接下来就需要⽤我们获得的模板去做定量PCR，在此之前⼤家要了解什么是定量PCR，定量PCR的原理是什么，只有知道了这些，我们才能较为顺利的去定量。
所以，本期我们将为⼤家着重介绍RT-qPCR中定量的原理，希望对⼤家有所帮助。
我们先来回顾⼀下常规PCR和荧光定量PCR的区别，常规PCR是对PCR的最终产物进⾏定性和半定量分析，最终只能通过跑胶看出结果；荧光定量PCR则是根据荧光信号的变化，实时检测每个循环扩增产物的变化，从⽽达到对初始模板量的定性和定量分析。
那么荧光定量PCR是怎样进⾏的呢？下⾯我们将按照三⽅⾯的原理来逐步解析其⼯作原理：⼀、荧光定量PCR仪的系统原理在定量PCR仪中主要包含三⼤系统，PCR热循环系统、光路系统以及荧光检测系统。
仪器在⼯作过程中，由PCR热循环系统进⾏⽬标序列的扩增，由光路系统对PCR产物的荧光物质进⾏激发，最后由检测系统对激发的荧光进⾏检测统计，最后得到每个循环中产物的扩增量，将其转化为成为扩增曲线，⽤于之后的定性或定量研究。
⼆、荧光定量PCR⼯作的化学原理⽬前最常⽤的荧光定量PCR⽅式主要有两种，⼀是染料法，另⼀个是探针法。
1、染料法以SYBR Green I 染料为例， SYBRGreen I 是⼀种DNA双链⼩沟结合染料，游离时发光极微弱，结合DNA后荧光强度明显增强。
每形成⼀条双链，就有相应数⽬的SYBRGreen I 嵌⼊，并产⽣荧光信号，荧光的强度与体系中双链的浓度成正⽐，从⽽保证了荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步，荧光的强度就代表了体系中双链产物的浓度。
其⼤致的⼯作流程如下图：此种⽅法当然也会有它的优缺点，优点是成本低， SYBRGreen I 试剂价格低，适合初步筛查⽬标基因；缺点是⽆特异性，针对所有双链形式DNA均有荧光基团嵌⼊，给出所有双链DNA的总荧光信号，不能进⾏多重筛查，每个PCR管中只能检测⼀个⽬标基因。