常见SPF级小鼠和大鼠肠道菌群多样性研究
No4第四章实验动物微生物控制
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第四章 实验动物微生物及寄生虫控制
Zhang Bing
4、悉生动物及应用
又称已知菌动物（Animal with Bacteric Flora ）
特点 ：悉生动物和无菌动物一样，实验结果排除了动 物体内不明确的微生物对实验结果的干扰 用途
单一微生物与机体的互相关系
观察多种微生物之间及其与机体之间的互相关系和菌群 失调现象
动物饲养和实验设施要符合最基本的要求
动物仅供作教学、或预备实验时使用。
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第四章 实验动物微生物及寄生虫控制
Zhang Bing
（二）清洁级动物(clean animal CL
除普通动物应排除的病原体外，不携带对动物危害大
和对科学研究干扰大的病原。
如：清洁级小鼠 排除8种细菌、5种病毒、7种寄生虫; 清洁级大鼠
悉生动物:(gnotobiotic animal GN)
在无菌动物中人为地植入已知的一种或数种微生 物的动物被称为悉生动物。
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第四章 实验动物微生物及寄生虫控制
基于16S_rDNA_高通量测序研究电针对腹泻型肠易激综合征大鼠肠道菌群的调节作用
846 环球中医药2023年5月第16卷第5期 Global Traditional Chinese Medicine,May 2023,Vol.16,No.5㊃基础研究㊃基金项目:福建省自然科学基金面上项目(2020J01724);福建省卫生健康中青年骨干人才培养项目(2019⁃ZQN⁃82);福建省科技厅省属公益类科研院所基本科研专项(2021R1003001)作者单位:350122 福州,福建中医药大学针灸学院[王婧雯(硕士研究生)㊁林晟];福建省中医药科学院经络研究所福建省经络感传重点实验室(郑淑霞㊁许金森)作者简介:王婧雯(1995-),2020级在读硕士研究生㊂研究方向:经络感传与针灸的作用机制研究㊂E⁃mail:wjw951201@通信作者:许金森(1963-),硕士,研究员,博士生导师㊂研究方向:经络感传与针灸的作用机制研究㊂E⁃mail:xujinsenjls@基于16S rDNA 高通量测序研究电针对腹泻型肠易激综合征大鼠肠道菌群的调节作用王婧雯 郑淑霞 林晟 许金森【摘要】 目的 采用16S rDNA 高通量测序技术,分析电针足三里对腹泻型肠易激综合征(irritable bowel syndrome⁃diarrhea,IBS⁃D)大鼠肠道菌群物种相对丰度和多样性的影响,探讨电针对IBS⁃D 的作用机制㊂方法 将SD 大鼠随机分为空白组㊁模型组㊁电针组㊂采用束缚联合番泻叶煎剂灌胃法造模,电针组采用电针双侧足三里干预,空白组与模型组不做干预处理㊂干预结束后,检测大鼠内脏敏感性,并取大鼠粪便进行16S rDNA 高通量测序技术检测大鼠肠道菌群㊂结果 (1)与空白组比较,模型组大鼠腹壁回撤反射评分明显升高(P <0.05);经过电针治疗后,在20mmHg 压力下的腹壁回撤反射评分明显降低(P <0.05)㊂(2)与空白组相比,模型组OTU 数目明显降低,电针组接近于空白组㊂(3)与空白组相比,模型组芽孢杆菌纲㊁乳杆菌属㊁真杆菌属等丰度明显降低,拟杆菌纲㊁梭菌纲㊁δ⁃变形杆菌纲㊁毛螺菌属等丰度明显升高,而电针组上述菌纲/属丰度均有所改善㊂(4)三组的Beta 多样性分析结果显示,模型组与空白组的样本明显被区分开,而电针组则在两组之间㊂结论 IBS⁃D 与内脏高敏感性以及肠道菌群结构紊乱有关,电针能调节IBS⁃D 大鼠内脏敏感性以及肠道菌群物种相对丰度,改善菌群多样性㊂【关键词】 16S rDNA 高通量测序; 电针; 腹泻型肠易激综合征; 肠道菌群; 足三里; 内脏敏感性【中图分类号】 R245 【文献标识码】 A doi:10.3969/j.issn.1674⁃1749.2023.05.005Regulatory effect of electropuncture on gut microbiota of rats with IBS⁃D based on 16S rDNA high⁃throughput sequencingWANG Jingwen ,ZHENG Shuxia ,LIN Sheng ,XU JinsenCollege of Acupuncture and Moxibustion ,Fujian University of Traditional Chinese Medicine ,Fuzhou 350122,ChinaCorresponding author :XU Jinsen ,E⁃mail :xujinsenjls@【Abstract 】 Objective To analyze the effect of electroacupuncture at zusanli on the relativeabundance and diversity of gut microbiota in rats with irritable bowel syndrome⁃diarrhea (IBS⁃D)by 16SrDNA high⁃throughput sequencing and explore the mechanism of action of electroacupuncture on IBS⁃D.Methods The SD rats were randomly divided into a blank group,a model group,and anelectroacupuncture group,and IBS⁃D rat model was established by chronic restraint stress combined withsenna.The electroacupuncture group took the double⁃sided zusanli point for electroacupuncture环球中医药2023年5月第16卷第5期 Global Traditional Chinese Medicine,May2023,Vol.16,No.5847 intervention,and the blank group and the model group were not treated with any treatment.After the inter⁃vention,the levels of visceral sensitivity were tested and rat feces were taken for16S rDNA high⁃throughput sequencing technology to detect the gut microbiota of rats.Results (1)Compared with the blank group,The AWR socre of rats in the model group was significantly increased(P<0.05);after electroacupuncture treatment,the AWR score at20mmHg pressure was significantly decreased(P<0.05).(2)Compared withthe blank group,the number of OTU in the model group was decreased significantly,and the electroacupuncture group was close to the blank group.(3)Compared with the blank group,the abundance of Bacilli,Lactobacillus and eubacterium⁃coprostanoligenes_group in the model group was de⁃creased,and the abundance of Bacteroidia,Clostridia,Deltaproteobacteria,and lachnospiraceae_nk4a136_group were significantly increased,while the abundance of the above⁃mentioned class/genus inthe electroacupuncture group was improved.(4)The results of the beta diversity analysis of the threegroups showed that the samples of the model group and the blank group were clearly distinguished,whilethe electroacupuncture group was between the two groups.Conclusion IBS⁃D is associated with high sensitivity of internal organs and disorders in the structural of gut microbiota,and electroacupuncture canregulate the visceral sensitivity and the relative abundance of gut microbiota species in IBS⁃D rats andimprove the diversity of microbiota.【Key words】 16S rDNA high⁃throughput sequencing; Electroacupuncture; Irritable bowel syndrome⁃diarrhea; Gut microbiota; ST36(Zusanli); Visceral sensitivity 腹泻型肠易激综合征(irritable bowel syndrome⁃diarrhea,IBS⁃D)是一种反复发作㊁缠绵不愈的慢性功能性肠病,其在临床上的特征主要是腹泻㊁腹痛或腹部不适,根治较难㊂目前了解到的发病机制有胃肠功能紊乱㊁脑肠轴紊乱㊁内脏高敏感性㊁肠道菌群失调等㊂有研究发现,肠道菌群失调与IBS⁃D的发生发展关系密切,IBS⁃D患者的肠道菌群与正常人相比存在明显差异,常表现为有益菌减少,有害菌增多[1]㊂临床在治疗IBS⁃D时采取了很多方法,然而效果却不尽如人意,针灸以其安全有效简便的优点在众多治疗方法中崭露头角㊂近几年的研究发现,电针不仅可以改善IBS⁃D患者的各项症状[2],降低内脏高敏感性[3⁃4],而且对于改变肠道菌群结构也有一定帮助[5],但是对于其中具体的分子机制仍存在疑惑㊂课题组前期研究已经表明电针对于IBS⁃D大鼠具有良好的治疗效果,能够缓解大鼠症状,且对于辣椒素受体(TRPV1)以及蛋白酶激活受体⁃2(partition defective protein⁃2,PAR⁃2)通路有影响,但具体对大鼠肠道菌群的影响没有做出研究,故本研究拟在前期研究基础上,从肠道菌群角度探讨电针足三里治疗IBS⁃D的机制㊂1 材料与方法1.1 动物选用体质量为(200±20)g雄性SPF级SD大鼠25只,由杭州医学院提供[许可证号:SCXK (浙)2019⁃0002],于福建省中医药科学院实验动物中心饲养㊂饲养条件:室温26℃左右,湿度60%左右,自由饮食,适应性喂养一周后开始实验㊂本实验严格按照‘实验动物管理条例“等文件要求进行㊂1.2 仪器㊁设备R407型小动物呼吸麻醉机(深圳瑞沃德生命科技公司)㊁电针仪(华佗牌SDZ⁃Ⅱ型)㊁0.25×13mm 的毫针(北京汉医医疗器械有限公司)㊂1.3 实验药品和试剂番泻叶饮片(豪州市华鑫中药饮片科技有限公司)㊁异氟烷(瑞沃德生命科技有限公司)㊁0.9%氯化钠注射液(江西科伦药业有限公司)㊂1.4 动物分组及处理按照随机数字表法将大鼠分为正常组8只㊁模型组8只㊁电针组9只㊂正常组不做处理,正常饮水进食;模型组和电针组进行为期两周的造模后,对电针组做电针干预处理,模型组做同等抓取,不做电针处理㊂1.5 模型制备采用慢性束缚应激联合番泻叶灌服法进行造模[6⁃7],具体操作方法:动物实验前10小时禁食不禁水,先给予番泻叶煎剂(0.3g/mL)灌胃给药(10mL/kg),每日1次,连续灌胃14天㊂灌服完番泻叶煎剂后,即用自制铁丝网将大鼠固定1小时,期间限制大鼠活动,每日1次,持续14天㊂848 环球中医药2023年5月第16卷第5期 Global Traditional Chinese Medicine,May2023,Vol.16,No.51.6 干预方法造模结束后,电针组选择双侧 足三里”穴进行针刺干预㊂参照‘实验动物针灸穴位图谱“进行定位,选取位于膝关节后外侧,腓骨小头下约5mm处的 足三里”穴㊂具体方法:采用自制固定器固定大鼠,暴露大鼠足三里的穴区,用0.25mm×13mm毫针直刺,深度5mm,进针后不需要进行手法刺激,连接电针仪进行治疗,设置连续波[8],频率2Hz,电压2~5V,强度以大鼠不嘶叫为宜,电针20分钟,左右足三里交替进行,每日1次,连续5天㊂1.7 内脏敏感性检测检测前,大鼠禁食不禁水18小时,给予异氟烷麻醉各组大鼠后,用自制工具(三通管连接自制球囊㊁血压计㊁针筒)进行检测㊂在球囊上涂充足的液体石蜡后将球囊缓慢插入大鼠肛门约4.5cm处,然后把大鼠放进自制的20cm×8cm×8cm大小的亚克力透明盒中㊂等待大鼠完全清醒后,约30分钟左右检测大鼠的内脏敏感性㊂测量腹壁回撤反射评分(abdominal withdrawa reflex,AWR)时由针筒向球囊内注入空气,使血压计读数短时间内分别达到20㊁40㊁60㊁80mmHg㊂不同容积的压力每个持续20秒,重复3次㊂AWR评分标准[9]:0分,无明显行为变化;1分,大鼠身体不动或仅有简单的头部运动;2分,大鼠腹部肌肉开始收缩;3分,大鼠下腹壁抬离地面或明显收缩变平;4分,大鼠腹壁拱起或伴身体㊁骨盆躬起,臀部抬离地面㊂1.8 样本采集与指标检测干预结束后,大鼠禁食不禁水18小时,用高温烘烤过的手术器械进行操作㊂先将大鼠放入小动物呼吸麻醉机诱导盒中使其吸入异氟烷后至麻醉状态,接着于冰上迅速剪开大鼠的结肠组织,将留存在大鼠肠道内的粪便取出1到2颗装入备好的无酶EP管内,随后置于液氮中保存㊂实验结束后,将取材得到的大鼠粪便采用16S rDNA高通量测序技术进行肠道菌群的检测由北京博奥晶典生物技术有限公司完成㊂基本流程:从样品中提取总基因组DNA,进行16SrDNA区段扩增, PCR产品定量和鉴定,混合和纯化PCR产物,使用无链®DNA PCR样品制备法生成测序文库,测序结果最终进行生物信息分析㊂测序完成后,对测序得到的原始数据进行处理,随后基于有效数据进行OTUs聚类㊂根据OTUs 聚类结果,先做物种注释,接着进行Beta多样性分析,比较样本群落组成的相似性或差异性㊂粪便基因测序以及生物信息分析流程由北京博奥晶典生物技术有限公司提供,根据公司平台生成的数据和图片进行统计分析处理㊂1.9 统计学处理内脏敏感性检测结果采用SPSS23.0统计软件进行数据分析,实验所得结果为计量资料,经检验符合正态分布且方差齐,数据用均数±标准差(x±s)表述,多组比较采用单因素方差分析,采用LSD⁃t检验进行两两比较㊂以P<0.05为差异有统计学意义㊂2 结果2.1 内脏敏感性检测结果由表1可以看出,与空白组相比,模型组大鼠腹壁回撤反射评分明显升高(P<0.05),提示造模成功㊂经过电针治疗后,与模型组相比,在20mmHg的压力下,电针组腹壁回撤反射评分明显降低(P<0.05),而在更大压力下的变化并不明显,说明电针可以有效改善IBS⁃D大鼠的内脏敏感性,对于更大压力变化不明显的原因有待进一步探索㊂2.2 OTU分类韦恩图通过三组样本的OTU分布,对样本的物种分布情况初步判断,如图1所示,空白组OTU个数共有2106,模型组共有1739个,电针组共有2047个OTU 数目;其中模型组与空白组相交叠的OTU数目明显低于电针组与空白组交叠数目㊂说明经过治疗后,电针组总OTU数目以及与空白组交叠数目均有所上升㊂表1 三组大鼠电针后不同压力下腹壁回撤反射评分结果(x±s)组别鼠只20mmHg40mmHg60mmHg80mmHg 空白组80.6675±0.0895 1.9988±0.1257 2.8338±0.0892 3.6675±0.0893模型组8 2.0000±0.0000a 3.0825±0.0540a 3.8750±0.0879a 4.0000±0.0000b电针组9 1.7411±0.2787ab 3.0756±0.1216a 3.8156±0.1125a 4.0000±0.0000b 注:与空白组相比,a P<0.05;与模型组相比,b P<0.05㊂环球中医药2023年5月第16卷第5期 Global Traditional Chinese Medicine,May 2023,Vol.16,No.5849注:K:空白组;M:模型组;D:电针组㊂图1 三组大鼠OTU 分类韦恩图2.3 大鼠粪便菌群测序量分析Shannon 稀释曲线可以用来反应各样本在不同测序数量时的微生物多样性,如图2所示,各组大鼠OTUs 不会随着测序量增加而上升,曲线趋于平坦,说明可以反应该样本绝大多数微生物多样性信息,足够可靠㊂图2 三组大鼠粪便菌群测序量分析Shannon⁃Wiener 图2.4 大鼠粪便菌群物种组成分析根据OTU 聚类结果,分别在纲㊁属㊁种水平上发现,三组的肠道菌群群落结构基本相似,只是构成比有差异㊂通过比较三组大鼠的菌群物种分布情况,说明电针治疗可以改善菌群结构㊂在纲(class)水平上,拟杆菌纲㊁梭菌纲㊁芽孢杆菌纲㊁δ⁃变形杆菌纲四种菌纲丰度相对较高㊂与空白组相比,模型组拟杆菌纲㊁梭菌纲㊁δ⁃变形杆菌纲等均有升高,芽孢杆菌纲则明显降低㊂而电针组的菌群结构则在模型组的基础上有所变化㊂如图3A 所示㊂在属(genus)水平上,三组中排在前六位的菌属主要有乳杆菌属㊁lachnospiraceae_nk4a136_group(毛螺菌属)㊁普雷沃氏菌Ga6A1属㊁Eubacterium _coprostanoligenes_group(真杆菌属)㊁Ruminiclostridium_9㊁Ruminococcaceae_UCG.014等㊂与空白组相比,模型组乳杆菌属㊁真杆菌属明显降低,毛螺菌属㊁普雷沃氏菌Ga6A1属㊁Ruminiclostridium_9㊁Rumi⁃nococcaceae_UCG.014(瘤胃菌属)等明显升高㊂经过电针治疗后,可看出以上菌属丰度均有一定的改善㊂如图3B 所示㊂在种(species)水平上,模型组的菌种结构分布与空白组存在明显差异,其中约氏乳杆菌的占比明显减少,而隶属于灰色部分的其他菌种的占比明显增加,经过电针治疗后有所改善㊂如图3C 所示㊂2.5 大鼠粪便菌群多样性比较Beta 多样性分析用来比较不同样本在物种多样性方面的相似程度㊂采用bray curtis 的算法计算样本间的距离,得到主坐标(PCoA)分析的结果,从图4可看出模型组与空白组明显被区分开(P <0.05),电针组则在两组之间;且模型组㊁空白组的组内集群效果好,电针组较差㊂说明了电针组样本在向空白组靠近,电针可以改善IBS⁃D 大鼠模型的Beta 多样性㊂3 讨论依照自然属性分类,人体常见的几大细菌门主要为拟杆菌门㊁厚壁菌门㊁变形菌门㊁放线菌门等,大多数人肠道菌群中百分之九十九由这四种菌门组成,它们的丰度和构成比例对人们的健康影响极大[10]㊂有研究表明IBS⁃D 患者肠道菌群结构与健康人相比存在失调情况[11⁃12],其肠道微生物在粪菌移植治疗后,会出现菌群丰度增加㊁结构改变的情况[13]㊂近几年,很多学者将肠道菌群作为治疗IBS⁃D 的靶点,得到了较好的效果㊂IBS⁃D 患者的肠道微生物失调总结起来就是有害菌增加㊁有益菌减少[14],那么了解哪些有害菌增加,以及又有哪些有益菌减少是非常有必要的㊂目前,大多研究都认为,厚壁菌纲㊁拟杆菌门等丰度增加,乳杆菌属㊁双歧杆菌等丰度降低会引起IBS⁃D [15⁃17]㊂众所周知,IBS⁃D 患者的典型症状主要是腹痛㊁腹泻㊁腹胀等,这与内脏高敏感性相关[18],曾有学者提出其腹痛症状与肠道菌群结构关系密切,在于肠道菌群会产生能加重腹痛症状的乙酸盐[19];同时,也有人指出腹泻症状与某些菌群密切相关,可能是因为一些肠道850 环球中医药2023年5月第16卷第5期 Global Traditional Chinese Medicine,May 2023,Vol.16,No.5 注:K:空白组;M:模型组;D:电针组㊂图3 三组大鼠菌群物种分布比较图4 基于bray curites 距离的PCoA 分析菌群能够产生影响肠道渗透性的脂多糖[20]㊂因此,通过改善肠道菌群结构紊乱的情况,可以缓解IBS⁃D 的症状㊂本实验通过慢性束缚应激联合番泻叶灌服法构建IBS⁃D 大鼠模型,实验结果证明电针足三里可以通过改善大鼠肠道菌群结构达到治疗大鼠的目的㊂通过分析各组大鼠粪便菌群在不同水平上的物种组成的结果发现,IBS⁃D 大鼠粪便菌群的物种构成与空白组大鼠存在明显差异,这与其他人的研究结果一致[21⁃22]㊂本研究发现,乳杆菌属明显降低,且其中约氏乳杆菌种下降非常明显,乳杆菌属做为有益菌,可以对抗机体致病微生物,改善肠道屏障功能,预防和治疗腹泻㊂此外,本研究还发现模型组的普雷沃氏菌Ga6A1属丰度明显高于其他两组,Prevotellaceae_Ga6A1_group 隶属于普氏菌属,普雷沃氏菌可以加快碳水化合物发酵,诱发内脏超环球中医药2023年5月第16卷第5期 Global Traditional Chinese Medicine,May2023,Vol.16,No.5851敏反应,甚至可能通过增加肠道通透性的方式加剧腹痛腹泻的症状㊂基于此,普雷沃氏菌的增加与内脏高敏感性呈正相关㊂因此,乳杆菌属的降低㊁普雷沃氏菌的增加都可能是IBS⁃D的起病原因㊂本实验通过电针足三里穴发现,IBS⁃D大鼠具有内脏高敏的反应,且证实了其具体的内在机制可能与肠道菌群结构有关;明显可以看出模型组相较空白组而言有降低或增加的肠道微生物,在电针组中或多或少得到了改善㊂本研究证明了高通量测序技术可以满足大鼠肠道菌群的检测需求,为深入研究电针足三里穴治疗IBS⁃D提供了参考思路,但由于受客观条件的影响,并未对实验中改变明显的菌群进行功能预测,未来可进一步研究菌群的功能基因在代谢途径和蛋白功能上的差异和变化㊂参考文献[1] 王菲,高斌.腹泻型肠易激综合征患者的肠道微生态特征[J].临床合理用药杂志,2021,14(8):157⁃158. 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NLRP3敲除小鼠溃疡性结肠炎模型的建立与分析
NLRP3敲除小鼠溃疡性结肠炎模型的建立与分析王珠环;张尔馨;郑沁薇;郝微微【期刊名称】《中国实验动物学报》【年(卷),期】2024(32)2【摘要】目的采用不同浓度DSS及给药时间诱导NLRP3-/-小鼠溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)模型,并分析与评价其优劣性,为UC发病机制的研究和治疗药物研发提供更贴切临床的动物模型。
方法SPF级48只雄性NLRP3-/-小鼠随机分组,每组12只小鼠(空白组、2.5%7 d组、3%7 d组和3%5 d组),采用不同浓度DSS和给药时间相结合诱导UC小鼠模型,观察和评价小鼠的体重、DAI评分、HE 染色、结肠长度及相关指标(IL-6、TNF-α和紧密连接蛋白(ZO-1))的表达水平评价造模的效果。
结果(1)DSS各小组在不同浓度及给药时间均能诱导UC模型;(2)随着浓度梯度增加及给药时间延长,NLRP3-/-小鼠的体重减轻越显著、粪便潜血呈阳性越明显、DAI评分越高,甚者出现死亡;(3)经HE染色发现,NLRP3-/-小鼠肠黏膜屏障组织病理损伤随DSS给药时间增长或浓度增高而加重;(4)采用免疫组织化学方法检测炎症因子及紧密连接蛋白,相对于空白组、模型组的炎症因子(TNF-α及IL-6)的表达水平均有所升高,而紧密连接蛋白水平表达(ZO-1)较空白组有所降低。
结论(1)NLRP3-/-小鼠在2.5%DSS 7 d、3%DSS 7 d和3%DSS 5 d条件下均可诱导UC模型;(2)结合DAI评分、HE染色和相关指标检测以及小鼠生存率,NLRP3-/-小鼠在3%DSS 5 d条件下诱导UC模型更贴切UC临床表现,更有利于后期药物干预。
【总页数】9页(P168-176)【作者】王珠环;张尔馨;郑沁薇;郝微微【作者单位】上海中医药大学附属曙光医院;上海市中医药研究院脾胃病研究所;上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院【正文语种】中文【中图分类】Q95-33【相关文献】1.GOLPH2基因敲除小鼠模型的建立及其基因型分析2.瘦素基因敲除小鼠模型的建立及表型分析3.单核细胞特异性KCNQ1基因条件性敲除小鼠模型的建立及初步分析4.内皮细胞条件性敲除EMCN小鼠模型建立及肿瘤肺转移对比分析5.ARL15基因敲除小鼠模型建立和表型分析因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
《基于高通量测序技术分析两肾一夹高血压大鼠肠道菌群的结构特征》
《基于高通量测序技术分析两肾一夹高血压大鼠肠道菌群的结构特征》一、引言近年来，随着对生物医学的深入研究，肠道菌群与疾病之间的关系逐渐成为研究热点。
高血压作为一种常见的慢性疾病，其发病机制与肠道菌群的关系也逐渐受到关注。
两肾一夹高血压大鼠模型作为一种常用的高血压研究模型，其肠道菌群结构特征的研究对于揭示高血压的发病机制具有重要意义。
本文基于高通量测序技术，对两肾一夹高血压大鼠的肠道菌群结构特征进行了深入研究。
二、材料与方法2.1 实验动物本实验选用两肾一夹高血压大鼠模型作为研究对象，同时设置正常对照组。
2.2 样品采集与处理对实验大鼠进行肠道菌群样本采集，采用无菌操作法收集大鼠肠道内容物，并进行适当处理以备后续实验。
2.3 高通量测序技术采用高通量测序技术对肠道菌群样本进行测序，获取各样本的菌群组成及丰度信息。
三、实验结果3.1 肠道菌群组成分析通过高通量测序技术，我们得到了各样本的菌群组成信息。
两肾一夹高血压大鼠的肠道菌群组成与正常对照组存在明显差异。
其中，厚壁菌门、拟杆菌门等菌群在两组间存在显著差异。
此外，我们还发现了一些与高血压相关的潜在致病菌在高血压组大鼠肠道中丰度较高。
3.2 肠道菌群结构特征分析通过对比两组大鼠的肠道菌群结构，我们发现高血压组大鼠的肠道菌群结构更加复杂，菌群多样性降低，优势菌群更加明显。
这表明高血压可能改变了大鼠肠道菌群的组成和结构。
3.3 肠道菌群与高血压的关系通过进一步分析，我们发现某些特定菌群的丰度与高血压的发生和发展存在一定的相关性。
这些潜在致病菌可能通过影响大鼠的免疫系统、代谢等途径，参与高血压的发病过程。
四、讨论本研究通过高通量测序技术，对两肾一夹高血压大鼠的肠道菌群结构特征进行了深入研究。
结果显示，高血压大鼠的肠道菌群组成和结构与正常大鼠存在明显差异，且某些潜在致病菌的丰度与高血压的发生和发展存在相关性。
这表明肠道菌群可能与高血压的发病机制密切相关。
进一步的研究表明，肠道菌群可能通过影响大鼠的免疫系统、代谢等途径，参与高血压的发病过程。
《基于高通量测序技术分析两肾一夹高血压大鼠肠道菌群的结构特征》
《基于高通量测序技术分析两肾一夹高血压大鼠肠道菌群的结构特征》一、引言近年来，高血压疾病的发病率逐年上升，成为全球性的健康问题。
两肾一夹（2K1C）高血压大鼠模型被广泛用于高血压病的研究。
然而，高血压的发生除了与遗传、环境等因素有关外，肠道菌群也扮演着重要角色。
肠道菌群的结构和功能与宿主健康密切相关，因此，研究两肾一夹高血压大鼠肠道菌群的结构特征具有重要意义。
本文采用高通量测序技术，对两肾一夹高血压大鼠肠道菌群进行分析，以期为高血压病的发病机制及治疗提供新的思路。
二、材料与方法1. 实验动物选用两肾一夹高血压大鼠模型作为研究对象，同时设置正常对照组。
2. 样品采集对两组大鼠进行肠道内容物收集，分别取其结肠部位样品进行后续分析。
3. 高通量测序技术采用高通量测序技术对肠道菌群进行测序，分析各样本的菌群组成及多样性。
三、结果与分析1. 肠道菌群组成通过高通量测序，我们发现两肾一夹高血压大鼠肠道菌群与正常对照组存在显著差异。
在门水平上，两组大鼠肠道菌群主要以厚壁菌门、拟杆菌门为主，但两肾一夹高血压大鼠的菌群组成中，某些特定菌种的比例发生了明显变化。
2. 肠道菌群多样性分析结果显示，两肾一夹高血压大鼠肠道菌群多样性较正常对照组低，表明高血压大鼠肠道菌群结构发生了变化。
3. 关键菌种分析进一步分析发现，两肾一夹高血压大鼠肠道中某些与炎症、代谢等相关的关键菌种丰度发生了改变。
这些关键菌种的改变可能与高血压的发生、发展密切相关。
四、讨论本研究表明，两肾一夹高血压大鼠肠道菌群结构与正常对照组存在显著差异。
这表明肠道菌群可能在高血压的发病过程中发挥了重要作用。
关键菌种的改变可能影响了机体的代谢、免疫等过程，从而促进了高血压的发生。
此外，肠道菌群多样性的降低也可能导致机体对外部环境的适应能力下降，从而加剧了高血压的病情。
五、结论本文通过高通量测序技术分析了两肾一夹高血压大鼠肠道菌群的结构特征，发现高血压大鼠肠道菌群组成和多样性均发生了显著变化。
脾虚模型大鼠肠道菌群分布及时效性研究
脾虚模型大鼠肠道菌群分布及时效性研究一、研究背景随着人们对健康的关注度不断提高，肠道健康逐渐成为研究的热点。
肠道菌群作为肠道生态系统的重要组成部分，其平衡与否直接影响着人体的健康状况。
近年来越来越多的研究发现肠道菌群与多种疾病的发生密切相关，如肥胖、炎症性肠病、自身免疫性疾病等。
因此探讨肠道菌群在疾病发生发展中的作用，对于提高人们的健康水平具有重要意义。
脾虚是中医常见的一种病理状态，表现为脾气虚弱，运化失常导致机体各系统功能失调。
脾虚模型大鼠是一种常用的实验动物模型，用于研究脾虚证候的机制。
然而目前关于脾虚模型大鼠肠道菌群的研究较少，且多为定性研究，缺乏系统性和时效性的分析。
因此本研究旨在通过对脾虚模型大鼠肠道菌群的分布进行动态观察，探讨脾虚证候的发生机制及其与肠道菌群的关系，为进一步揭示脾虚证候的本质提供理论依据和实验支持。
1.脾虚模型大鼠的定义和特点脾虚模型大鼠是一种常见的实验动物模型，主要用于研究脾虚证候的发病机制、病理生理过程以及药物防治等方面。
脾虚模型大鼠的定义主要包括两个方面：一是具有典型的脾虚证候特征，如食欲不振、便溏、乏力等；二是在实验室条件下，通过一系列操作手段模拟脾虚状态，使大鼠出现类似人类脾虚的症状。
脾虚模型大鼠作为一种常用的实验动物模型，具有明确的定义和特点，为研究脾虚证候提供了有力支持。
在未来的研究中，可以通过对脾虚模型大鼠进行深入探讨，揭示脾虚证候的病理生理机制，为临床治疗提供理论依据。
2.肠道菌群与健康的关系肠道菌群是指生活在人体肠道内的微生物群落，包括细菌、真菌、病毒等多种生物。
近年来越来越多的研究发现肠道菌群与人类的健康密切相关，研究表明肠道菌群失调可能导致多种疾病，如肥胖、炎症性肠病、自身免疫性疾病等。
因此维护肠道菌群的平衡对于人类健康具有重要意义。
在脾虚模型大鼠的研究中，肠道菌群的分布和变化也受到了关注。
脾虚模型大鼠是指通过喂养特定食物或药物导致脾脏功能减弱的实验动物。
鼠尾草酸对葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠溃疡性结肠炎的改善作用
鼠尾草酸对葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠溃疡性结肠炎的改善作用焦鑫鑫1，许敏2，吴华1，刘梓萱1，肖俊松2*（1.北京工商大学化学与材料工程学院，北京100048）（2.北京市食品添加剂工程技术研究中心（北京工商大学），北京100048）摘要：研究了鼠尾草酸（CA）对葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的小鼠溃疡性结肠炎（UC）的改善作用。
小鼠自由饮用含3% DSS的蒸馏水，连续7 d造模。
将60只小鼠随机分为5组：空白对照组（CK）、DSS模型组（DSS）、鼠尾草酸低剂量组（CAL）、鼠尾草酸高剂量组（CAH）、美沙拉嗪组（PC）。
通过小鼠体质量变化、疾病活动指数（DAI）评分、结肠组织病理学和肠道通透性变化评估CA对UC小鼠的干预作用。
通过测定结肠组织髓过氧化物酶（MPO）活性、超过氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量、紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的表达及肠道菌群组成的变化探讨可能的影响机制。
与DSS组相比，CA干预降低了UC小鼠的质量损失和DAI评分、改善了结肠组织病理损伤。
同时，CAL和CAH组结肠组织MPO活性显著降低、MDA含量分别降低了13.75%、70.00%（P<0.05），SOD活性分别升高了6.12倍、9.62倍（P<0.05），肠道通透性显著降低、ZO-1和Occludin蛋白的表达得到恢复。
50 mg/kg m b的CA灌胃提高了厚壁菌门和拟杆菌门的丰度比值，恢复了DSS诱导的UC小鼠中Akkermansia等有益菌属的丰度下降，降低了Alistipes等有害菌属的相对丰度。
CA对UC具有良好的改善作用，其机制可能与降低氧化应激水平、保护肠屏障和调控肠道微生物组成有关。
关键词：鼠尾草酸；溃疡性结肠炎；氧化应激；肠道通透性；肠道菌群文章编号：1673-9078(2024)03-18-27 DOI: 10.13982/j.mfst.1673-9078.2024.3.0353Ameliorative Effects of Carnosic Acid on Dextran SulfateSodium-induced Ulcerative Colitis in MiceJIAO Xinxin1, XU Min2, WU Hua1, LIU Zixuan1, XIAO Junsong2*(1.College of Chemistry and Materials Engineering, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China) (2.Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives (Beijing Technology and BusinessUniversity), Beijing 100048, China)Abstract: The ameliorative effects of carnosic acid (CA) on dextran sodium sulfate (DSS)-induced ulcerative colitis (UC) in mice were assessed. Ulcerative colitis was induced by the oral administration of 3% DSS via distilled drinking water引文格式：焦鑫鑫,许敏,吴华,等.鼠尾草酸对葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠溃疡性结肠炎的改善作用[J] .现代食品科技,2024, 40(3):18-27.JIAO Xinxin, XU Min, WU Hua, et al. Ameliorative effects of carnosic acid on dextran sulfate sodium-induced ulcerative colitis in mice [J] . Modern Food Science and Technology, 2024, 40(3): 18-27.收稿日期：2023-03-25基金项目：北京市自然科学基金资助项目（6212002）；北京市教委一般项目（KM202010011010）作者简介：焦鑫鑫（1997-），女，研究生，研究方向：芳香植物的综合利用，E-mail：通讯作者：肖俊松（1980-），男，博士，副教授，研究方向：多酚及其代谢产物对代谢综合症的干预机制，E-mail：18for seven days. A total of 60 mice were randomly divided into five groups: blank control (CK), DSS model (DSS), low-dose carnosic acid (CAL), high-dose carnosic acid (CAH), and mesalazine (PC). The ameliorative effects of CA were evaluated based on body weight, disease activity index (DAI) score, colonic histopathology, and changes in intestinal permeability. To investigate the possible mechanism of CA, the activities of myeloperoxidase (MPO) and superoxide dismutase (SOD), the level of malondialdehyde (MDA), the expression level of tight junction proteins, including ZO-1 and occludin, and the changes in intestinal flora in mice were examined. When the CA and DSS groups were compared, CA intervention was found to reduce weight loss and the DAI score and ameliorate the pathological damage in colonic tissues in UC mice. The MPO activity was also found to significantly decrease in the CA groups. The MDA content in the colon tissue was reduced by 13.75% and 70%, respectively (P<0.05), while the SOD activity increased by 6.12- and 9.62-fold, respectively (P<0.05), in the CAL and CAH groups. Notably, the intestinal permeability was significantly reduced, and the expression levels of ZO-1 and occludin were restored. Gavage of 50 mg/kg CA enhanced the abundance ratios of Firmicutes and Bacteroides and restored the decrease in the abundance of beneficial bacteria, such as Akkermansia,caused by DSS. The relative abundance of detrimental bacteria, such as Alistipes, was also reduced. Overall, CA may mitigate UC by lowering the levels of oxidative stress, protecting the intestinal barrier, and regulating the composition of the intestinal microbial community.Key words: carnosic acid; ulcerative colitis; oxidative stress; intestinal permeability; intestinal flora溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis，UC）是一种以腹部疼痛、体重下降、出血性腹泻、粪便隐血为主要特征的慢性肠道炎症性疾病[1] 。
郑州某高校实验小鼠和实验兔肠道寄生虫调查研究
试验研究20238261郑州某高校实验小鼠和实验兔肠道寄生虫调查研究周春香1，卢 炜2（1.黄河科技学院，河南郑州 450063；2.河南巽丰生物科技有限公司，河南郑州 451161）摘要：实验小鼠和实验兔是各高校和科研单位常见且常使用的实验教学动物，为了解实验动物肠道寄生虫感染情况，采自郑州某高校实验中心实验小鼠和实验兔粪便样本122份（实验小鼠112份，实验兔10份），采用卢戈氏碘液法和饱和蔗糖溶液漂浮法并镜检观察。
结果显示：肠道寄生虫总感染率为41.80%（51/122），检出3种肠道寄生虫感染率分别为阿米巴原虫23.77%（29/122）、球虫15.57%（19/122）和蠕形住肠线虫9.02%（11/122）。
实验兔肠道寄生虫感染率70.00%（7/10），高于实验小鼠的肠道寄生虫感染率38.39%（43/112），实验小鼠感染的优势虫种为阿米巴原虫，实验兔感染的优势虫种为球虫。
调查结果表明：实验小鼠、实验兔都有携带寄生虫的风险，实验动物的原饲养单位要加强饲养管理和提高质量，为保障实验的有效性，科研人员要了解和掌握所采购实验动物的健康状况。
关键词：实验小鼠；实验兔；肠道；寄生虫中图分类号：S858.91 文献标志码：B 文章编号：1003-8655（2023）08-0001-03在生命科学领域，实验小鼠和实验兔作为首选实验动物被广泛应用于临床医学、动物医学和生物学等专业的教学和科研中，并发挥着重要的应用价值。
实验动物携带病原体可能会影响实验结果，特别是科学性研究方面。
有些病原体具有人兽共患性，将严重威胁接触者包括饲养人员、研究人员及教学实习人员的生命健康。
实验小鼠可携带人兽共患肠道寄生虫病已有研究报道，因此实验动物进行肠道寄生虫感染情况调查具有重要公共卫生意义。
为了解实验动物肠道寄生虫的感染情况，随机抽取本实验中心的实验小鼠和实验兔为研究对象，调查其肠道寄生虫的感染情况，为提高实验动物的饲养管理、了解实验动物对健康以及肠道寄生虫病的防治提供科学参考。
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2019年4月第27卷㊀第2期中国实验动物学报ACTA LABORATORIUM ANIMALIS SCIENTIA SINICAApril 2019Vol.27㊀No.2黄树武,闵凡贵,王静,等.常见SPF 级小鼠和大鼠肠道菌群多样性研究[J].中国实验动物学报,2019,27(2):229-235.Huang SW,Min FG,Wang J,et al.Diversity of intestinal flora in commonly used SPF mice and rats [J].Acta Lab Anim Sci Sin,2019,27(2):229-235.Doi:10.3969/j.issn.1005-4847.2019.02.016[基金项目]广东省科技计划项目(2016A030303024,2017B030314171,2017A070702001,2018B030317001)㊂Funded by Science and Technology Planning Project of Guangdong Province (2016A030303024,2017B030314171,2017A070702001,2018B030317001).[作者简介]黄树武(1990 ),男,医学学士,研究方向:实验动物质量监测和微生物学研究㊂Email:hsw2015@ [通信作者]潘金春(1979 ),男,副研究员,研究方向:实验动物质量监测和比较医学研究㊂Email:jcpan@常见SPF 级小鼠和大鼠肠道菌群多样性研究黄树武,闵凡贵,王静,潘金春∗(广东省实验动物监测所,广东省实验动物重点实验室广东广州㊀510663)㊀㊀ʌ摘要ɔ㊀目的㊀研究常见SPF 级小鼠和大鼠的肠道菌群多样性㊂方法㊀分别采集广东地区三家实验动物生产单位的C57BL /6㊁ICR㊁BALB /c 小鼠和Wistar㊁SD 大鼠的盲肠内容物样品,用细菌16S rDNA 通用引物扩增V4-V5区域,采用Illumina Miseq 2ˑ300bp 测序平台进行测序,使用生物信息学方法进行微生物群落分析㊁Alpha 多样性分析与Beta 多样性分析㊂结果㊀对序列去杂优化后OTU 聚类分析,稀释性曲线说明本次测序的数据量合理;实验小鼠和大鼠肠道菌群共分成八个门,其中拟杆菌门(Bacteroidetes )㊁厚壁菌门(Firmicutes )占据主要地位,属水平上主要是拟杆菌属(Bacteroides )㊁Hungatella ㊁副杆状菌属(Parabacteroides )㊁乳酸杆菌属(Lactobacillus )等;样品间差异性分析显示相同设施来源动物的菌群组成相似性较高;Alpha 分析结果显示来源于同种设施的动物物种丰富度相近;Beta 分析显示相同设施动物的肠道菌群差异较小,但品系对肠道菌群差异性有所影响㊂结论㊀不同来源设施的饲养环境是动物肠道菌群多样性的主要影响因素,不同品系对肠道菌群多样性有一定影响㊂ʌ关键词ɔ㊀小鼠;大鼠;肠道菌群;Illumina miseqʌ中图分类号ɔQ95-33㊀㊀ʌ文献标识码ɔA㊀㊀ʌ文章编号ɔ1005-4847(2019)02-0229-07Diversity of intestinal flora in commonly used SPF mice and ratsHUANG Shuwu,MIN Fangui,WANG Jing,PAN Jinchun ∗(Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute,Guangdong Provincial Key Laboratory of Laboratory Animals,Guangzhou 510663,China)Corresponding author:PAN Jinchun.E-mail:jcpan@ʌAbstract ɔ㊀Objective ㊀To study the diversity of intestinal flora in commonly used SPF mice and rats.MethodsThe cecum contents of C57BL /6,ICR,BALB /c mice as well as Wistar and SD rats were collected from three experimentalanimal production units in the Guangdong area.The V4-V5region was amplified using 16S rDNA primers and sequenced by the Illumina Miseq 2x 300bp sequencing platform.Microbial community analysis,alpha diversity analysis,and beta diversity analysis were carried out by bioinformatics.Results ㊀In OTU cluster analysis after sequence removal optimization,the dilution curve indicated that the data quantity of the sequencing was reasonable.The intestinal microflora of mice and rats were divided into eight phyla.Bacteroidetes and Firmicute phyla occupied the main position,mainly in the level of Bacteroides ,followed by the genuses Hungatella and Parabacteroides and then Lactobacillus.Analysis of the differences among the samples showed that the flora composition of animals from the same facility,and that of the same strains from thesame facility was also similar.Alpha analysis showed that the species richness was similar in animals from the same facility,and beta analysis showed little difference in intestinal flora of the same origin animals.Moreover,the strain had an effect on the difference of intestinal flora.Conclusions ㊀The origin is the main factor influencing the diversity of intestinal flora,andthe strain has a certain influence on their diversity.ʌKeywords ɔ㊀mice;rats;intestinal flora;Illumina MiseqConflicts of Interest:The authors declare no conflict of interest.㊀㊀据统计,人体携带的正常微生物达1014个,胃肠道菌群占人体总微生物量的78%[1]㊂胃肠道作为人和动物体最庞大而复杂的生物群落,正常情况下肠道菌群保持着共生和拮抗的关系,从消化㊁营养吸收㊁能量供应㊁脂肪代谢㊁免疫调节㊁药物代谢和毒性等诸多方面影响人和动物的健康状况[2]㊂在实验动物中,以小鼠㊁大鼠为主的啮齿类实验动物占据主要地位,2015年其使用量合计约占实验动物使用总量的74%[3]㊂目前已经有相关研究开展小鼠和大鼠的肠道菌群与心血管疾病㊁代谢性疾病㊁病原感染等疾病的关系[4-5],肠道菌群代谢产物研究,肠道菌群多样性影响因素研究[6]等,但实验大小鼠常用品系肠道微生态情况研究尚不够充分,且研究方法多采用培养法㊁扩增核糖体DNA 限制性分析㊁PCR-DGGE 电泳等传统方法,导致结果差异较大㊂本研究采用新一代Illumina Miseq 测序技术及生物信息学分析手段,对常用的实验小鼠和大鼠开展肠道菌群多样性分析,可以全面㊁平行分析多个样本中的微生物群落信息,从而掌握常用小鼠和大鼠肠道菌群多样性背景,其数据易于分享和比对,解决目前研究中存在的不足,为微生态与相关疾病㊁代谢产物㊁药物筛选和评价等相关研究提供基础性资料,以及在选择肠道微生态研究用模型动物时提供参考依据,对促进生物医学的发展有重要意义㊂1㊀材料与方法1.1㊀材料1.1.1㊀实验动物SPF 级小鼠和大鼠来自广东地区三家实验动物生产单位,三个生产单位分别用代号DJʌ生产许可证号:SCXK(粤)2018-0044ɔ㊁ZYʌ生产许可证号:SCXK(粤)2018-0034ɔ㊁SYʌ生产许可证号:SCXK(粤)2018-0002ɔ表示,动物包括小鼠品系C57BL /6㊁ICR㊁BALB /c 和大鼠品系Wistar㊁SD,具体信息见表1㊂表1㊀SPF 级小鼠和大鼠的信息Table 1㊀Information of the SPF grade laboratory animals品种Breed 品系Strains 性别Sex周龄Week age数量(只)Number来源Source 动物编号Animal number小鼠MouseC57BL /6雄Male 53DJDJ-1㊁DJ-2㊁DJ-3C57BL /6雄Male53ZY ZY-1㊁ZY-2㊁ZY-3ICR雌Female 54DJ DJ-11㊁DJ-12㊁DJ-13㊁DJ-14BALB /c 雌Female 53ZY ZY-4㊁ZY-5㊁ZY-6大鼠RatWistar 雄Male 33ZY ZY-7㊁ZY-8㊁ZY-9SD 雄Male 33ZY ZY-10㊁ZY-11㊁ZY-12SD雌Female33SY SY-1㊁SY-2㊁SY-31.1.2㊀仪器与试剂仪器为FTC-3000TM 实时荧光定量PCR 仪㊂试剂为QIAamp DNA Stool Mini Kit 试剂盒购自QIAGEN 公司;AxyPrepDNA 凝胶回收试剂盒购自Axygen 公司;PCR 反应所用试剂10ˑPCR 缓冲液㊁4x dNTP㊁Taq 酶㊁DL-2000marker㊁蛋白酶K,琼脂糖(电泳级),pMDl9-T 载体㊁T4DNA 连接酶㊁Tax /Plus聚合酶等均购自宝生物工程(大连)有限公司,其余试剂均为进口或国产分析纯㊂1.2㊀方法1.2.1㊀样品采集采用CO 2吸入法对动物进行麻醉,再用颈椎脱臼的方法实施安乐死,动物安乐死后解剖取盲肠内容物约1g,实验操作在广东省实验动物监测所实验设施ʌ使用许可证编号:SYXK(粤)2016-0122ɔ,所有操作符合动物福利和伦理要求㊂1.2.2㊀DNA 文库制备与高通量测序使用QIAamp DNA Stool Mini Kit 试剂盒抽提样品基因组DNA㊂根据细菌16S rDNA V4-V5区域设计特异引物序列,构建目标区域和带有 5 Miseq 接头-barcode-测序引物-特异引物-3 的融合引物㊂采用两步PCR 扩增的方法构建NDA 文库(引物序列见表2),首先采用内侧引物扩增目的片段,后将目的片段使用AxyPrepDNA 凝胶回收试剂盒进行胶回收,而后将回收产物作为模板采用外侧引物进行二次PCR 扩增,并使用FTC-3000TMreal-time PCR 仪进行定量,均一化混匀后文库制备结束,采用Illumina Miseq 2ˑ300bp 高通量测序平台对回收产物进行测序分析㊂表2㊀引物序列Table 2㊀Primer sequences引物名称Primers 引物位置Positions 引物序列(5ᶄ-3ᶄ)Primer sequences(5ᶄ-3ᶄ)16S rDNA V4-V5515F5ᶄ-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3ᶄ926R 5ᶄ-CCGTCAATTCMTTTGAGTTT-3ᶄ内侧引物Inner primerForward 5ᶄ-TTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-特异引物515F-3ᶄReverse 5ᶄ-GAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-特异引物926R-3ᶄ外侧引物Lateral primerForward 5ᶄ-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-barcode -TCTTTCCCTACACGACGCTC -3ᶄReverse 5ᶄ-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-barcode-GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGA-3ᶄ1.2.3㊀生物信息学分析Miseq 测序原始序列用Trimmomatic 和FLASH软件进行质控㊁过滤㊁拼接,再用Mothur 软件处理去除错误序列㊁重复序列以获得优化序列,优化序列用USEARCH 和Mothur 软件进行运算分类单位(operational taxonomic units,OTU)聚类分析(在97%的相似性水平下划分)和物种分类学分析,基于OTU 聚类分析结果,再用Mothur 软件和R 语言进行Alpha 对样品微生物群落的丰度和多样性进行分析;基于分类学信息,可以在各个分类水平上进行群落结构的统计分析,并对样本之间进行Beta 多样性分析,并绘制图表㊂2㊀结果2.1㊀序列优化及统计22个样品进行处理共获得696394个优化序列,平均每个样品31000多个序列㊂这些序列在97%的相似水平下聚类获得OTU,平均每个样品获得151个OTU,但样品间数量差异较大,其中来源DJ 的OTU 平均为253个,来源SY 的OTU 平均为310个,来源ZY 的OTU 数量较少,平均为53个㊂2.2㊀OTU 聚类分析为验证样品的测序深度,从样品中随机抽取一定数量的个体,以个体数与物种数来构建稀释性曲线(rarefaction curves),结果显示所有样品的曲线都趋于平缓(图1),说明本次测序的数据量合理,能够覆盖样本的绝大部分微生物㊂分别用Jaccard 法和Bray-Cutis 法计算样品之间的差异性,并采用UPGAM 法绘制树形图(图2)㊂结果显示,同一设施来源的动物菌群组成相似性较高;且来源于相同设施的同一品系动物之间存在一定相似性,如DJ-1~DJ-3㊁DJ-11~DJ-14㊁SY-1~SY-3等㊂图1㊀稀释性曲线Figure 1㊀Rarefaction curves2.3㊀物种信息分析从门水平聚类分析,小鼠㊁大鼠肠道菌群主要分成拟杆菌门(Bacteroidetes )㊁厚壁菌门(Firmicutes )㊁脱铁杆菌门(Deferribacteres )㊁变形菌门(Proteobacteria )㊁疣微菌门(Verrucomicrobia )㊁无壁菌门(Tenericutes )㊁放线菌门(Actinobacteria )㊁梭杆菌门(Fusobacteria )八个门(图3A),其中拟杆菌门㊁厚壁菌门占据主要地位,二者合计所占比例达到85%以上㊂从来源来看,菌群组成略有差异,来源DJ 的动物缺少放线菌门和梭杆菌门,来源ZY 的动物缺少放线菌门,来源SY 的动物缺少梭杆菌门㊂品种品系也存在差异,小鼠没有放线菌门,大鼠没有梭杆菌门,ICR 小鼠还没有梭杆菌门,Wistar 大鼠还没有放线菌门㊂从聚类结果看,来源SY 和ZY 的相似性较高㊂注:A.矩阵热图(Jaccard法);B.矩阵热图(Bray-Cutis法);C.树状图(Jaccard法);D.树状图(Bray-Cutis法)图2㊀多样本相似性分析Note.A.Matrix heat map(Jaccard).B.Matrix heat map(Bray-Cutis).C.Tree pattern(Jaccard).D.Tree pattern(Bray-Cutis).Figure2㊀Multi-sample similarity analysis从属水平聚类分析,除未分类的细菌外,小鼠㊁大鼠肠道菌群共分成63个属,其中比例最高的是拟杆菌属(Bacteroides),平均约占40%㊂其次较多的属包括Hungatella㊁副杆状菌属(Parabacteroides)㊁乳酸杆菌属(Lactobacillus)㊁Mucispirillum㊁Ruminiclostridium㊁Akkermansia㊁罗氏菌属(Roseburia)等(图3B)㊂从品种㊁品系比较看,主要优势菌属组成都较接近,部分品种㊁品系可能缺乏一些低丰度的菌属,如大鼠未检到巨单胞菌属(Megamonas)㊁Papillibacter㊁Catenibacterium㊁梭菌属(Fusobacterium)等4种菌属,小鼠未检到Romboutsia㊁Butyricimonas㊁Adlercreutzia㊁变形杆菌属(Proteus)㊁Faecalibaculum㊁Allobaculum㊁Arenimonas㊁Gordonibacter等8种菌属㊂从聚类结果看,来源DJ和SY的相似性较高㊂2.4㊀Alpha多样性分析通过单样品的多样性分析(Alpha多样性)可以反映微生物群落的丰度和多样性,估计环境群落的物种丰度和多样性㊂本次样品文库的平均覆盖率(coverage指数)为99.91%,反应本次测序深度能代表样品的真实情况㊂根据香农指数㊁辛普森指数㊁Chao指数和Ace指数结果(图4),总体来看来源于DJ㊁SY的动物物种丰富度差不多,都高于来自ZY图3㊀门(A)与属(B)水平聚类树与柱状图组合分析结果Figure 3㊀Results of cluster tree and histogram combination analysis on phylum(A)and genus(B)levels图4㊀Alpha 多样性分析Figure 4㊀Alpha diversity analysis动物的物种㊂2.5㊀Beta 多样性分析PCoA(principal co-ordinates analysis)是一种研究数据相似性或差异性的可视化方法,通过PCoA分析可以观察个体或群体间的差异㊂本研究的PCoA 分析显示来源于DJ㊁SY㊁ZY 的动物分成了三个群落,且在考虑序列丰度的情况下更为明显(图5)㊂通过Unifrac 分析制作差异性矩阵热图(图6),在不考虑序列丰度的情况下(weighted unifrac),结果显示与上述差异性分析结果略有差异,来源SY 与ZY 的动物菌群差异更小一点;而在考虑序列丰度的情况下(unweighted unifrac),结果显示与上述差异性分析结果一致,相同来源动物的肠道菌群差异较小,同时来源于DJ㊁SY 动物之间肠道菌群的相似性较高,且DJ㊁SY 动物品系也对肠道菌群的相似性有所影响㊂图5㊀PCoA 分析Figure 5㊀PCoAanalysis图6㊀差异性矩阵热图Figure 6㊀Differential matrix heat map3㊀讨论微生物的多样性及结构研究是进行复杂微生态系分析的基础,通过分析实验动物肠道中微生物的丰度与结构,能够揭示实验动物肠道疾病发生与微生物群落之间的关系,从而为预防和治疗肠道疾病提供合理的理论依据[7]㊂早期的研究实验小鼠肠道正常菌群主要菌属有双歧杆菌㊁拟杆菌(类杆菌)㊁肠球菌㊁乳杆菌㊁梭杆菌㊁真杆菌[8]㊂随着高通量测序技术的发展与应用,本研究中实验小鼠㊁大鼠肠道菌群共分成63个属,其中拟杆菌属的含量最高,其次为Hungatella㊁副杆状菌属㊁乳酸杆菌属㊁Mucispirillum㊁Ruminiclostridium㊁Akkermansia㊁罗氏菌属㊂而在人肠道中较为常见的柔嫩梭菌属㊁真杆菌属等菌属在本研究小鼠㊁大鼠肠道中并未发现[9]㊂李伟等[10]对实验小鼠和大鼠肠道总菌群进行多样性比较研究,结果显示种间肠道菌群存在差异,种内雌雄个体之间并没有显著的差异,与本研究中同种品系雌雄间肠道菌群无明显差别一致㊂从门水平看,实验小鼠和大鼠肠道菌群以拟杆菌门和厚壁菌门占据主要地位,其次为脱铁杆菌门㊁变形菌门㊁疣微菌门㊁无壁菌门㊁放线菌门和梭杆菌门;大小鼠与人肠道菌群相比较则存在多数门交叉,总体组成较为接近,都以硬壁菌门和拟杆菌门占据优势;但也有部分门不相同,如小鼠和大鼠有脱铁杆菌门和无壁菌门,人有蓝菌门㊁螺旋体门和Vadin BE97门[11]㊂最近有对树鼩大肠菌群的研究显示,树鼩的肠道菌群同样具有丰富的多样性,以厚壁菌门和变形菌门的丰度最高[12]㊂也有研究表明不同饮食对同一鼠种肠道菌群多样性存在差异,同种饮食干预对不同品系鼠种肠道菌群多样性的影响也存在差异,但不同饮食结构的大小鼠均以拟杆菌门和厚壁菌门为主要优势菌群[6]㊂本研究结果显示,不同来源设施对动物肠道菌群多样性的影响较大,Alpha多样性分析显示ZY的物种丰富度明显低于DJ和SY,Beta多样性分析也说明相同来源动物的菌群组成相似性较高;同时品系对菌群相似性也有所影响,如DJ-1~DJ-3㊁DJ-11~DJ-14㊁SY-1~SY-3品系内相似度较高㊂因此,不同来源设施的饲养环境是动物肠道菌群多样性的主要影响因素,品系对肠道菌群多样性也有一定影响㊂参㊀考㊀文㊀献(References)[1]㊀Eckburg PB,Bik EM,Bernstein CN,et al.Diversity of thehuman intestinal microbial flora[J].Science,2005,308(5728):1635-1638.[2]㊀Ley RE,Peterson DA,Gordon JI.Ecological and evolutionaryforces shaping microbial diversity in the human intestine[J].Cell,2006,124:837-848.[3]㊀叶玉江.中国实验动物资源调查与发展趋势[M].北京:科学出版社,2017:101-105.Ye YJ.Investigation and Development trend of Laboratory AnimalResources in China[M].Beijing:Science Press,2017:101-105.[4]㊀林璋,祖先鹏,谢海胜,等.肠道菌群与人体疾病发病机制的研究进展[J].药学学报,2016,51(6):843-852.Lin Z,Zu XP,Xie HS,et al.Research progress in mechanism ofintestinal microorganisms in human diseases[J].Acta 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